本发明涉及玉米育种领域，特别涉及了与玉米粒宽主效qtl紧密连锁的分子标记及应用。
背景技术：
玉米是重要的粮食与饲料作物，是世界三大作物之一。玉米可用作人类食品、动物饲料、制药以及工业产品。随着世界人口日益增加，如何在有限的耕地面积上生产更多的粮食成为目前的主要问题。玉米是中国第一大作物，在保障国家粮食安全中占有重要地位(李少昆等，2017)。在全国31个省市自治区都有种植，作为粮、饲兼用的作物，对整个国民经济发展有着巨大的影响。
通过对我国不同年代玉米杂交种及其亲本进行分析，发现产量与穗粗、穗粒数、百粒重、叶面积指数和叶向值呈显著正相关，其中百粒重、叶面积指数和叶向值对产量的贡献较大(李从锋，2009)。由于粒重降低无法得到其他产量因素的补偿，因此粒重成为影响产量的主要矛盾，也是目前高产育种的关键性状之一。粒重是玉米产量性状的重要构成因素，被证明与亩产量显著正相关，提高籽粒粒重可有效提高玉米产量(guptaetal.,2006)。分子标记发展经过第一代(rflp为代表)、第二代(ssr为代表)的历程，新一代高通量测序技术和丰富的基因分型技术催生了第三代snp的快速发展。与aflp、rflp、rapd和ssr标记相比，snp(singlenucleotidepolymorphism)即单核苷酸多态性，具有密度高、代表性强、遗传稳定性好和易于实现自动化分析检测等优点，现已广泛应用于植物遗传连锁图谱构建、qtl定位以及生物多态性的研究等方面。同时snp标记的发展促进了遗传图谱、基因定位、关联分析等对植物复杂数量性状的遗传研究。研究证明：多数snp变异与基因功能密切相关，通过基因定位、关联分析可以发掘这些snp位点信息并应用于作物遗传育种。粒宽与粒重显著相关，因此，在全基因水平上挖掘与粒宽相关的遗传标记很有必要，有助于加速高产玉米育种进程。
因鉴于此，特提出此发明。
技术实现要素：
针对传统玉米产量qtl定位所用遗传图谱标记密度较低，qtl定位置信区间较大，难以直接对定位qtl进行候选基因预测等问题，本发明采用gbs简略基因组测序技术，构建玉米高密度snp遗传图谱，结合考察的玉米粒宽表型性状进行全基因组扫描，获得与目标性状qtl紧密连锁的snp标记。
本发明提供了一种与玉米粒宽主效qtl紧密连锁的分子标记，所述玉米粒宽主效qtl包括qkw-2,
qkw-2定位于玉米的第8号染色体上，并与分子标记mk2814紧密连锁，所述mk2814分子标记物理位置为151071300；
该标记的序列如seqidno.1所示。
另一方面，本发明还提供了一种与玉米粒宽主效qtl紧密连锁的分子标记的获得方法，该方法包括以下步骤：
(1)取亲本sg-5和sg7及杂交f2单株叶片，采用ctab法提取全基因组dna；
(2)采用gbs法对步骤(1)中得到的全基因组dna进行测序；
(3)依据测序结果，筛选遗传标记；
(4)采用bin-map的方式，对所有筛选出的遗传标记进行bin的划分，并构建遗传图谱；并将遗传图谱与f2和f2:3的粒宽表型性状结合；
(5)使用winqtlcart2.5软件复合区间作图法进行qtl分析，获得与qtl紧密连锁的snp分子标记。
优选的，步骤(1)中提取的杂交f2的数量为199个。
优选的，步骤(1)中，在提取全基因组dna后，采用1％琼脂糖凝胶检测dna降解及污染情况。
优选的，步骤(1)中，在提取全基因组dna后，采用紫外分光光度计检测dna浓度。
优选的，步骤(4)中，bin-map的方式中窗口的设置为15个，且使用r/qtl进行遗传距离的计算，并使用perl脚本进行画图。
优选的，步骤(5)中，采用的使用winqtlcart2.5软件复合区间作图法的搜索步长为1cm，采用的lod临界值为1000次permutation的阈值。
本发明还提供了上述的与玉米粒宽主效qtl紧密连锁的分子标记在玉米粒宽性状育种中的应用。
本发明提供的与玉米粒宽主效qtl紧密连锁的分子标记及应用，通过对粒宽性状进行全基因组扫描，分析主效qtl所在染色体区域和遗传效应，获得与目标qtl紧密连锁的snp标记，为玉米粒宽性状qtl候选基因预测、克隆及分子标记辅助育种奠定基础。
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1
本发明实施例采用玉米自交系sg-5为母本，玉米自交系sg-7为父本，配置杂交组合，通过南繁加代构建包含199个单株的的f2及f2:3分离群体，并考察记录p1、p2、f2、f2:3的粒宽性状。
采集亲本sg-5和sg-7及杂交f2单株的叶片。作为一种优选的方案，所述叶片取自6叶期幼苗。各叶片样品置于-80℃下进行保存
以叶片为样品采用ctab法提取亲本及f2群组的全基因组dna。ctab法为本领域常规技术手段，在此就不再具体赘述。为了保证提取的全基因组dna可用于后续步骤，采用1％琼脂糖凝胶电泳的方式检测dna降解及污染情况，利用紫外分光光度计采用分光光度法检测dna的浓度，并对不合格的样品进行再次处理，以得到可以应用于后续步骤的全基因组dna。
对得到的各全基因组dna采用gbs法进行测序，并依据测序结果筛选合适的遗传标记。
其中筛选遗传标记按照下述步骤进行。
将测序数据与参考基因组进行比对。其中参考基因组下载地址如下所示：
ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-29/fasta/zea_mays/dna/zea_mays.agpv3.29.dna.toplevel.fa.gz
(1)使用bwa比对软件(参数:mem-t4-k32-m-r)，将亲本和子代cleandata的pereads与参考基因组进行比对；
(2)使用samtools将比对结果进行格式转换，转换成sam/bamfiles；
(3)使用perl脚本统计比对率和覆盖度；
(4)使用samtools对比对结果进行排序(参数：sort)，用于变异检测。群体snp检测：
(1)对bwa比对结果进行过滤：将比对到基因组上唯一位置的reads挑选出来，进行后续分析；
(2)snp检测:采用gatk(-typeunifiedgenotyper)对过滤后的bam文件进行群体snp的检测；
(3)snp过滤：为减少测序错误造成的假阳性snp，亲本与子代要求snp碱基支持数不少于4。
(4)snp相关信息统计：杂合snp数，纯合snp数，杂合snp比率。
亲本间标记开发：
基于玉米亲本基因型检测结果，进行亲本间多态性标记开发。过滤掉亲本信息缺失的位点；筛选父母本都为纯合且亲本间具有多态性的位点(例如：在某个snp位点亲本1基因型为“gg”，亲本2基因型为“aa”，亲本基因型都为纯合，且亲本间基因型不相同)。
本实施例中，通过上述的筛选步骤共获得多态性位点133,936个，其中f2群体可用标记类型为“aa×bb”型，多态性标记68,882个。
对筛选出的所有遗传标记采用bin-map法进行bin的划分，其中窗口设置为15个，并使用r/qtl进行遗传距离的计算，同时使用perl脚本进行画图，以构建遗传图谱，并将遗传图谱与先前考察的亲本和f2及f2:3的粒宽性状结合。
使用winqtlcart2.5软件复合区间作图法进行qtl分析，获得与qtl紧密连锁的snp分子标记，其中，使用winqtlcart2.5软件复合区间作图法的搜索步长为1cm,采用的lod临界值为1000次permutation的阈值。
采用上述方法获得了位于玉米第8号染色体的粒宽主效qtl:qkw-2，同时获得了与qkw-2紧密连锁的snp分子标记mk2814。该分子标记的序列如seqidno.1所示，且该标记的位于玉米第8号染色体151071300位置的碱基为c或t。
所述主效qtlqkw-2的加性效应为0.34-0.43mm，且在snp标记mk2814的位点处基因型为纯合型tt的玉米粒宽显著高于基因型为cc的玉米的粒宽。
实施例2
以玉米自交系sg-5和玉米自交系sg-7配置杂交组合获得f1代种子，以sg-5为受体亲本，sg-7为供体亲本连续回交，并依据实施例1中获得的snp标记mk2814进行分子标记辅助选择，获得bc3f1世代，并选取bc3f1中6个已知粒宽的家系，其中，3个家系为玉米宽粒，3个家系为玉米窄粒。
分别提取上述6个家系的dna基因组，用限制性内切酶msei和haeiii进行双酶切，对dna样本(6叶期幼苗)采用gbs法进行测序，并进行snp分型。
检测实施例1中开发的snp分子标记mk2814，利用该标记可以将玉米的宽粒和窄粒性状区分开来，且粒宽的鉴定结果与分子标记结果一致。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>青岛农业大学
<120>与玉米粒宽主效qtl紧密连锁的分子标记及应用
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1101
<212>dna
<213>玉米(zeamaysl.)
<220>
<221>misc_feature
<222>(551)..(551)
<223>n=cort
<400>1
gacagtctggtggcacaccggacagaccggtgaattatagtcgagcggcctctgagaaac60
ccgaagctgaggagtttggagtcgatcgaccctgggcaccggacactgtcaggtggcaca120
ccggatagtctggtgcgccagtccagggttctcttcggtttcttttgctcctttcttttg180
aaccataacttgtaactttttattggtttgtgttgaacctttagcacctgtagaatatat240
aatctaaagcaaactagttagtccaattatttgtgttgggcatttcaaccaccaaaatca300
ttttaggaaaaggtttgaccctatttccctttcaatcttccagcttgagcccttggatgc360
ataaacctgcaaggtaattaagcttgggtttaaggtacccaactcttgttgggtcctaca420
aggttagttacaacaacttttggaacccaaatacagttcttgtctcccttgcatttagat480
cccaattttctagcaactactttggcatttttacatgaaagtacaaaagaagcattacat540
gcatgataaanagtattaggaccagtgcatgctttcctaggcgcatgagaaacaacatga600
ttacgcctagacctatttctaccataagcatatgtagagctagatgcaaacatagcatga660
agattaaatgcagcagcatcatgagaaagaatattatcataacacctatcattatgagca720
cgactagtaaatttcttatcataaagataggcatagttcttttgagaactactaaccata780
ggagccttccctttctccttgttgagaccagaagtcctttggcttgttaagttcttggtt840
tccttttggaaaccaagtccatccttaattgaggggtgtctaccaacagtgtagacatcc900
ctagcaaattttagtttctcataactttctttgcaagtcttaagttgagcactaagactt960
gcaacatcattgtttaacttagcaatagtagaaacatgttcattacaagcatcaacatca1020
aagtctttacatctattgcaaataacaacatgctctacacatgaactagttacattaatt1080
ttctctagcttagcattcaaa1101