甘蓝型油菜主花序粒重性状的A01染色体主效QTL位点、SNP分子标记及应用的制作方法

本发明涉及分子生物学及油菜育种技术领域，特别涉及甘蓝型油菜主花序粒重性状技术领域，具体是指一种甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点、snp分子标记及应用。

背景技术：

我国食用油的需求量以每年100万吨的速度刚性增长，预计到2025年植物油需求量是现有国内生产能力的3.5-4.0倍，但我国可耕地资源持续减少，因此提高油料作物单产是实现油料总产量增加的根本途径。油菜是我国第一大油料作物，年播种面积超过1亿亩，总产1500万吨以上，菜籽油占我国食用植物油总量的55％以上。目前我国油菜产业的种植面积和产量已连续多年出现下滑，产业安全度逐年下降，我国现已为世界上最大的油料进口国。提高单产水平、降低生产成本以促进农民增收，是促进我国油菜产业发展，保障食用植物油供给安全的核心举措。

目前我国油菜产量水平还较低，影响了农民的种植积极性。2001～2016年我国家审定的冬油菜品种的区试产量水平在2.26～3.75吨/hm²之间，远低于加拿大2013～2015年的新品种试验4.06吨/hm²的产量水平；近年来，我国油菜大田生产单产约1.92吨/hm²，而欧盟为3.12吨/hm²，加拿大为2.24吨/hm²。由于油菜单产偏低，经济效益偏低，已影响了农民种油菜的积极性，制约着油菜产业的正常发展。生产中亟需创制单产水平超过欧盟和加拿大的超高产油菜新品种。

适于全程机械化生产的品种缺乏，导致生产成本居高不下。我国油菜生产总成本高达640元/亩，其中劳动力投入及管理高于360元，占总成本的60～70％；而欧盟和加拿大油菜生产总成本不足300元/亩，其中劳动力投入及管理仅7.5元/亩，占总成本的2.5％左右。传统油菜品种高大倒伏，分枝披散交错，成熟度不一致，角果易裂，给机械化收获造成较大困难，生产中亟需半矮秆抗倒伏、株型紧凑、成熟期一致性好、抗裂角的适合机械化作业的油菜品种，而目前我国油菜机械化育种刚刚起步，生产上还极度缺乏适宜机械化品种。

适宜机械化收获的油菜品种特性之一是适宜密植，密植可以缩短生育期，实现晚播早熟，可以增大叶面积系数和截光率，充分利用光能。油菜密植是通过提高群体有效角果数来实现增产的。随着密度的增加，单株产量降低，主花序的绝对产量也降低，但主花序在产量中的比重却不断提高，从32％增到60％[张宇文,郭亚茹.油菜主序优势及其利用初析[j].西北植物学报,1996,16(6):126-131]。主花序粒重包含主花序角果数、每角粒数和千粒重，由复杂的数量性状控制。

因此，需要提供一种甘蓝型油菜主花序粒重性状的主效qtl位点，其对甘蓝型油菜主花序粒重性状的贡献率高，对甘蓝型油菜主花序粒重的调控起着关键作用，可用作图位克隆和分子标记辅助选择。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术中的缺点，本发明的一个目的在于提供一种甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点，其对甘蓝型油菜主花序粒重性状的贡献率高，对甘蓝型油菜主花序粒重的调控起着关键作用，可用作图位克隆和分子标记辅助选择，适于大规模推广应用。

本发明的另一目的在于提供一种甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点的snp分子标记，其可以检测甘蓝型油菜主花序粒重的大小，可以预测甘蓝型油菜主花序粒重的大小，可以对甘蓝型油菜主花序粒重的大小进行有效选择，还可以用于主花序粒重大的甘蓝型油菜的分子标记辅助育种，加速甘蓝型油菜高产育种的进程，适于大规模推广应用。

本发明的另一目的在于提供一种甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点的snp分子标记，其设计巧妙，检测简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用。

本发明的另一目的在于提供一种甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点的snp分子标记的应用，可以检测甘蓝型油菜主花序粒重的大小，可以预测甘蓝型油菜主花序粒重的大小，可以对甘蓝型油菜主花序粒重的大小进行有效选择，还可以用于主花序粒重大的甘蓝型油菜的分子标记辅助育种，加速甘蓝型油菜高产育种的进程，适于大规模推广应用。

本发明的另一目的在于提供一种甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点的snp分子标记的应用，其设计巧妙，检测简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用。

为达到以上目的，在本发明的第一方面，提供一种甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点，其特点是，所述的甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点位于甘蓝型油菜的a01染色体的第390120位碱基～第531852位碱基之间。

较佳地，所述的甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点对甘蓝型油菜主花序粒重性状的贡献率为13.80％。

较佳地，所述的甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点与第一snp分子标记紧密连锁，所述第一snp分子标记位于所述第390120位碱基，所述第390120位碱基为a或g，该突变导致多态性。

较佳地，所述的甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点与第二snp分子标记紧密连锁，所述第二snp分子标记位于所述第531852位碱基，所述第531852位碱基为g或t，该突变导致多态性。

较佳地，所述的甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点与峰值snp分子标记紧密连锁，所述峰值snp分子标记位于所述的甘蓝型油菜的a01染色体的第399218位碱基，所述第399218位碱基为c或t，该突变导致多态性。

在本发明的第二方面，提供一种甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点的snp分子标记，其特点是，所述snp分子标记位于甘蓝型油菜的a01染色体的第390120位碱基，所述第390120位碱基为a或g，该突变导致多态性。

在本发明的第三方面，提供上述的甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点的snp分子标记在检测甘蓝型油菜主花序粒重的大小、预测甘蓝型油菜主花序粒重的大小、对甘蓝型油菜主花序粒重的大小进行选择或主花序粒重大的甘蓝型油菜的分子标记辅助育种中的应用。

在本发明的第四方面，提供一种甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点的snp分子标记，其特点是，所述snp分子标记位于甘蓝型油菜的a01染色体的第531852位碱基，所述第531852位碱基为g或t，该突变导致多态性。

在本发明的第五方面，提供上述的甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点的snp分子标记在检测甘蓝型油菜主花序粒重的大小、预测甘蓝型油菜主花序粒重的大小、对甘蓝型油菜主花序粒重的大小进行选择或主花序粒重大的甘蓝型油菜的分子标记辅助育种中的应用。

在本发明的第六方面，提供一种甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点的峰值snp分子标记，其特点是，所述峰值snp分子标记位于甘蓝型油菜的a01染色体的第399218位碱基，所述第399218位碱基为c或t，该突变导致多态性。

在本发明的第七方面，提供上述的甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点的峰值snp分子标记在检测甘蓝型油菜主花序粒重的大小、预测甘蓝型油菜主花序粒重的大小、对甘蓝型油菜主花序粒重的大小进行选择或主花序粒重大的甘蓝型油菜的分子标记辅助育种中的应用。

本发明的有益效果主要在于：

1、本发明的甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点位于甘蓝型油菜的a01染色体的第390120位碱基～第531852位碱基之间，其对甘蓝型油菜主花序粒重性状的贡献率高，对甘蓝型油菜主花序粒重的调控起着关键作用，可用作图位克隆和分子标记辅助选择，适于大规模推广应用。

2、本发明的甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点的snp分子标记，包括位于甘蓝型油菜的a01染色体的第390120位碱基的snp分子标记、位于甘蓝型油菜的a01染色体的第531852位碱基的snp分子标记和位于甘蓝型油菜的a01染色体的第399218位碱基的峰值snp分子标记，其可以检测甘蓝型油菜主花序粒重的大小，可以预测甘蓝型油菜主花序粒重的大小，可以对甘蓝型油菜主花序粒重的大小进行有效选择，还可以用于主花序粒重大的甘蓝型油菜的分子标记辅助育种，加速甘蓝型油菜高产育种的进程，适于大规模推广应用。

3、本发明的甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点的snp分子标记，包括位于甘蓝型油菜的a01染色体的第390120位碱基的snp分子标记、位于甘蓝型油菜的a01染色体的第531852位碱基的snp分子标记和位于甘蓝型油菜的a01染色体的第399218位碱基的峰值snp分子标记，其设计巧妙，检测简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用。

4、本发明的甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点的snp分子标记的应用，包括位于甘蓝型油菜的a01染色体的第390120位碱基的snp分子标记的应用、位于甘蓝型油菜的a01染色体的第531852位碱基的snp分子标记的应用和位于甘蓝型油菜的a01染色体的第399218位碱基的峰值snp分子标记的应用，其可以检测甘蓝型油菜主花序粒重的大小，可以预测甘蓝型油菜主花序粒重的大小，可以对甘蓝型油菜主花序粒重的大小进行有效选择，还可以用于主花序粒重大的甘蓝型油菜的分子标记辅助育种，加速甘蓝型油菜高产育种的进程，适于大规模推广应用。

5、本发明的甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点的snp分子标记的应用，包括位于甘蓝型油菜的a01染色体的第390120位碱基的snp分子标记的应用、位于甘蓝型油菜的a01染色体的第531852位碱基的snp分子标记的应用和位于甘蓝型油菜的a01染色体的第399218位碱基的峰值snp分子标记的应用，其设计巧妙，检测简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用。

本发明的这些和其它目的、特点和优势，通过下述的详细说明、附图和权利要求得以充分体现，并可通过所附权利要求中特地指出的手段、产品和它们的组合得以实现。

附图说明

图1是本发明的甘蓝型油菜主花序粒重性状的分布结果的示意图。

图2是本发明中利用甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点的峰值snp分子标记进行等位分析的示意图。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次揭示一种甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点及其snp分子标记，利用其可以有效地对甘蓝型油菜产量进行高效改良。

本发明的甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点，位于甘蓝型油菜的a01染色体的第390120位碱基～第531852位碱基之间。

较佳地，所述的甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点对甘蓝型油菜主花序粒重性状的贡献率为13.80％。

较佳地，所述的甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点与第一snp分子标记紧密连锁，所述第一snp分子标记位于所述第390120位碱基，所述第390120位碱基为a或g，该突变导致多态性。

较佳地，所述的甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点与第二snp分子标记紧密连锁，所述第二snp分子标记位于所述第531852位碱基，所述第531852位碱基为g或t，该突变导致多态性。

较佳地，所述的甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点与峰值snp分子标记紧密连锁，所述峰值snp分子标记位于所述的甘蓝型油菜的a01染色体的第399218位碱基，所述第399218位碱基为c或t，该突变导致多态性。

还提供一种甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点的snp分子标记，位于甘蓝型油菜的a01染色体的第390120位碱基，所述第390120位碱基为a或g，该突变导致多态性。即为上述的第一snp分子标记。

还提供上述的甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点的snp分子标记在检测甘蓝型油菜主花序粒重的大小、预测甘蓝型油菜主花序粒重的大小、对甘蓝型油菜主花序粒重的大小进行选择或主花序粒重大的甘蓝型油菜的分子标记辅助育种中的应用。

还提供一种甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点的snp分子标记，位于甘蓝型油菜的a01染色体的第531852位碱基，所述第531852位碱基为g或t，该突变导致多态性。即为上述的第二snp分子标记。

还提供上述的甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点的snp分子标记在检测甘蓝型油菜主花序粒重的大小、预测甘蓝型油菜主花序粒重的大小、对甘蓝型油菜主花序粒重的大小进行选择或主花序粒重大的甘蓝型油菜的分子标记辅助育种中的应用。

还提供一种甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点的峰值snp分子标记，位于甘蓝型油菜的a01染色体的第399218位碱基，所述第399218位碱基为c或t，该突变导致多态性。

还提供上述的甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点的峰值snp分子标记在检测甘蓝型油菜主花序粒重的大小、预测甘蓝型油菜主花序粒重的大小、对甘蓝型油菜主花序粒重的大小进行选择或主花序粒重大的甘蓝型油菜的分子标记辅助育种中的应用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、甘蓝型油菜主花序粒重性状的表型的测定

1.关联群体的主花序粒重表型的测定

(1)对627份核心种质材料(来自贵州省油菜研究所种子库)的农艺和品质性状进行田间考种分析，选用300个来源世界各地的甘蓝型油菜高世代品系构成自然群体，其中包括98份资源、110份育种材料、92份品种或亲本；按区域划分，其中246份属于国内，54份属于国外来源。在贵阳市开阳县青禾乡和长顺县威远镇油菜基地完成3年2点的表型鉴定。

(2)采用直播定苗,行距40cm,株距25cm，行长3.5m，每个小区4行。试验材料田块四周种植保护行。

(3)主花序粒重：在植株正常成熟后，每个小区测量10株甘蓝型油菜的主花序上所有角果的籽粒重量，单位为g，精确至0.1g。将300份材料的所有环境的表型值平均，结果汇总如下：

表1300份材料的所有环境的主花序粒重表型值的平均值

关联群体的主花序粒重分布结果表明主花序粒重性状表现分布呈连续性分布，呈正态分布，证明主花序粒重性状属于数量性状且存在主效基因位点，见图1所示。

2.关联群体高质量snp数据集的获得

采用ctab方法提取叶片总dna，提取关联群体的每份材料的叶片总dna，具体方法为：

将幼嫩叶片置10％乙醇中漂洗；然后剪取0.1-0.2g叶片放入碾钵中，利用液氮快速碾磨至粉末状，装入2ml离心管中；加入预热dna提取液700μl；混匀后置65℃水浴锅中1h，每10-15min混匀1次；加入700μl混合液(苯酚：氯仿:异戊醇＝25∶24∶1)，轻轻颠倒混匀10min；室温下，10000×g离心15min；吸取上清液至新的2ml离心管中；加入等体积混合液(氯仿∶异戊醇＝24∶1)，颠倒混匀，静置5min，10000×g，离心15min，用枪吸取上清液到新的离心管中；加入2倍体积无水乙醇，混匀后在–20℃静置1h，10000×g，离心10min，弃上清液；再加入500μl预冷的75％乙醇洗涤沉淀，去上清液；经过连续2次洗涤沉淀后，晾干；加入含有2％rnasea溶液100μl，在37℃静置1h后4℃过夜；用等体积混合液(氯仿∶异戊醇＝24∶1)再次抽提dna溶液，颠倒混匀，静置10min，10000×g，离心15或20min，去除rnasea，吸取上清液(约60μl)，再次离心，1min；利用琼脂糖凝胶电泳(0.8％)和紫外分光光度计检测dna浓度、质量及完整性；确定所有dna样品的吸光度260/280比值在1.8-2.0之间。然后将dna样品干冰运输至测序公司(华大基因科技有限公司)，每个材料测序深度大约为9×。

根据上文描述获得高质量dna后，测序公司(华大基因科技有限公司)进行9×覆盖深度的测序后返回的数据，先使用fastqc软件进行测序质量评估，然后对测序序列进行adapter和低质量reads过滤。得到每个材料的双端测序的cleandata，然后使用bwa软件进行mapping以及gatk软件进行变异检测，得到关联群体总的snp数据集后，根据最小等位基因频率≥0.05，缺失率≤0.1和杂合率≤0.15进行snp数据集质量过滤，最终得到高质量的群体snp数据集用于后续分析。

3.全基因组关联分析

使用plink软件对上一步产生的高质量snp数据集的vcf文件进行格式转换，然后使用emmax软件将得到的主花序粒重表型和snp数据集进行全基因关联分析，得到主花序粒重性状每个位点的p值，当p值小于5×10^-7的snp即为显著snp，p值最小的snp即为峰值snp，将峰值snp在群体中的不同等位基因类型将材料进行分组，进行方差分析，组间方差与总方差的比值的百分比，即为该峰值snp的贡献率。

通过分析，将甘蓝型油菜主花序粒重性状的主效qtl位点的区间限定在甘蓝型油菜的a01染色体的第390120位碱基～第531852位碱基之间，对应的snp为chra01_390120(a/g)，chra01_531852(g/t)，峰值snp为：chra01_399218(c/t)，该qtl对甘蓝型油菜主花序粒重性状的贡献率为13.80％(根据峰值snp的不同等位基因类型将材料分组，进行单因素方差分析，组间方差除以总方差的百分比即为贡献率)。

主花序粒重性状的峰值snp为：chra01_399218(c/t)，对应主花序粒重表型分组为：当chra01_399218位置的snp为cc时，材料的平均主花序粒重为5.12g；ct时,材料的平均主花序粒重为4.21g；tt时，材料的平均主花序粒重为3.59g，见图2所示。

主花序粒重性状的其中一个边界snp为：chra01_390120(a/g)，对应主花序粒重表型分组为：当chra01_390120位置的snp为aa时，材料的平均主花序粒重为3.64g；ag时,材料的平均主花序粒重为4.30g；gg时，材料的平均主花序粒重为5.06g，该边界snp的贡献率为11.98％。

主花序粒重性状的另一个边界snp为：chra01_531852(g/t)，对应主花序粒重表型分组为：当chra01_531852位置的snp为gg时，材料的平均主花序粒重为4.99g；gt时,材料的平均主花序粒重为4.46g；tt时，材料的平均主花序粒重为3.23g，该边界snp的贡献率为8.85％。

甘蓝型油菜的全基因组序列已经公布，见http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/。包含chra01_390120(a/g)的前后各400bp序列(共801bp)如seqidno:1所示，包含chra01_531852(g/t)的前后各400bp序列(共801bp)如seqidno:2所示，包含chra01_399218(c/t)的前400bp序列后258bp(共659bp)如seqidno:3所示。本领域技术人员可以采用常规方法根据上述序列设计检测snp位点的特异性引物，从而检测snp位点的基因型，由此可以检测甘蓝型油菜主花序粒重的大小，可以预测甘蓝型油菜主花序粒重的大小，可以对甘蓝型油菜主花序粒重的大小进行有效选择，还可以用于主花序粒重大的甘蓝型油菜的分子标记辅助育种，加速甘蓝型油菜高产育种的进程。

因此，本发明通过主花序粒重性状的表型分析和全基因组重测序，然后进行全基因组关联分析，在甘蓝型油菜第a01号染色体上检测到一个甘蓝型油菜主花序粒重性状的主效qtl位点，对甘蓝型油菜主花序粒重的贡献率为13.80％。该甘蓝型油菜主花序粒重性状的主效qtl位点位于甘蓝型油菜的a01染色体的第390120位碱基～第531852位碱基之间，边界显著snp为chra01_390120(a/g)，chra01_531852(g/t)，峰值snp为chra01_399218(c/t)，根据该与主效qtl位点紧密连锁的snp分子标记，可以用于检测甘蓝型油菜主花序粒重的大小，可以用于预测甘蓝型油菜主花序粒重的大小，可以用于对甘蓝型油菜主花序粒重的大小进行有效选择，还可以用于主花序粒重大的甘蓝型油菜的分子标记辅助育种，加速甘蓝型油菜高产育种的进程。

通过本发明公布的snp分子标记进行分子标记辅助选择，鉴定方法简单，选择效率高，可预测甘蓝型油菜主花序粒重。选择目标明确，不受环境的影响。可在甘蓝型油菜生育早期鉴定出主花序粒重大的甘蓝型油菜单株，淘汰其它单株。

综上，本发明的甘蓝型油菜主花序粒重性状的a01染色体主效qtl位点对甘蓝型油菜主花序粒重性状的贡献率高，对甘蓝型油菜主花序粒重的调控起着关键作用，可用作图位克隆和分子标记辅助选择，适于大规模推广应用。

由此可见，本发明的目的已经完整并有效的予以实现。本发明的功能及结构原理已在实施例中予以展示和说明，在不背离所述原理下，实施方式可作任意修改。所以，本发明包括了基于权利要求精神及权利要求范围的所有变形实施方式。