喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0004547及检测方法和应用与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0004547及检测方法和应用。

背景技术：

喉鳞癌作为头颈肿瘤中第二位高发的肿瘤，是一种侵袭性肿瘤，每年在全世界新兴恶性肿瘤中约占2.4％，其死亡率占全世界癌症死亡人数的1％，美国每年大约有10000人被确诊为喉鳞癌，近年来发病率和死亡率不断上升。喉鳞癌的治疗主要依赖于功能性喉部手术外科治疗、放疗和化疗，越来越多的研究关注于通过识别生物标志物来改善喉鳞癌的临床效果，但肿瘤的耐药性以及复发和转移，使喉鳞癌患者的预后效果仍然很差，5年死亡率超过50％，喉鳞癌的早起诊断及后期治疗仍需大量研究。

环状rna(circrnas)是一类新的稳定的竞争性内源rna，存在编码序列的基因中，在恶性肿瘤发病机制中发挥重要作用，circrnas通过特定的小rna结合位点调节基因表达，circrna作为竞争性内源性rna(cerna)结合小rna，从而影响小rna靶基因的表达。因此筛选出具有差异表达的circrna作为喉鳞癌相关的生物标志物，并对其进行功能研究，可以更好地了解疾病发生的分子机制，进而提高相关疾病的预防和诊断水平。

小干扰rna(sirna)称为短干扰rna或沉默rna，是一个长20到25个核苷酸的双股rna，在生物学上有许多不同的用途,它干扰了表达与互补的核苷酸序列的特定基因的转录后降解的rna,这种方法简单高效，逐渐成为分子细胞生物学的一种强有力的基因沉默的方式，但若设计不合理，极容易产生脱靶效应。

技术实现要素：

针对上述现有技术现状，本发明所要解决的一个技术问题是提供一种喉鳞癌分子标记物及其应用，利用该分子标记物可以简单、快捷的进行喉鳞癌诊断。

本发明所要解决的另一个技术问题是通过实时荧光定量检测喉鳞癌组织和癌旁组织的rna，提供一种检测喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0004547表达量的方法。

本发明所要解决的又一个技术问题是提供一种hsa_circ_0004547的sirna序列及其在喉鳞癌中的应用，利用该sirna可以简单、高效地敲降喉鳞癌细胞中hsa_circ_0004547的表达；并通过transwell证明hsa_circ_0004547的sirna对喉鳞癌细胞的迁移能力具有抑制作用。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明提供的一种喉鳞癌分子标记物，所述喉鳞癌分子标记物为hsa_circ_0004547，其在基因组上的定位为：chr22:29517344-29521404，所述hsa_circ_0004547的核苷酸序列如seqidno：1所示。

进一步地，所述hsa_circ_0004547在喉鳞癌患者癌组织中的表达水平上调。

再进一步地，喉鳞癌恶性程度与所述hsa_circ_0004547分子表达量具有相关性，恶性程度越高，hsa_circ_0004547分子表达量越高。

本发明提供的一种检测喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0004547表达量的方法，包括如下步骤：

(1)收集新鲜临床喉鳞癌组织和癌旁组织，提取组织中的总rna；

(2)将总rna反转录成cdna；

(3)用实时荧光定量pcr检测手段检测喉鳞癌癌旁组织和癌症组织中hsa_circ_0004547和内参18s的ct值；

(4)依据内参基因ct值均一化circrna的表达水平，计算得到组织中hsa_circ_0004547的相对表达水平，相对表达水平为2^δct，δct＝cthsa_circ_0004547-ct18s。

进一步地，所述步骤(3)的实时荧光定量中hsa_circ_0004547的背对背引物为：

f1：5’-ggcaggaattgcagcgagaa-3’；

r1：5’-aaagcagcaggatggtggc-3’。

再进一步地，所述实时荧光定量中的内参基因18s的引物为：

f2：5’-cctggataccgcagctagga-3’；

r2：5’-gcggcgcaatacgaatgcccc-3’。

本发明还提供一种喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0004547的应用，所述喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0004547应用在制备喉鳞癌辅助诊断试剂盒中。

针对所述hsa_circ_0004547在喉鳞癌患者癌组织中的表达水平上调，设计一种hsa_circ_0004547的sirna，用于敲降喉鳞癌细胞中hsa_circ_00004547的表达，本发明提供的一种hsa_circ_0004547的sirna序列为：

正义链：5’-ucuuugauaugccuggaaa-3’

反义链：5’-uuuccaggcauaucaaaga-3’。

本发明还提供一种hsa_circ_0004547的sirna在喉鳞癌中的应用，用于敲降喉鳞癌细胞中hsa_circ_0004547的表达，所述hsa_circ_0004547的sirna序列为：

正义链：5’-ucuuugauaugccuggaaa-3’

反义链：5’-uuuccaggcauaucaaaga-3’。

进一步地，本发明所提供的hsa_circ_0004547的sirna，通过transwell证明该sirna对喉鳞癌细胞迁移能力有抑制作用，可用于制备喉鳞癌化疗药物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明筛选出的hsa_circ_0004547作为喉鳞癌早期诊断的新型分子标记物，检测该分子标记物可以简单、快捷地进行喉鳞癌初步诊断。

2、喉鳞癌分子标记物的检测中通过使用trizol、氯仿、异丙醇等试剂，提取出符合标准的rna，仅需收集20mg喉鳞癌组织即可检测环状rna，成为喉鳞癌检测诊断、病理分级、临床分期、治疗疗效判断的有效工具，具有良好的临床应用前景，过程中利用的逆转录pcr和实时定量pcr仪器是常见仪器，荧光染料法可利用引物特异性，同时检测目的环状rna和内参基因，本发明提供的检测分子标记物hsa_circ_0004547的方法，对进一步研究喉鳞癌相关环状rna的生物学机制具有重要意义，为后期新药的研发提供靶标位点。

3、本发明提供的检测hsa_circ_0004547分子表达量的方法，采用实时荧光定量pcr检测手段，无需曾设探针即可同时检测目的环状rna和内参基因，具有经济、方便、检测效率高的优点。

4、在喉鳞癌细胞针对hsa_circ_0004547设计一条sirna序列，同时在喉鳞癌细胞hep-2、tu-686细胞中转染，通过提取细胞总rna,反转录得到总细胞cdna,实时荧光定量检测喉鳞癌细胞中hsa_circ_0004547的下调效率，进行后期transwell实验，证明本发明设计的sirna可有效使hsa_circ_0004547表达量降低，具有高效性，作用迅速的特点，并可抑制喉鳞癌细胞的迁移能力，可为喉鳞癌的治疗提供靶点，为喉鳞癌的早期诊断及治疗提供科学依据。

附图说明

图1为本发明实施例中正常组织和喉鳞癌癌组织hsa_circ_0004547表达水平；

图2为实施例中喉鳞癌组织不同分期中hsa_circ_0004547表达水平；

图3为实施例中喉鳞癌组织不同分级中hsa_circ_0004547表达水平；

图4为本发明实时荧光定量检测转染sirna后hsa_circ_0004547的表达量；

图5为本发明transwell显微镜拍照；

图6为本发明transwell细胞个数统计。

图7为本发明transwell细胞归一后数据统计。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述具体实施方式仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1：

一种喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0004547及其表达量的检测方法和应用。

一种喉鳞癌分子标记物，所述喉鳞癌分子标记物为hsa_circ_0004547，其在基因组上的定位为：chr22:29517344-29521404，所述hsa_circ_0004547的核苷酸序列如seqidno：1所示。

所述hsa_circ_0004547在喉癌患者癌组织中的表达水平上调。喉鳞癌恶性程度与所述hsa_circ_0004547分子表达量具有相关性，恶性程度越高，hsa_circ_0004547分子表达量越高。

所述喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0004547应用在制备喉鳞癌辅助诊断试剂盒中。

一种检测喉癌分子标记物hsa_circ_0004547表达量的方法，包括如下步骤：

(1)收集新鲜临床喉鳞癌组织，提取组织中的总rna；

(2)将总rna反转录成cdna；

(3)用实时荧光定量pcr检测手段检测喉鳞癌正常组织和癌症组织中hsa_circ_0004547和内参18s的ct值；

(4)依据内参基因ct值均一化circrna的表达水平，计算得到组织中hsa_circ_0004547的相对表达水平，相对表达水平为2^δct，δct＝cthsa_circ_0004547-ct18s；

其中，所述步骤(1)中提取组织中的总rna的过程如下：

(a)收集组织：喉鳞癌组织在手术切除后加入rna保存液的无rna酶的离心管中；

(b)裂解组织：取约20mg喉鳞癌组织放入厚壁的2ml离心管中，置于冰上，加1mltrizol，加入磁珠，用组织破碎器将组织匀浆，室温静置10min，使组织中rna充分释放至溶液中；

(c)氯仿提取：加入0.2ml氯仿，涡旋震荡混匀，室温静置10min；4℃12000rcf离心15min，小心吸取上清至1.5ml无rna酶的离心管中；

(d)异丙醇沉淀：在无酶管中加入等体积异丙醇，-20℃沉淀过夜，12000rcf在4℃下离心10分钟，弃上清；

(e)乙醇洗涤：加入1ml75％的乙醇，混匀，12000rcf4℃离心5min，弃上清，重复加入1ml75％的乙醇，混匀，12000rcf4℃离心5min，弃上清；

(f)溶解rna：倒掉乙醇，超净台中风干沉淀,等待管底无透明液体后，加入适量无酶水，溶解rna,测出总rna浓度和纯度。

其中，所述步骤(2)将总rna反转录为cdna；其中，反转录试剂的组分及各组分的比例如表1所示：

表1：反转录试剂组成表

逆转录反应程序为：

在pcr仪器上设置：第一步25℃反应5min；第二步50℃，反应15min；第三步85℃，反应2min。

其中，所述步骤(3)在定量中的hsa_circ_0004547的背对背引物为：

f1：5’-ggcaggaattgcagcgagaa-3’；

r1：5’-aaagcagcaggatggtggc-3’。

内参基因18s的引物为：

f2：5’-cctggataccgcagctagga-3’；

r2：5’-gcggcgcaatacgaatgcccc-3’。

所述步骤(3)中荧光定量pcr反应试剂的组分及各组分的比例如表2所示：

表2：pcr反应试剂成分表

pcr实时荧光定量反应程序为：

第一步95℃反应30s；第二步95℃反应10s，60℃反应30s，40次循环；第三步95℃反应15s，60℃反应60s，95℃反应15s。

实施例2：

利用本发明的喉癌分子标记物hsa_circ_0004547合成hsa_circ_0004547的sirna。

首先，合成hsa_circ_0004547的sirna。

根据sirna设计原则，合成的sirna序列中包含环状rna的环化位点，片段长度为20bp的序列作为候选靶点序列，通过人类基因组序列对比，确保无同源序列，本发明所设计的sirna序列如下：

正义链：5’-ucuuugauaugccuggaaa-3’

反义链：5’-uuuccaggcauaucaaaga-3’

将序列送到苏州吉玛公司合成，增加两个脱氧核糖核酸dtdt,增加sirna的稳定性，并用绿色荧光标记sirna。

其次，对喉鳞癌细胞进行sirna转染。

喉鳞癌细胞tu-686、hep-2前一天按8×10⁴个细胞铺板于24孔板中，第二天等待细胞贴壁，且汇合度为60％左右时转染，用lipofectamin3000转染试剂将hsa_circ_0004547及对照nc转染喉鳞癌细胞，6小时后进行换液。

再次，检测喉鳞癌细胞中hsa_circ_0004547的表达量。其所用方法与实施例1中的一种检测喉癌分子标记物hsa_circ_0004547表达量的方法，区别仅在于：

本实施是收集转染后喉鳞癌细胞，不是裂解组织，而是裂解细胞，提取细胞中总rna。

进一步对hsa_circ_0004547表达量的结果分析

通过对喉鳞癌组织中hsa_circ_0004547定量，结果如图1-3所示，发现喉鳞癌组织中hsa_circ_0004547的表达量是癌旁组织的3.1倍，且具有统计学差异(p<0.001)，通过分析发现hsa_circ_0004547表达量与喉鳞癌病人的临床分期具有很强的相关性，t3/t4临床分期的病人hsa_circ_0004547的表达量是t1/t2临床分期病人的2.72倍；除此之外hsa_circ_0004547的表达量与病人的临床分级也具有很强相关性，iii/iv临床分期的病人hsa_circ_0004547的表达量是i/ii临床分期病人的2.62倍。hsa_circ_0004547在喉鳞癌中特异性的高表达，且其表达量与喉鳞癌的临床分期分级具有很强相关性，hsa_circ_0004547的表达量越高，其喉鳞癌恶性程度越高，因此，hsa_circ_0004547可做为喉鳞癌的分子标记物。

综上所述，所述喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0004547应用在制备喉鳞癌辅助诊断试剂盒中。

从图4中可以看出，在喉鳞癌细胞中利用sirna下调hsa_circ_0004547后，与转染无意义干扰序列相比，在hep-2喉鳞癌细胞中下调效率为82.83％，在tu-686喉鳞癌细胞中下调效率为80.62％，因此本发明提供的sirna序列可以高效快速的在喉鳞癌细胞中降低hsa_circ_0004547的表达。

从图5-7中可看出hsa_circ_0004547的sirna对喉鳞癌细胞迁移能力的抑制能力。在喉鳞癌细胞hep-2、tu686中转染所述sirna后，通过transwell实验，发现喉鳞癌细胞hep-2在24h可迁移493个细胞，当转染所述sirna后，细胞只迁移过去176个，下调hsa_circ_0004547可抑制喉鳞癌细胞hep-2的迁移，抑制率为64.3％，在喉鳞癌细胞tu-686在24h可迁移308个细胞，当转染所述sirna后，细胞只迁移过去137个，下调hsa_circ_0004547可抑制喉鳞癌细胞tu-686的迁移，抑制率为55.36％，因此转染所述sirna可降低hsa_circ_0004547的表达，此sirna对喉鳞癌细胞迁移能力有抑制作用，可为喉鳞癌病人的放化疗提供理论指导。

综上所述，hsa_circ_0004547的sirna可用于制备喉鳞癌化疗药物。

seqidno：1hsa_circ_0004547核苷酸序列

tgcctggaaaccttggctgctacaaggatcatggaaacccacctcctctaactggcaccagtaaaacgtccaacaaactcaccatacaaacttgcatcagtttttgtcggagtcagaggttcaagtttgctgggatggagtcaggctatgcttgcttctgtggaaacaatcctgattactggaagtacggggaggcagccagtaccgaatgcaacagcgtctgcttcggggatcacacccaaccctgtggtggcgatggcaggatcatcctctttgata

序列表

<110>山西医科大学第一医院

高伟

吴勇延

<120>喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0004547及检测方法和应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>279

<212>dna

<213>人(homosapiens)

<400>1

tgcctggaaaccttggctgctacaaggatcatggaaacccacctcctctaactggcacca60

gtaaaacgtccaacaaactcaccatacaaacttgcatcagtttttgtcggagtcagaggt120

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