本申请大体上涉及生物检测领域，具体而言，本申请提供了结合人tn型糖基化muc1的抗体或其抗原结合部分及其用途。本申请提供了新的结合人tn型糖基化muc1的抗体或其抗原结合部分，并提供了包含所述抗体或其抗原结合部分的试剂盒，以及利用所述抗体或其抗原结合部分检测样品中人tn型糖基化muc1水平的方法。
背景技术：
人类肿瘤相关粘蛋白muc1，也被称为癌症抗原15-3(ca15-3)或附膜蛋白，是一种高糖基化、高分子量蛋的白，其糖基化>50％，分子折射度>200kd，其编码序列长1821bp，含有7个外显子，其中第2个外显子含有串联重复序列(variablenumberoftandemrepeats,vntr)，不同人的vntr量从20-125个不等，构成muc1基因的多态性，属于跨膜分子。每个vntr含有60个碱基对，含有5个潜在的o糖基化位点。细胞恶变伴随异常的o糖基化时，原先的o糖链结构变成tn抗原、唾液酸化的tn抗原或者t抗原等肿瘤特异性的糖链结构。由于自身免疫耐受，单独的muc1肽链无法刺激机体产生足够强烈的免疫反应。sorensen等人利用重组糖基转移酶在muc1上添加o糖链结构，合成tn抗原、唾液酸化tn抗原与o糖基化完整的糖肽抗原，5个位点完全o糖基化的完整的糖肽抗原诱发免疫法应最为强烈。tn抗原是t抗原的前体，正常情况下隐蔽地表达粘蛋白，细胞恶变伴随不完全的糖基化时，tn抗原就会暴露并出现较强的免疫反应，可作为潜在肿瘤威胁的标志。
muc1是乳腺癌、肺癌、结肠癌和宫颈癌等大约90％的肿瘤细胞表面的特异性分子标志物。美国国立癌症研究所(nci)认为muc1是目前已发现的75个优先肿瘤相关抗原中排名第二的最有前景的肿瘤特异性靶点。muc1不仅是肿瘤细胞表面的特异性标记物，血液中muc1水平的定量也是临床医生对癌症病人术后随访，监测肿瘤复发、转移的重要指标。然而由于糖基化的多样性以及muc1在血清中的不稳定性，muc1并不是均一多肽。区分健康细胞和肿瘤细胞来源的muc1，需要精确测量临床样本中肿瘤相关的经过特殊糖基化修饰的muc1，因此非常具有挑战性。
目前我国muc1临床检测严重依赖国外企业开发的诊断抗体产品。现有诊断抗体对muc1的识别作用于不同的位点，同时由于最初建立此检测时对这一肿瘤标志物的认识的局限性，因此各诊断产品灵敏度和准确度参次不齐。美国宾夕法尼亚大学carljune教授团队对muc1的最新研究发表于2016年，研究表明tn型糖基化是决定muc1作为肿瘤细胞特异抗原的关键。
因此，专门针对tn型糖基化muc1肽段进行免疫筛选，开发用于临床血液免疫诊断和肿瘤组织免疫化学诊断的抗体产品，不但具备前瞻性和创新性，而且可填补国内高效价tn型糖基化muc1特异性抗体诊断试剂产品的空白，并可以延伸到其他各种对效价特别敏感的诊断项目甚至开发muc1特异性肿瘤靶向药物。
发明概述
第一方面，本申请提供了结合人tn型糖基化muc1的抗体，其包含含hcdr1、hcdr2和hcdr3氨基酸序列的重链可变区和含lcdr1、lcdr2和lcdr3氨基酸序列的轻链可变区，其中
所述hcdr1的氨基酸序列如seqidno:2所示、所述hcdr2的氨基酸序列如seqidno:3所示、所述hcdr3的氨基酸序列如seqidno:4所示、所述lcdr1的氨基酸序列如seqidno:5所示、所述lcdr2的氨基酸序列如seqidno:6所示、所述lcdr3的氨基酸序列如seqidno:7所示；或者
所述hcdr1的氨基酸序列如seqidno:8所示，所述hcdr2的氨基酸序列如seqidno:9所示、所述hcdr3的氨基酸序列如seqidno:10所示、所述lcdr1的氨基酸序列如seqidno:11所示、所述lcdr2的氨基酸序列如seqidno:12所示、所述lcdr3的氨基酸序列如seqidno:13所示；
其中hcdr和lcdr的氨基酸序列根据kabat或chothia定义。
在第一方面的一些实施方案中，所述抗体为全抗体、fab片段、f(ab’)2片段或单链fv片段(scfv)。
在第一方面的一些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体。
在第一方面的一些实施方案中，所述抗体与人tn型糖基化muc1的c末端结合，所述c末端包含seqidno:1所示的氨基酸序列。
在第一方面的一些实施方案中，所述c末端包含由以下氨基酸确定的表位：
seqidno:1的第1-12位所示的氨基酸序列、seqidno:1的第1-16位所示的氨基酸序列、seqidno:1的第17-26位所示的氨基酸序列、seqidno:1的第35-45位所示的氨基酸序列、seqidno:1的第49-68位所示的氨基酸序列或seqidno:1的第69-82位所示的氨基酸序列。
第二方面，本申请提供了用于检测样品中人tn型糖基化muc1水平的试剂盒，其包含第一抗体和/或第二抗体；
其中，所述第一抗体包含含seqidno:2所示的hcdr1，seqidno:3所示的hcdr2和seqidno:4所示的hcdr3的重链可变区，以及含seqidno:5所示的lcdr1，seqidno:6所示的lcdr2和seqidno:7所示的lcdr3的轻链可变区；和/或
所述第二抗体包含含seqidno:8所示的hcdr1，seqidno:9所示的hcdr2和seqidno:10所示的hcdr3的重链可变区，以及含seqidno:11所示的lcdr1，seqidno:12所示的lcdr2和seqidno:13所示的lcdr3的轻链可变区。
在第二方面的一些实施方案中，所述试剂盒还包含标准品、质控品和/或缓冲液。
在第二方面的一些实施方案中，所述试剂盒用于辅助检测或评估肿瘤，例如胰腺癌。
在第二方面的一些实施方案中，所述tn型糖基化muc1的水平与增加的肿瘤风险、诊断肿瘤的存在或肿瘤的严重程度相关联。
在第二方面的一些实施方案中，所述tn型糖基化muc1的水平是监测肿瘤病人术后恢复情况、肿瘤复发或转移的严重程度的重要指标。
第三方面，本申请提供了用于检测样品中人tn型糖基化muc1水平的方法，所述方法包括将第一抗体和第二抗体与所述样品接触；
其中，所述第一抗体包含含seqidno:2所示的hcdr1，seqidno:3所示的hcdr2和seqidno:4所示的hcdr3的重链可变区，以及含seqidno:5所示的lcdr1，seqidno:6所示的lcdr2和seqidno:7所示的lcdr3的轻链可变区；和/或
所述第二抗体包含含seqidno:8所示的hcdr1，seqidno:9所示的hcdr2和seqidno:10所示的hcdr3的重链可变区，以及含seqidno:11所示的lcdr1，seqidno:12所示的lcdr2和seqidno:13所示的lcdr3的轻链可变区。
在第三方面的一些实施方案中，所述接触为同时接触或者相继接触。
在第三方面的一些实施方案中，通过免疫学方法来检测样品中人tn型糖基化muc1的水平。
在第三方面的一些实施方案中，所述免疫学方法选自：酶联免疫吸附测定、免疫荧光、免疫比浊、免疫化学发光、免疫沉淀及它们的组合。
在第二方面或第三方面的一些实施方案中，所述第一抗体或第二抗体用可检测的标记物标记。
在第二方面或第三方面的一些实施方案中，所述可检测的标记物选自：酶、荧光分子、放射性同位素、电化学发光分子、胶乳粒子、金颗粒、可检测的配体及它们的组合。
在第二方面或第三方面的一些实施方案中，所述第一抗体或第二抗体被连接在固定表面上。
在第二方面或第三方面的一些实施方案中，所述固定表面为塑料或玻璃容器，或者载玻片的表面。
第四方面，本申请提供了第一方面所述的抗体，或第二方面所述的试剂盒在检测样品中人tn型糖基化muc1水平中的用途。
在第四方面的一些实施方案中，所述tn型糖基化muc1的水平与增加的肿瘤风险、诊断肿瘤的存在或肿瘤的严重程度相关联。
在第四方面的一些实施方案中，所述tn型糖基化muc1的水平是监测肿瘤病人术后恢复情况、肿瘤复发或转移的严重程度的重要指标。
第五方面，本申请提供了第一方面所述的抗体在制备检测样品中人tn-型糖基化muc1水平的试剂盒中的用途。
在第五方面的一些实施方案中，所述tn型糖基化muc1的水平与增加的肿瘤风险、诊断肿瘤的存在或肿瘤的严重程度相关联。
在第五方面的一些实施方案中，所述tn型糖基化muc1的水平是监测肿瘤病人术后恢复情况、肿瘤复发或转移的严重程度的重要指标。
在上述任一方面的一些实施方案中，所述样品选自：血液、血清、血浆、淋巴液、尿液、胃液、胆汁、唾液、汗液、脊髓液、粪便、肌肉活检组织及它们的组合。
附图说明
图1为采用b细胞体外克隆技术获得本申请的特异性识别tn型糖基化muc1的免疫球蛋白抗体的示意图。
图2为利用本申请的抗体进行的elisa测定所绘制的标准曲线。
图3为临床样本中tn型糖基化muc1水平的分析结果。
图4为本申请抗体与雅培公司抗体结合抗原能力的比对结果。
序列说明
seqidno:1显示人(homosapiens)tn型糖基化muc1的c末端的氨基酸序列。
seqidno:2显示第一抗体的hcdr1的氨基酸序列。
seqidno:3显示第一抗体的hcdr2的氨基酸序列。
seqidno:4显示第一抗体的hcdr3的氨基酸序列。
seqidno:5显示第一抗体的lcdr1的氨基酸序列。
seqidno:6显示第一抗体的lcdr2的氨基酸序列。
seqidno:7显示第一抗体的lcdr3的氨基酸序列。
seqidno:8显示第二抗体的hcdr1的氨基酸序列。
seqidno:9显示第二抗体的hcdr2的氨基酸序列。
seqidno:10显示第二抗体的hcdr3的氨基酸序列。
seqidno:11显示第二抗体的lcdr1的氨基酸序列。
seqidno:12显示第二抗体的lcdr2的氨基酸序列。
seqidno:13显示第二抗体的lcdr3的氨基酸序列。
发明详述
为了实现对人tn型糖基化muc1水平的测定，本申请的发明人通过抗体工程技术得到了新的结合人tn型糖基化muc1的c末端的抗体或其抗原结合部分。在本申请的多个方面，提供了包含所述抗体或其抗原结合部分的检测试剂盒及其用途，利用所述抗体或其抗原结合部分检测人tn型糖基化muc1水平的方法，所述抗体或其抗原结合部分在检测人tn型糖基化muc1水平及在制备检测样品中人tn型糖基化muc1水平的试剂盒中的用途。
除非另外指明，否则本发明的实施将采用本领域常规的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学以及免疫学技术。
除非另外指明，否则本申请中所用的术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。
定义
如本文中所用的术语“乳腺癌”是指发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤，其可在肺、肝、骨、脑等器官发生转移，并破坏其正常组织。乳腺癌的病因尚不清楚，乳腺癌的生存率与发现早晚有很大的关系。据美国癌症学会研究ⅰ型乳腺癌的患者五年生存率达到88％，级别越高，生存率越低，ⅳ型乳腺癌的5年生存率只有15％。
如本文所用的术语“受试者”指活人或非人生物体。本文优选的受试者是人受试者。
如本文所用术语“抗体”，是指能够经由至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区中的抗原识别位点特异性结合到标靶的免疫球蛋白分子。标靶包括但不限于碳水化合物、多聚核苷酸、脂质、多肽等。本文所使用的“抗体”不仅包括完整的(即全长的)抗体，而且还包括其抗原结合片段(例如fab、fab'、f(ab')2、fv)、其变异体、包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、线性抗体、单链抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及任何其他包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的修改配置，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体及共价修饰的抗体。
通常，完整或全长的抗体包含两个重链和两个轻链。每个重链含有重链变异区(vh)和第一、第二及第三恒定区(ch1、ch2及ch3)。每个轻链含有轻链变异区(vl)和恒定区(cl)。全长的抗体可以是任何种类的抗体，例如igd、ige、igg、iga或igm(或上述的子类)，但抗体不需要属于任何特定的类别。根据重链的恒定域的抗体氨基酸序列，可以将免疫球蛋白指定为不同的类别。通常，免疫球蛋白有五种主要的类别：iga、igd、ige、igg及igm，而且这些类别中有几个可以再被进一步区分成子类(同型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1及iga2。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ、以及μ。不同类别的免疫球蛋白的子单元结构和三维结构是公知的。
如本文所用的术语“抗原结合部分”或“抗原结合位点”或“靶结合位点”意指保留与抗原或靶特异性结合的能力的结合蛋白(例如抗体或受体)的一个或多个片段，例如免疫球蛋白可变结构域(例如vh或vl)。抗体的抗原结合部分可为全长抗体的片段。术语“抗原结合部分”包含的结合片段的实例包括但不限于：(i)fab片段，由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段；(ii)f(ab’)2片段，包含在铰链区由二硫桥连接的两个fab片段的二价片段；(iii)由vh和ch1结构域组成的fd片段；(iv)由抗体单臂的vl和vh结构域组成的fv片段；(v)包含单个可变结构域的dab片段；和(vi)分离的互补决定区(cdr)。此外，由分开基因编码的fv的vl和vh可使用重组法通过合成接头进行连接，使其成为单条蛋白质链，其中vh和vl区配对以形成单价分子(称为单链fv(scfv))。此类scfv也包含在术语“抗原结合部分”内，与其他形式的单链抗体例如包含一对串联fv片段(vh-ch1-vh-ch1)的双抗体和“线性抗体”一样，所述一对串联fv片段连同互补轻链多肽一起形成一对抗原结合位点。并非抗原结合部分的每一个氨基酸均可与抗原结合。例如，抗体的可变结构域包含互补决定区(cdr)和构架区(fr)。
如本文所用的术语“cdr”意指在免疫球蛋白可变区序列内的互补决定区。在重链和轻链的可变区中各自存在三个cdr，其对于重链可变区和轻链可变区各自指定为cdr1、cdr2和cdr3。术语“cdr组”指在能够结合抗原的单个可变区中出现的一组三个cdr。这些cdr的确切边界已根据不同的系统进行限定。由kabat描述的系统(kabat等人(1971)ann.nyacad.sci.190:382-391；kabat等人(1987)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第四版usgovt.printingoff.no.165-492；kabat等人(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第五版.nih公开号91-3242)不仅提供了可应用于任何抗体可变区的明确的残基编号系统，还提供了限定三个cdr的精确残基边界。这些cdr可被称为kabatcdr。cdr区的氨基酸残基比抗体的重链和轻链可变区中的其他氨基酸残基更可变(例如高变)。chothia及同事(chothia和lesk(1987)j.mol.biol.196:901-917；chothia等人(1989)nature342:877-883)发现kabatcdr内的某些亚部分采取几乎相同的肽主链构象，尽管在氨基酸序列水平上具有大的多样性。这些亚部分被指定为l1、l2和l3或h1、h2和h3，其中“l”和“h”分别指定轻链和重链区。这些区可被称为chothiacdr，其具有与kabatcdr重叠的边界。限定与kabatcdr重叠的cdr的其他边界已由padlan(1995)fasebj.9:133-139和maccallum(1996)j.mol.biol.262(5):732-45描述。另外其他cdr边界定义可能不严格遵循本文系统之一，但仍与kabatcdr重叠。本文的抗体或其抗原结合部分可利用根据这些系统中的任一个限定的cdr。
对于给定抗体的可变区序列，可以通过多种方式分析可变区序列的中cdr序列，例如可以利用在线软件abysis确定(http://www.abysis.org/)。
如本文所用术语“特异性结合”，是指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体至抗原表位的结合。
如本文所用术语“单克隆抗体”指由基本同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能在少量个体中存在自然发生的突变以外，组成群体的各个抗体是相同的。本文所述单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来源于具体物种或属于具体抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而重链和/或轻链的余下部分与来源于另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，并且还包括这样的抗体的片段，只要它们能表现出所期望的生物学活性(美国专利号4,816,567；和morrison等人，proc.natl.acad.sci.usa81:6851-6855(1984)。
muc1(genbank登录号：nc_000001.11(基因)和np_001018017.1(蛋白质))主要存在于某些上皮性组织和器官中，它本身的表达具有组织特异性，主要表达于乳腺等上皮组织，特别是在所有正常及癌变乳腺中均表达，而在间叶组织来源的淋巴结中不表达，因此可做为某些上皮肿瘤发生淋巴结转移的有效标志物。癌变后，muc1表达增强，结构发生糖基化改变，尤其在乳腺癌中高度异常表达，形成tn型糖基化muc1，由于其特异性高于组织多肽抗原，敏感性高于癌胚抗原(cea)，所以对乳腺癌的诊断具有较高的临床诊断应用价值。
蛋白糖基化的启动是从聚糖共价联接到天冬酰胺残基(n-连接)、或者联接到丝氨酸或苏氨酸残基(o-连接)而开始的。其中，o连接的糖基化，是n-乙酰半乳糖胺(galnac)在大约20种人多肽半乳糖胺转移酶(半乳糖胺-ts)催化下，联接到丝氨酸或苏氨酸残基而形成的。在正常细胞中，附着于蛋白质骨架的galnac残基在t合酶的作用下，进一步延伸，形成核心1结构(半乳糖-galnac-a-丝氨酸/苏氨酸)。在肿瘤细胞表面，最常见的异常糖基化形式是tn(galnaca1-o-ser/thr)和唾液酸化tn(stn)(neuaca2-6-galnaca1-o-ser/thr)。而tn的富集主要是由于正常细胞的糖链合成时所必须的伴侣蛋白cosmc在肿瘤细胞发生突变、或者表观遗传学导致的基因沉默，最终影响了t合成酶活性丧失的缘故。tn异常糖基化形式在肿瘤细胞表面的muc1蛋白上非常常见。但在健康个体上，不会有tn抗原的表达，而且人体有天然的抗tn的igm抗体。
糖蛋白糖修饰在癌症诊断和治疗上的应用近年来成为热点。糖蛋白由于糖基化的多样性，用糖蛋白免疫获得的抗体其对应的抗原决定簇，在没有抗体抗原复合物结构的情况下，难以确定。muc1不仅是糖蛋白，其分子量还比较大，在血清中可以预见以各种糖基化以及各种降解中间产物，不同构型等呈现不均一态。确立以肿瘤抗原性直接密切相关的muc1糖基化位点和形式，用来作为诊断指标，制备对应的单克隆抗体，无疑是提高muc1诊断灵敏度和特异性的关键。
tn型糖基化muc1已显示在细胞癌变过程中分泌量急剧升高，并引发严重免疫反应。王立顺等人用包含vntr的探针试验表明muc1mrna在正常组织中不表达或低度表达，但在腺癌中表达明显增强，故可作为乳腺癌诊断和治疗的靶点。张立新等人用muc1免疫放射分析法(irma)研究表明muc1血清水平与肿瘤恶性程度呈正相关，对于乳腺癌诊断具有重要参考价值。mensdorf等人研究认为，用muc1核心肽来免疫可制造第二代抗体。muc1牵涉诸如乳腺癌、肿瘤和腺癌类疾病，主要对乳腺癌有重要的辅助诊断作用，但因特异性有限，导致现有诊断抗体对muc1的识别作用于不同的位点，同时由于最初建立此检测时对这一肿瘤标志物的认识的局限性，因此各诊断产品灵敏度和准确度都参次不齐。美国宾夕法尼亚大学carljune教授团队对muc1的最新研究发表于2016年的论文表明其tn型糖基化是决定muc1作为肿瘤细胞特异抗原的关键。这一发现奠定了本发明的理论基础。
人tn型糖基化muc1包含特定的c末端结构域，其包含如下氨基酸序列：
mtpgtqspffllllltvltvvtgsghasstpggeketsatqrssvpssteknafnssledpstdyyqelqrdisemflqiyk(seqidno:1)。
本申请的发明人发现，通过使用本文中所公开的抗体，并结合本领域内公知的免疫测定法(例如elisa)，能够可靠地且可重复地检测出样品中的tn型糖基化muc1的水平，并将其与受试者中例如乳腺癌的存在，严重程度和分期等相关联。
示例性的c末端表位包括但不限于：
mtpgtqspffll(seqidno:1的第1-12位所示的氨基酸序列)；
mtpgtqspfflllllt(seqidno:1的第1-16位所示的氨基酸序列)；
vltvvtgsgh(seqidno:1的第17-26位所示的氨基酸序列)；
ketsatqrssv(seqidno:1的第35-45位所示的氨基酸序列)；
eknafnssledpstdyyqe(seqidno:1的第49-68位所示的氨基酸序列)；
lqrdisemflqiyk(seqidno:1的第69-82位所示的氨基酸序列)。
其中字母表示标准氨基酸代码。虽然这些氨基酸序列描述了线性表位，但也可使用由n端的二级和三级结构产生的并且包含来自序列非连续的各段的氨基酸的表位。
第一方面，本申请提供了结合人tn型糖基化muc1的抗体，其包含含hcdr1、hcdr2和hcdr3氨基酸序列的重链可变区和含lcdr1、lcdr2和lcdr3氨基酸序列的轻链可变区，其中
所述hcdr1的氨基酸序列如seqidno:2所示、所述hcdr2的氨基酸序列如seqidno:3所示、所述hcdr3的氨基酸序列如seqidno:4所示、所述lcdr1的氨基酸序列如seqidno:5所示、所述lcdr2的氨基酸序列如seqidno:6所示、所述lcdr3的氨基酸序列如seqidno:7所示；或者
所述hcdr1的氨基酸序列如seqidno:8所示，所述hcdr2的氨基酸序列如seqidno:9所示、所述hcdr3的氨基酸序列如seqidno:10所示、所述lcdr1的氨基酸序列如seqidno:11所示、所述lcdr2的氨基酸序列如seqidno:12所示、所述lcdr3的氨基酸序列如seqidno:13所示；
其中hcdr和lcdr的氨基酸序列根据kabat或chothia定义。
在第一方面的一些实施方案中，所述抗体为全抗体、fab片段、f(ab’)2片段或单链fv片段(scfv)。
在第一方面的一些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体。
在第一方面的一些具体实施方案中，所述抗体为兔单克隆抗体。
在第一方面的一些实施方案中，所述抗体与人tn型糖基化muc1的c末端结合，所述c末端包含seqidno:1所示的氨基酸序列。
在第一方面的一些实施方案中，所述c末端包含由以下氨基酸确定的表位：seqidno:1的第1-12位所示的氨基酸序列、seqidno:1的第1-16位所示的氨基酸序列、seqidno:1的第17-26位所示的氨基酸序列、seqidno:1的第35-45位所示的氨基酸序列、seqidno:1的第49-68位所示的氨基酸序列或seqidno:1的第69-82位所示的氨基酸序列。
第二方面，本申请提供了用于检测样品中人tn型糖基化muc1水平的试剂盒，其包含第一抗体和/或第二抗体；
其中，所述第一抗体包含含seqidno:2所示的hcdr1，seqidno:3所示的hcdr2和seqidno:4所示的hcdr3的重链可变区，以含seqidno:5所示的lcdr1，seqidno:6所示的lcdr2和seqidno:7所示的lcdr3的轻链可变区；和/或
所述第二抗体包含含seqidno:8所示的hcdr1，seqidno:9所示的hcdr2和seqidno:10所示的hcdr3的重链可变区，以及含seqidno:11所示的lcdr1，seqidno:12所示的lcdr2和seqidno:13所示的lcdr3的轻链可变区。
在第二方面的一些实施方案中，所述试剂盒还包含标准品、质控品和/或缓冲液。
在第二方面的一些具体实施方案中，所述标准品为来自人血清的天然癌抗原15-3。
在第二方面的一些具体实施方案中，所述质控品为来自人血清的天然癌抗原15-3的阴性和阳性质控品。
在第二方面的一些具体实施方案中，所述缓冲液为添加了0.1％tritonx-100的ph7.2的pbs缓冲液。
在第二方面的一些具体实施方案中，所述试剂盒用于辅助检测或评估肿瘤，例如胰腺癌。
在第二方面的一些实施方案中，所述tn型糖基化muc1的水平与增加的肿瘤风险、诊断肿瘤的存在或肿瘤的严重程度相关联。
在第二方面的一些实施方案中，所述tn型糖基化muc1的水平是监测肿瘤病人术后恢复情况、肿瘤复发或转移的严重程度的重要指标。
在第二方面的一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于将样品与抗体混合的容器。此类容器可适合用于能够检测由检测单克隆抗体产生的信号的检测仪器。
在第二方面的一些实施方案中，试剂盒可额外地包含以下的一个或多个：(1)使用试剂盒测定tn-型糖基化muc1的水平的说明书；(2)一种被可检测的标记物标记的单克隆抗体或其抗原结合部分；和(3)在其上固定任一抗体或其抗原结合部分的固相。如果未提供标记的抗体，那么可用可检测的标记物例如化学发光部分、酶促部分、荧光部分或放射性部分标记抗体本身。
第三方面，本申请提供了用于检测样品中人tn型糖基化muc1水平的方法，所述方法包括将第一抗体和第二抗体与所述样品接触；
其中，所述第一抗体包含含seqidno:2所示的hcdr1，seqidno:3所示的hcdr2和seqidno:4所示的hcdr3的重链可变区，以及含seqidno:5所示的lcdr1，seqidno:6所示的lcdr2和seqidno:7所示的lcdr3的轻链可变区；和/或
所述第二抗体包含含seqidno:8所示的hcdr1，seqidno:9所示的hcdr2和seqidno:10所示的hcdr3的重链可变区，以及含seqidno:11所示的lcdr1，seqidno:12所示的lcdr2和seqidno:13所示的lcdr3的轻链可变区。
在第三方面的一些实施方案中，通过免疫学方法来检测样品中人tn型糖基化muc1的水平。
在第三方面的一些实施方案中，所述免疫学方法选自：酶联免疫吸附测定、免疫荧光、免疫比浊、免疫化学发光、免疫沉淀及它们的组合。
在第三方面的一些实施方案中，可使用能结合人tn型糖基化muc1的c末端部分的抗体或其抗原结合部分来定量样品中tn型糖基化muc1的水平。根据本申请，可以利用上文所述的抗体或其抗原结合部分，通过免疫学方法来检测tn型糖基化muc1的水平。例如，可以使用“夹心”测定法检测和定量tn型糖基化muc1。在该方法中，通常，一个抗体被固定在固体表面上，以便结合并且捕获tn型糖基化muc1，该抗体因而在本文中称为捕获抗体。另一个抗体被例如荧光基团、酶或有色颗粒可检测地标记，以便其与tn型糖基化muc1-复合物的结合表示tn型糖基化muc1已被捕获。信号的强度与样品中tn型糖基化muc1的浓度成比例。因此另一个抗体在本文中也称为检测抗体或标记抗体。
此类测定方法可称为双位点免疫测定法、“夹心”法或(当抗体是粘合剂时)“夹心免疫测定”。如本领域内已知的，可将捕获和检测抗体同时或相继地与测试样品接触。序贯法(sequentialmethod)，有时称为“正向(forward)”法，可通过将捕获抗体与样品一起温育和此后在预定的时间上加入标记的检测抗体来完成。可选地，首先可将标记的检测抗体与样品一起温育，然后可将样品与捕获抗体接触(有时称为“反向”法)。此类测定可以以本领域技术人员已知的许多特定形式来执行，包括通过不同的高通量临床实验室分析仪的使用或利用重点照护检验(pointofcare)或家用测试设备来执行。
最常用的酶免疫测定是“酶联免疫吸附测定(elisa)”。elisa是使用抗体的标记(例如，酶连接的)形式检测和测量抗原的浓度的技术。存在本领域技术人员公知的不同elisa形式。本领域内已知的用于elisa的标准技术描述于“methodsinimmunodiagnosis”，第2版，roseandbigazzi，eds.johnwiley&sons，1980；campbell等人，“methodsandimmunology”，w.a.benjamin，inc.，1964；和oelleric，m.(1984，j.clin.chem.clin.biochem.22：895-904中。
在“夹心elisa”中，将抗体(例如，抗tn型糖基化muc1)连接至固相(即，微量滴定板)并且与含有抗原(例如，tn型糖基化muc1)的生物样品接触。然后洗涤固相以除去未结合的抗原。然后将标记的抗体(例如，酶连接的)与结合抗原结合，从而形成抗体-抗原-抗体夹心。可被连接至抗体的酶的实例是碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、荧光素酶、尿素酶和β-半乳糖苷酶。酶联抗体与底物反应产生可被测量的显色反应产物。该测量可用于例如通过将测量值与tn型糖基化muc1标准曲线相比较来推导存在于样品中的tn型糖基化muc1的浓度。
免疫荧光法是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光，可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
化学发光免疫分析(chemiluminescenceimmunoassay,clia)是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。化学发光免疫分析用化学发光剂直接标记抗原或抗体进行免疫分析。常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物(acridiniumester,ae)，是有效的发光标记物，其通过起动发光试剂作用而发光，强烈的直接发光在一秒钟内完成，为快速的闪烁发光。吖啶酯作为标记物用于免疫分析，其化学反应简单、快速、无须催化剂，检测小分子抗原采用竞争法，大分子抗原则采用夹心法，非特异性结合少，本底低；与大分子的结合不会减小所产生的光量，从而增加灵敏度。
免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与样品中相应的蛋白结合后，再与蛋白a/g(proteina/g)或二抗偶联的琼脂糖或琼脂糖珠孵育，通过离心得到珠-蛋白a/g或二抗-抗体-目的蛋白复合物，沉淀经过洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离，离心收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。
在第二方面或第三方面的一些实施方案中，所述第一抗体或第二抗体用可检测的标记物标记。
在第二方面或第三方面的一些实施方案中，本申请的试剂盒以及检测方法中使用的标记物可选自本领域内通常已知的任意标记物。优选标记物是允许更精确定量的标记物。标记物的实例包括但不限于荧光部分、酶、电化学活性种类、放射性同位素、化学发光分子、胶乳粒子或金颗粒、可检测的配体等。
在第二方面或第三方面的一些实施方案中，标记物是酶或荧光分子。用于将标记物附着至抗体的方法在本领域内是公知的，并且包括共价和非共价连接。
在第二方面或第三方面的一些实施方案中，可用荧光化合物标记抗体。当将荧光标记的抗体暴露于适当波长的光时，则可通过发射的荧光检测其存在。其中最常用的荧光标记化合物是cy3和cy5(花青染料家族的水溶性荧光染料-“cy”染料)、异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺。
在第二方面或第三方面的一些实施方案中，通过将抗体连接至酶来可检测地标记检测抗体。从而所述酶在与其底物接触时将与底物反应，这种反应可以例如通过分光光度计测量法、荧光测定法或目测法检测。可用于可检测地标记本发明的抗体的酶包括但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-v-类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿素酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。
还可使用放射性标记的抗体来实现检测。然后可通过使用放射免疫测定法检测抗体。可利用此类方法如γ计数器或闪烁计数器的使用或利用放射自显影术来检测放射性同位素。对于本申请的目的特别有用的同位素是3h、131i、35s、14c，和优选的125i。
还可通过将抗体偶联至化学发光部分来可检测地标记抗体。然后通过检测化学反应过程中产生的发光的存在来测定化学发光抗体的存在。特别有用的化学发光标记化合物的实例是鲁米诺，萤光素、异氨基苯二酰肼、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
在第二方面或第三方面的一些实施方案中，所述可被连接至抗体的酶的实例包括但不限于碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、荧光素酶、尿素酶和β-半乳糖苷酶。
在第二方面或第三方面的一些具体实施方案中，所述酶为辣根过氧化物酶。
在第二方面或第三方面的一些实施方案中，所述第一抗体或第二抗体被连接在固定表面上。
在第二方面或第三方面的一些实施方案中，所述固定表面为塑料或玻璃容器，或者载玻片的表面。
在第二方面或第三方面的一些实施方案中，将第一抗体和第二抗体中的一种用作捕获抗体，并被固定在固体表面上以用于捕获tn型糖基化muc1。将第一抗体和第二抗体中的另一种用作检测抗体，并与可检测的标记物连接。
第四方面，本申请提供了第一方面所述的抗体，或第二方面所述的试剂盒在检测样品中人tn型糖基化muc1水平中的用途。
在第四方面的一些实施方案中，所述tn型糖基化muc1的水平与增加的肿瘤风险、诊断肿瘤的存在或肿瘤的严重程度相关联。
在第四方面的一些实施方案中，所述tn型糖基化muc1的水平是监测肿瘤病人术后恢复情况、肿瘤复发或转移的严重程度的重要指标。
第五方面，本申请提供了第一方面所述的抗体在制备检测样品中人tn型糖基化muc1水平的试剂盒中的用途。
在第五方面的一些实施方案中，所述tn型糖基化muc1的水平与增加的肿瘤风险、诊断肿瘤的存在或肿瘤的严重程度相关联。
在第五方面的一些实施方案中，所述tn型糖基化muc1的水平是监测肿瘤病人术后恢复情况、肿瘤复发或转移的严重程度的重要指标。
在上述任一方面的一些实施方案中，用于tn型糖基化muc1的检测的测试样品可以是任何体液或组织样品，包括但不限于血液、血清、血浆或淋巴以及次优选尿、胃汁、胆汁、唾液、汗液和脊髓液、粪便或肌肉活检组织。
在上述任一方面的一些实施方案中，所述样品是血液样品。
在上述任一方面的一些实施方案中，所述样品是血浆样品。
在上述任一方面的一些实施方案中，所述样品血清样品。
在上述任一方面的一些实施方案中，体液可以是经过处理的(例如血清)或未经处理的。从受试者获得体液的方法对于本领域技术人员来说是已知的。
实施例
提供以下实施例仅仅是对本申请的一些实施方案进行举例说明，没有任何限制的目的或性质。此外，如没有特别说明，实施例中的方法将按照本领域的常规方案进行。
实施例1：兔单克隆抗体的获得
将人tn型糖基化muc1免疫兔子获取表达抗体的b淋巴细胞，采用b细胞体外克隆技术获得特异性识别tn型糖基化muc1的免疫球蛋白抗体，具体方法如图1所示。
将编码人muc1c末端的82个氨基酸(seqidno:1)的cdna克隆到pet28载体上，并将该载体转化进bl21细菌中。然后进行分离纯化以获得6mg人重组muc1蛋白，经过糖基转移酶处理之后，完成tn型糖基化，并将其与完全弗氏免疫佐剂以1:1体积比混合，然后对2月龄1.5公斤左右的新西兰大白兔进行4次皮下免疫注射加一次腹腔加强免疫。每一次免疫注射间隔3周，最后一次皮下注射后对兔子血液的免疫效价进行elisa分析。简言之，用上述人重组半乳糖凝集素包被96孔elisa板，检测梯度稀释的兔子血清(1:500、1:2000、1:8000、1:32000和1:128000)。
取效价达到1:32000的兔子的血液，1200rpm离心5分钟后用红细胞裂解液(购自biolegend)去除红细胞。对剩下的白细胞采用流式细胞分选技术，用抗cd19、抗igm和抗iga抗体(购自biolegend)标记白细胞，筛选出cd19阳性，igm阴性和iga阴性的兔子b记忆细胞。将每个b细胞培养于384孔微量滴定板的一个孔中，用mem/f12培养基(购自cellgro)进行培养。384孔微量滴定板事先用表达cd40l的小鼠成纤维细胞铺板。小鼠成纤维细胞从14日胎龄的胚胎提取，用dmem(含10％fbs)培养基体外培养4天后转染表达cd40l的质粒(购自origene)。48小时后将小鼠成纤维细胞以2000个/孔铺板。经过12天培养，b记忆细胞发生增殖，并分泌单克隆抗体。采用上述elisa方法筛选阳性b细胞克隆。
用rnaminiprep试剂盒(购自qiagen)分离阳性孔中的b细胞的rna，并用逆转录酶(购自biosystems)逆转录成cdna。然后采用下述兔子抗体特异性引物进行pcr。将兔抗体ig重链和轻链的扩增产物分别插入pcdna3.1(购自lifetech)表达载体中。用该载体通过脂质体(lipofactamine2000，购自lifetech)转染hek293细胞(购自lifetech)，过量表达特异性抗体，采用蛋白a柱子(购自lifetech)分离纯化特异性兔子抗体，共获得64个兔子单克隆抗体。
实施例2：从实施例1鉴定的单克隆抗体中筛选专一针对tn型糖基化muc1的单克隆抗体对
对获得的64个兔子单克隆抗体进行进一步鉴定。利用棋盘法鉴定捕捉抗体和检测抗体对。简言之，将所有64个抗体以2ng/ml(用pbs调整抗体浓度)的浓度，每孔100μl的量铺到384孔微量滴定板作为捕捉抗体，每个捕捉抗体铺47孔，18小时后，每孔添加100μl的含4％bsa的pbs缓冲液进行封闭，然后将标准品ca15-3(购自architect)以每孔100μl的量添加到384孔微量滴定板内，pbst缓冲液清洗5遍后用生物素标记的除其本身之外的抗体，作为检测抗体(浓度为2ng/ml，每孔加100μl)来检测对应的孔。
分别用elisa检测所获得的64个抗体，剔除阳性信号弱的抗体。获得一对对人tn型糖基化muc1具有专一性的兔子单克隆抗体。
经测序，第一抗体包含含seqidno:2所示的hcdr1，seqidno:3所示的hcdr2和seqidno:4所示的hcdr3的重链可变区，以及含seqidno:5所示的lcdr1，seqidno:6所示的lcdr2和seqidno:7所示的lcdr3的轻链可变区；第二抗体包含含seqidno:8所示的hcdr1，seqidno:9所示的hcdr2和seqidno:10所示的hcdr3的重链可变区，以及含seqidno:11所示的lcdr1，seqidno:12所示的lcdr2和seqidno:13所示的lcdr3的轻链可变区。
实施例3：利用实施例2中获得的抗体检测标准品和样品中的癌抗原15-3的水平
将捕捉抗体(两个抗体互为捕捉抗体和检测抗体)稀释于2mm碳酸钠(ph9.0)包被液中至浓度为1μg/ml，取50μl包被384孔微量滴定板的各孔，4℃孵育18h，用pbs清洗两遍后，用含4％bsa的pbst(pbs+0.1％triton-100)封闭2h，pbst(pbs+0.1％triton-100)清洗三遍后依次加入100μl标准品(购自architect)，浓度分别为0、20、80、160、400和800u/ml)，质控品(购自fujirebiodiagnosticsinc，其中所述质控品为来自人血清的天然tn型糖基化muc1的阴性和阳性质控品)和临床患者样品(其癌抗原15-3含量已知，几个临床患者样品中，部分患者被确诊为乳腺癌，部分为健康人群)，室温孵育30分钟。期间标准品和样品中的tn型糖基化muc1结合到捕捉抗体上，随后用pbst(pbs+0.1％triton-100)洗三遍，洗去孔中所有未结合的物质，包括未绑定的tn型糖基化muc1。然后向各孔中加入100μl的1μg/ml的hrp标记的检测抗体，孵育30分钟。经过孵育，滴定板内形成了抗体-抗原-抗体复合物。洗板去除任何未结合的检测抗体，添加100μl反应底物四甲基联苯胺(tmb)孵育10分钟，含有hrp的孔中溶液变成蓝色。然后通过在每孔中加100μl的硫酸来终止反应，颜色变成黄色，用spectramaxid5酶标仪在450nm处读取吸光度。吸光度的强弱和标本中的tn型糖基化muc1的水平正相关。
利用该实施例测定的结果绘制的标准曲线如图2所示。乳腺癌患者的人tn型糖基化muc1(ca15-3)水平明显升高(图3)，证明该对抗体能够有效用于检测血液中的人tn型糖基化muc1(ca15-3)的水平。为了比较所获的tnmuc1抗体和市场同类产品是否具有可比性。选用了雅培的抗muc1(ca15-3)抗体及其标准品进行拉下测定。实验显示在采用相同的浓度抗体进行铺板的情况下，共孵育的ca15-3标准品被第一抗体和第二抗体成功拉下。第一抗体和第二抗体具有比雅培抗体更高的结合标准品的能力(图4)。
序列表
<110>深圳市倍诺博生物科技有限公司
<120>抗人tn型糖基化muc1抗体及其用途
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<213>智人(homosapiens)
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