通过抑制胞外核苷酸酶和抗体-介导靶向吞噬预防或逆转T-细胞衰竭的组合物与用途的制作方法

通过抑制胞外核苷酸酶和抗体-介导靶向吞噬预防或逆转t-细胞衰竭的组合物与用途
技术领域
1.本项发明涉及一项能够降低t细胞耗竭的方法及具备该功能可用于临床治疗的药物。此类药物具体包括一种抗-cd39抗体药物，及其在制药领域的用途。


背景技术：

2.细胞外腺苷是一种免疫功能的抑制剂。虽然细胞内腺苷参与能量代谢、核酸代谢和蛋氨酸循环，但在细胞外的腺苷主要起信号转导作用。其通过细胞表面上的g蛋白偶联腺苷受体去影响包括神经、心血管和免疫系统在内的多种生理功能(fredholm等，pharmacol rev(2001)53：527)。细胞外的腺苷浓度能够响应细胞代谢的变化。当细胞在缺乏营养或氧气时，不充足的三磷酸腺苷(atp)生物合成会降低atp和腺苷的比例。为减少atp消耗，细胞可能会停止消耗能量的活动，如像细胞增殖这样需要生物合成大量细胞组分的活动(tripmacher等；eur j immunol(2008)38：1631；pollizzi et al.nat rev immunol(2014)14：435.)。虽然组织缺氧确实会强烈抑制活化t细胞增殖(ohta等；int immunol(2014)26：83)，但有意思的是细胞外腺苷在缺氧条件下会发生蓄积。腺苷信号可能通过促进贮存的代谢能分解，从而在改善能量状态中发挥作用。相应地，细胞外腺苷可通过诱导脂肪分解增加能量消耗(gnad等；nature(2014)516：395)。有研究显示肿瘤中含有高水平的细胞外腺苷(blay et al.cancer res(1997)57：2602；and ohta et al.proc natl acad sci usa(2006)103：13132)，这表明肿瘤细胞可能从细胞外腺苷的免疫抑制作用和分解代谢能生成中获益。
3.免疫抑制性环磷酸腺苷(camp)-介导通过腺苷a2a受体(a2ar)的信号通路，可抑制缺氧、炎症和肿瘤微环境中的t淋巴细胞和自然杀伤细胞(nk)(ohta等；(2006)，supra.)。临床前研究，及最新积极的临床试验数据，表明a2ar抑制剂是一种潜在的新型免疫治疗策略。cd39是胞外二三磷酸核苷酸水解酶1(ntpdase 1)，是一种广泛表达于人体组织细胞表面的核苷酸水解酶，是参与产生免疫抑制性的腺苷过程中的限速酶。cd39广泛表达于多种组织器官，如膀胱、脑、乳腺、结肠、子宫、胃和前列腺等，并且主要表达于内皮细胞和免疫细胞。cd39在许多恶性肿瘤中的表达水平是升高的。在动物模型中阻断腺苷-生成途径的cd39/cd73也能诱导乳腺癌、结直肠癌和黑色素瘤消退。但是，因为潜在的有害作用如炎症和炎症性/自身免疫性疾病恶化，使用a2ar抑制剂可能引起不利的全身性作用，导致不良事件发生，从而要求限制或减少癌症患者用药，甚至要求停药。目前公开的采用抗cd39和抗cd73抗体治疗方案，其主要作用机制是通过结合至这些细胞表面上腺苷生成酶(外核苷酸酶)，从而抑制atp分解代谢成腺苷。这些治疗方法有很多问题。而且问题不仅在于它们引起的毒副作用，还在于这些抗cd39和抗cd73抗体实际上并不能完全抑制细胞的外核苷酸酶活性，尤其是在肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrated lymphocytes，tils)中t淋巴细胞耗竭时(这也是导致很多患者对肿瘤免疫治疗如pd-1抗体的耐药的原因)。


技术实现要素：

4.本项发明至少部分建立在下述发现之上，即通过发明的抗体靶向结合于细胞外核苷酸酶(可降解三磷酸腺苷水解酶和二磷酸腺苷的水解酶)从而预防或逆转肿瘤患者的t细胞耗竭，增强抗肿瘤免疫反应。例如对于肿瘤来说，抗cd39抗体通过抗体介导的靶向吞噬(清除)作用降低cd45阳性细胞表面cd39的量，从而预防或逆转t-细胞耗竭和增强免疫反应。这不同于目前已公开抗cd39和抗cd73的作用机制，仅能抑制外核苷酸酶活性。
5.本项发明涉及一项能够降低t细胞耗竭的方法，及具备该功能的治疗用药物。此类药物具体包括一种cd39抗体药物。该类抗cd39抗体药物能在治疗剂量下降低cd45阳性免疫细胞表面cd39的表达量。并且该类抗cd39抗体药物识别的cd39结构域被囊括在pb1、pb2、pb3、pb4和pb5这一组抗体所结合的cd39结构域中。该类抗cd39抗体药物还能有效结合到细胞的fcγriiia上。
6.本项发明所述抗体制作分为以下几个步骤：
7.1.制备抗原
8.首先制备用于免疫兔子的抗原。该抗原将刺激兔子的免疫系统使其产生能够特异性结合人cd39的抗体。制作该抗原的基本流程是合成能够编码人cd39的核苷酸序列。然后利用该核苷酸序列将人cd39过表达在一个细胞系的细胞膜上。这个膜表面过表达人cd39的细胞就是我们用来免疫兔子的抗原。
9.2.免疫兔子
10.将抗原注入兔的血管内。
11.3.提取，分离和扩增兔的单个b细胞。
12.4.用elisa的方法挑选阳性克隆，并对阳性克隆进行测序
13.(1)利用elisa的方法检测b细胞的培养基中是否含有能够特异性结合人cd39的抗体。(2)对阳性克隆进行测序，获取抗体序列。
14.5.用基因工程的方法将获取的兔抗体序列表达在cho细胞中，从而生产抗体。对于嵌合体抗体，我们先在基因层面上将兔抗体的fc片段置换为人抗体的fc片段，其余保持不变。该人抗体的亚型是人igg1。然后人工合成重组后的抗体核苷酸序列，并将该核苷酸序列表达在cho细胞中，从而生产出相应的抗体。
15.按照上述流程获得的克隆编号，及其抗体的序列如下：
[0016][0017]
[0018][0019]
在某些实施例中，所述的抗原结合结构域包含氨基酸序列为seq id no.1的vh抗原结合结构域和氨基酸序列为seq id no.2的vl抗原结合结构域，或包含只有vh抗原结合结构域，或包含只有vl抗原结合结构域。所述的抗原结合结构域和氨基酸序列为seq id no.1的vh抗原结合结构域和/或氨基酸序列为seq id no.1的vl抗原结合结构域同一性在80％、85％、90％或95％。
[0020]
在某些实施例中，所述的抗原结合结构域包含氨基酸序列为seq id no.3的vh抗原结合结构域和氨基酸序列为seq id no.4的vl抗原结合结构域，或包含只有vh抗原结合结构域，或包含只有vl抗原结合结构域。所述的抗原结合结构域和氨基酸序列为seq id no.3的vh抗原结合结构域和/或氨基酸序列为seq id no.4的vl抗原结合结构域同一性在80％、85％、90％或95％。
[0021]
在某些实施例中，所述的抗原结合结构域包含seq id no.5的vh抗原结合结构域和seq id no.6的vl抗原结合结构域，或包含只有vh抗原结合结构域，或包含只有vl抗原结合结构域。所述的抗原结合结构域和seq id no.5的vh抗原结合结构域和/或seq id no.6的vl抗原结合结构域同一性在80％、85％、90％或95％。
[0022]
在某些实施例中，所述的抗原结合结构域包含seq id no.7的vh抗原结合结构域和seq id no.8的vl抗原结合结构域，或包含只有vh抗原结合结构域，或包含只有vl抗原结合结构域。所述的抗原结合结构域和seq id no.7的vh抗原结合结构域和/或seq id no.8的vl抗原结合结构域同一性在80％、85％、90％或95％。
[0023]
在某些实施例中，所述的抗原结合结构域为fab、fab
′
、f(ab
′
)2、fv或单链fv(scfv)。
[0024]
在某些实施例中，所述的fcγriiia结合单元选择自fc结构域，结合于fcγriiia的抗体或其片段，及fcγriiia结合肽。
[0025]
在某些实施例中，抗cd39抗体可通过抗体介导的靶向吞噬降低cd45阳性免疫细胞上cd39的表达量。在某些实施例中，抗cd39抗体可降低肿瘤中的耗竭t-细胞的百分数(即任何带有耗竭型标志的t细胞)。
[0026]
在某些实施例中，抗cd39抗体可通过抗体介导的靶向吞噬降低肿瘤血管内皮cd39的表达量。在某些实施例中，抗cd39抗体具有抗肿瘤血管生成，或破坏、瓦解血管网络的作用。
[0027]
在某些实施例中，抗cd39抗体为抗肿瘤治疗的一部分。
[0028]
在某些实施例中，抗cd39抗体是抗感染治疗的一部分，如抗病毒治疗(包含hiv和hbv感染治疗)，结核分枝杆菌和内脏利什曼病治疗。
[0029]
本项发明还提供促进抗肿瘤免疫应答的方法和治疗药物，包括给予肿瘤患者抗-cd39抗体，该抗体的抗原结合结构域选择自可与细胞外核苷酸酶(三磷酸二磷酸腺苷水解酶-1(“cd39”)结合的一组抗体。这组抗体的克隆编号包括pb1、pb2、pb3、pb4和pb5。本发明所述的抗体抗体可结合fcγriiia，并保留抗体-依赖性细胞毒性(adcc)；患者给予抗体可降低肿瘤浸润免疫细胞上的cd39表达。
[0030]
在某些实施例中，抗cd39抗体可通过抗体介导的靶向吞噬降低cd45阳性免疫细胞上cd39的表达量。在某些实施例中，抗cd39抗体可降低肿瘤中的耗竭t-细胞的百分数(即任何带有耗竭型标志的t细胞)。
[0031]
在某些实施例中，抗cd39抗体可通过抗体介导的靶向吞噬降低肿瘤血管内皮cd39的表达量。在某些实施例中，抗cd39抗体具有抗肿瘤血管生成，或破坏、瓦解血管网络的作用。
[0032]
在某些实施例中，抗-cd39抗体为igg1或igg3同种型。
[0033]
在某些实施例中，抗-cd39抗体为低岩藻糖基化或无岩藻糖基化修饰。
[0034]
在某些实施例中，抗-cd39抗体为人源化抗体。
[0035]
在某些实施例中，抗-cd39抗体为多特异性(优选双特异性)抗体，其至少包括另外一种肿瘤抗原、免疫检查点或协同刺激受体的抗原结合部位，如另外的抗原结合部位为免疫检查点，则其功能为检查点抑制剂；如另外的抗原结合部位为协同刺激受体，则其功能为协同刺激激动剂。例如，另外的抗原结合部位能够与免疫检查点蛋白结合，如可选自下述蛋白组：pd-1、pd-l1、ctla-4/b7-1/b7-2、pd-l2、nkg2a、kir、lag-3、im-3、cd96、vista和tigit，其中另外的抗原结合部位是一个检查点抑制剂。在某些优选实施例中，另外的抗原结合部位可与t-细胞上调和t-细胞耗竭相关的检查点蛋白结合。另外的抗原结合部位还可以与免疫协同刺激受体结合，如选自下述一组成分：mhci分子、btla受体、ox40、cd27、cd28、
cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)和4-1bb(cd137)，其中另外的抗原结合部位是一个系统刺激激动剂。
[0036]
在某些实施例中，抗-cd39抗体为实体瘤或血液肿瘤治疗的一部分。例如，所述方法可治疗的实体瘤包括胰腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、食道癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、淋巴癌、胆囊癌、肾癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、子宫颈癌或神经胶质瘤。所述方法可治疗的血液肿瘤包括白血病，如骨髓性或粒细胞性白血病，淋巴性、淋巴细胞性、淋巴母细胞白血病，及真性红细胞增多症或白血病性红细胞增多。
[0037]
本项发明所述抗-cd39抗体可与一种或多种化疗药物、抗血管生成药物、免疫-肿瘤治疗药物和/或放疗联合治疗。例如检查点分子的抑制剂(拮抗剂)，包括pd-1拮抗剂、pd-l1拮抗剂、ctla-4拮抗剂、lag-3拮抗剂、tim-3拮抗剂和tigit拮抗剂。例如协同刺激分子的活化剂(激动剂)，包括gitr激动剂、cd27激动剂、4-1bb激动剂、ox40激动剂、cd137激动剂、icos激动剂和cd28激动剂。可与抗-cd39抗体联合给药的其他治疗药物包括vegf/vegfr拮抗剂(如抗-vegf-2抗体，如cyramza)，egf/egfr拮抗剂(如抗-egfr抗体，如necitumumab)，ido抑制剂(如nlg919)或ido1抑制剂(如epacadostat)，hdac抑制剂(如entiostat)，pi3k delta抑制剂(如tgr-1202)，il-15激动剂(如il15ra-fc融合蛋白alt-803)，cxcr4拮抗剂(如ulocuplumab、plerixafor和bl-8040)，cxcl12拮抗剂(如spiegelmer nox-a12)，dnmt抑制剂(如阿扎胞苷)，白介素-21，抗-kir抗体(如lirilumab)，抗-csf-1r抗体(如fpa008或ro5509554)，抗-ccr4抗体(如mogamulizumab)，gmcsf(如sargamostim)，抗-ps抗体(如bavituximab)，抗-cd30抗体-aurstatin e偶联物(如adcetris)，抗-cd19抗体(如medi-551)，抗-cea il-2抗体(如rg7813)，抗-ny-eso-1抗体(如cdx-1401)，抗-nkg2a抗体(如iph2201)，sting激动剂(如adu-s100、mk-1454或sb 11285)、trl7/8激动剂(如medi9197)、rig-1激动剂(如rgt100)，或抗-cd73抗体(如medi9447)。
[0038]
本项发明所述方法还可与下述方法联合治疗：这些治疗方法包括肿瘤疫苗，过继性细胞免疫治疗(包括car-t和actr治疗)，抗肿瘤基因治疗(如sirna、shrna、antisense、crispr和talen治疗)，或溶瘤病毒治疗。
[0039]
此外本项发明还提供了预防或逆转t-细胞耗竭并增强抗肿瘤免疫应答的方法，具体包括步骤：
[0040]
(i)鉴定出肿瘤中含有一定程度的耗竭型t细胞的肿瘤患者。该类浸润在肿瘤中的，耗竭的t细胞上有一种或者多种t-细胞耗竭标志物水平超过既定阈值；
[0041]
(ii)患者给予本项发明所述的抗-cd39抗体，降低肿瘤浸润淋巴细胞上的可检出cd39水平，从而逆转t-细胞耗竭。
[0042]
在某些实施例中，抗-cd39抗体可通过抗体介导的靶向吞噬降低cd45阳性免疫细胞的cd39量。在某些实施例中，抗-cd39抗体可降低肿瘤中的耗竭t细胞的百分数(即任何带有耗竭型标志的t细胞)。
[0043]
在某些实施例中，抗-cd39抗体可通过抗体介导的靶向吞噬降低肿瘤血管内皮cd39的量。在某些实施例中，抗-cd39抗体具有抗肿瘤血管生成，或破坏、瓦解血管网络的作用。
[0044]
在某些实施例中，抗-cd39抗体为igg1或igg3同种型。
[0045]
在某些实施例中，抗-cd39抗体为低岩藻糖基化或无岩藻糖基化修饰。
[0046]
在某些实施例中，抗-cd39抗体为人源化抗体。
[0047]
在某些实施例中，抗-cd39抗体为多特异性(优选双特异性)抗体，至少包括另外一种肿瘤抗原、免疫检查点或协同刺激受体的抗原结合部位，如另外的抗原结合部位为免疫检查点，则其功能为检查点抑制剂；如另外的抗原结合部位为协同刺激受体，则其功能为协同刺激激动剂。例如，另外的抗原结合部位能够与免疫检查点蛋白结合，如可选自下述蛋白组：pd-1、pd-l1、ctla-4/b7-1/b7-2、pd-l2、nkg2a、kir、lag-3、im-3、cd96、vista和tigit。如此一来，另外的抗原结合部位是一个检查点抑制剂。在某些优选实施例中，另外的抗原结合部位在一些在t-细胞上上调的，和t-细胞耗竭相关的检查点蛋白结合。另外的抗原结合部位还可以与免疫协同刺激受体结合，如选自下述一组成分：mhci分子、btla受体、ox40、cd27、cd28、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)和4-1bb(cd137)。在此情况下，另外的抗原结合部位是一个协同刺激激动剂。
[0048]
在某些实施例中，抗-cd39抗体可作为肿瘤治疗的一部分，如实体瘤或血液肿瘤。例如，所述方法可治疗的实体瘤包括肉瘤、癌和淋巴瘤，如胰腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、食道癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、淋巴癌、胆囊癌、肾癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、子宫颈癌及神经胶质瘤。所述方法可治疗的血液肿瘤包括白血病，如骨髓性或粒细胞性白血病，淋巴性、淋巴细胞性、淋巴母细胞白血病，及真性红细胞增多症或白血病性红细胞增多。
[0049]
抗-cd39抗体可与一种或多种化疗药物、抗血管生成药物、免疫-肿瘤治疗药物和/或放疗联合治疗。例如检查点分子的抑制剂(拮抗剂)，包括pd-1拮抗剂、pd-l1拮抗剂、ctla-4拮抗剂、lag-3拮抗剂、tim-3拮抗剂和tigit拮抗剂。例如协同刺激分子的活化剂(激动剂)，包括gitr激动剂、cd27激动剂、4-1bb激动剂、ox40激动剂、cd137激动剂、icos激动剂和cd28激动剂。抗-cd39抗体可联合使用的其他治疗药物还包括如vegfr/vegf拮抗剂，egfr/egf拮抗剂，ido抑制剂(包括ido1和ido2抑制剂)，hdac抑制剂，pi3k delta抑制剂，il-15激动剂，cxcr4拮抗剂，cxcl12拮抗剂，dnmt抑制剂，白介素-21，抗-kir抗体，抗-csf-1r抗体，抗-ccr4抗体，gmcsf，抗-ps抗体，抗-cd30抗体-药物(如aurstatin e)偶联物，抗-cd19抗体，抗-cea il-2抗体，抗-ny-eso-1抗体，抗-nkg2a抗体，sting激动剂，trl7/8激动剂，rig-1激动剂，抗-cd73抗体，p2x7拮抗剂和腺苷a2a受体拮抗剂。
[0050]
本项发明所述方法还可与下述方法联合治疗：这些治疗方法包括肿瘤疫苗，过继性细胞免疫治疗(包括car-t和actr治疗)，抗肿瘤基因治疗(如sirna、shrna、antisense、crispr和talen治疗)，或溶瘤病毒治疗。
[0051]
在某些实施例中，步骤(i)还包括利用抗体染色检测细胞的数量或百分数，或者用于抗体染色强度以指示肿瘤浸润淋巴细胞上cd39、pd-1、ctla-4、tim-3、lag-3、cd160、btla或2b4有一个或多个的上调程度。在这些实施例中，可采用其他t-细胞耗竭标志物的上调情况来判定患者是否适合接受抗-cd39抗体治疗，即筛选出一些特定患者，他们的肿瘤中具有一定程度肿瘤浸润淋巴细胞，且这些细胞中的t-细胞表达超过既定阈值水平的耗竭标志物。在非小细胞肺癌(nsclc)，结直肠癌、晚期黑色素瘤、肾细胞癌(rcc)、乳腺癌(包括三阴乳腺癌)、胃癌、食道癌、膀胱上皮癌(uc)或肝细胞癌(hcc)患者中，此类t-细胞耗竭标志物较为普遍。
[0052]
另外本项发明还披露用于降低有需要个体t-细胞耗竭的药物制品，该药物制品中
包含在有效治疗剂量下，本项发明所述的抗cd39抗体可结合于外核苷三磷酸二磷酸水解酶-1(“cd39”)和fcγriiia。给药后能够降低cd45+免疫细胞上cd39的可检出水平，并有效恢复耗竭的t-细胞或失能的t-细胞的功能。
[0053]
在某些实施例中，抗-cd39抗体可导致cd45+免疫细胞的cd39发生抗体-介导的靶向吞噬。在某些实施例中，抗-cd39抗体可降低肿瘤中的耗竭t-细胞的百分数(即任何带有耗竭型标志的t细胞)。
[0054]
在某些实施例中，抗-cd39抗体可导致肿瘤血管内皮的cd39发生抗体-介导的靶向吞噬。在某些实施例中，抗-cd39抗体具有抗肿瘤血管生成，或破坏、瓦解血管网络的作用。
[0055]
在某些实施例中，抗-cd39抗体为igg1或igg3同种型。
[0056]
在某些实施例中，抗-cd39抗体为低岩藻糖基化或无岩藻糖基化修饰。
[0057]
在某些实施例中，抗-cd39抗体为人源化抗体。
[0058]
在某些实施例中，抗-cd39抗体为多特异性(优选双特异性)抗体，至少包括另外一种肿瘤抗原、免疫检查点或协同刺激受体的抗原结合部位，如另外的抗原结合部位为免疫检查点，则其功能为检查点抑制剂；如另外的抗原结合部位为协同刺激受体，则其功能为协同刺激激动剂。例如，另外的抗原结合部位能够与免疫检查点蛋白结合，如可选自下述蛋白组：pd-1、pd-l1、ctla-4/b7-1/b7-2、pd-l2、nkg2a、kir、lag-3、im-3、cd96、vista和tigit，如此一来，另外的抗原结合部位是一个检查点抑制剂。在某些优选实施例中，另外的抗原结合部位可与在t-细胞上调的，t-细胞耗竭相关的检查点蛋白结合。另外的抗原结合部位还可以与免疫协同刺激受体结合，如选自下述一组成分：mhci分子、btla受体、ox40、cd27、cd28、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)和4-1bb(cd137)，在这种情况下，另外的抗原结合部位是一个系统刺激激动剂。
[0059]
在某些实施例中，抗-cd39抗体配制成制品，用作实体瘤或血液肿瘤治疗的一部分。例如，所述方法可治疗的实体或血液肿瘤包括胰腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、食道癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、淋巴癌、胆囊癌、肾癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、子宫颈癌和神经胶质瘤，以及淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤或非-霍奇金淋巴瘤)。所述方法可治疗的血液肿瘤包括白血病，如骨髓性或粒细胞性白血病，淋巴性、淋巴细胞性、淋巴母细胞白血病，及真性红细胞增多症或白血病性红细胞增多。
[0060]
在某些实施例中，抗-cd39抗体可作为联合治疗的一部分。和一种或多种化疗药物、抗血管生成药物、免疫-肿瘤治疗药物和/或放疗联合治疗。例如检查点分子的抑制剂(拮抗剂)，包括pd-1拮抗剂、pd-l1拮抗剂、ctla-4拮抗剂、lag-3拮抗剂、tim-3拮抗剂和tigit拮抗剂。例如协同刺激分子的活化剂(激动剂)，包括gitr激动剂、cd27激动剂、4-1bb激动剂、ox40激动剂、cd137激动剂、icos激动剂和cd28激动剂。抗-cd39抗体可联合使用的其他治疗药物还包括如vegfr/vegf拮抗剂，egfr/egf拮抗剂，ido抑制剂(包括ido1和ido2抑制剂)，hdac抑制剂，pi3k delta抑制剂，il-15激动剂，cxcr4拮抗剂，cxcl12拮抗剂，dnmt抑制剂，白介素-21，抗-kir抗体，抗-csf-1r抗体，抗-ccr4抗体，gmcsf，抗-ps抗体，抗-cd30抗体-药物(如aurstatin e)偶联物，抗-cd19抗体，抗-cea il-2抗体，抗-ny-eso-1抗体，抗-nkg2a抗体，sting激动剂，trl7/8激动剂，rig-1激动剂，抗-cd73抗体，p2x7拮抗剂和腺苷a2a受体拮抗剂。
[0061]
本项发明所述方法还可与下述方法联合治疗：这些治疗方法包括肿瘤疫苗，过继
性细胞免疫治疗(包括car-t和actr治疗)，抗肿瘤基因治疗(如sirna、shrna、antisense、crispr和talen治疗)，或溶瘤病毒治疗。
[0062]
在某些实施例中，步骤(i)还包括利用抗体染色去检测细胞数量或百分数，或利用抗体染色强度去指示肿瘤浸润淋巴细胞上cd39、pd-1、ctla-4、tim-3、lag-3、cd160、btla或2b4有一个或多个的上调程度。在这些实施例中，可采用其他t-细胞耗竭标志物上调的状态来判定患者是否适合接受抗-cd39抗体治疗，即筛选出一些特定患者，他们的肿瘤中具有一定程度肿瘤浸润淋巴细胞，且这些细胞中的t-细胞表达超过既定阈值水平的耗竭标志物。在非小细胞肺癌(nsclc)，结直肠癌、晚期黑色素瘤、肾细胞癌(rcc)、乳腺癌(包括三阴乳腺癌)、胃癌、食道癌、膀胱上皮癌(uc)或肝细胞癌(hcc)患者中，此类t-细胞耗竭标志物较为普遍。
[0063]
本项发明还披露一种双特异性抗体，该抗体的第一个结合区段特异性结合人cd39和第二个结合区段特异性结合肿瘤抗原、免疫检查点或协同刺激受体，其中如另外的抗原结合部位为免疫检查点，则其功能为检查点抑制剂；如另外的抗原结合部位为协同刺激受体，则其功能为协同激动剂；所述双特异性抗体可诱导cd45+免疫细胞上的cd39发生抗体-介导靶向吞噬。
[0064]
为帮助理解本项发明，对多个术语和短语定义如下。
[0065]“cd39”又称为“分化抗原簇39”、“外核苷三磷酸二磷酸水解酶-1”或(基因)“entpd1”和(蛋白质)“ntpdase1”，是一种位于细胞表面的胞外核苷酸酶，具有面向细胞外的催化位点，催化水解三磷酸或二磷酸核苷的γ-和β-磷酸残基，生成单磷酸核苷衍生物(enzyme entry：ec 3.6.1.5)，如水解p2受体的配体atp、adp、utp和udp。在uniprotkb entry“p49961(entp1_human)”中给出了代表性人ntpdase1蛋白质的序列，在genbank accession s73813中给出了该酶的代表性人编码序列。
[0066]“cd39抗体”(或者“抗-cd39抗体”)指的是选择性结合ntpdase1蛋白质上一个或多个抗原表位的抗体，以及双特异性和其他多特异性形式的抗体。
[0067]
在本项发明正文中所述的“抗体-介导的靶向吞噬”或“amtc”，指的是抗体介导的cd45+免疫细胞表面上cd39清除，同时不会显著减少cd45+免疫细胞的数量，具体机制并不是诱导cd45+细胞死亡。如本文所述，优选的cd39抗体结合ntpdase1的细胞外抗原表位，同时结合fcγriii(即通过抗体fc结构域或其他fcγriii结合单元)，进一步优选的抗体能够在cd45+免疫细胞上的cd39发生抗体-介导的靶向吞噬。
[0068]
在本文中使用的术语“抗体”指的是可通过至少一个抗原-结合部位，识别并特异性结合靶点如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质，或上述任何组合的免疫球蛋白分子，其中抗原-结合部位通常位于免疫球蛋白分子的可变区内。在本文中此术语包括完整的多克隆抗体，完整的单克隆抗体，抗体片段(如fab、fab
′
、f(ab
′
)2和fv片段)，单链fv(scfv)抗体(只要这些片段设计包含fc或其他fcγriii结合结构域)，多特异性抗体，双特异性抗体，单特异性抗体，单价抗体，嵌合抗体，人源化抗体，人抗体，包含抗体的抗原-结合部位的融合蛋白(设计包含fc或其他fcγriii结合结构域)，及其他包含抗原-结合部位的修饰免疫球蛋白分子(只要抗体具备预期的生物活性即可)。
[0069]
在本文中使用的术语抗体的“抗原-结合部位”指的是具有特异性结合抗原(如人cd39)能力的抗体的一个或多个片段。已知全长抗体的片段可以行使抗体的抗原-结合功
能。在术语抗体“抗原-结合部位”中包括的结合片段例如在本文中描述的抗-cd39抗体，包含(i)一个fab片段，一个由v
l
、v
h
、cl和ch1结构域组成的单价片段；(ii)一个f(ab
′
)2片段，一个由在铰链区二硫键连接的两个fab片段组成的二价片段；(iii)一个由v
h
和ch1结构域组成的fd片段；(iv)一个由抗体的单臂v
l
和v
h
结构域组成的fv片段；(v)由v
h
结构域组成的一个dab片段(ward等，(1989)nature 341：544-546)；及(vi)一个分离的互补决定区(cdr)，或(vii)两个或多个分离cdr的组合，可通过合成接头任意连接。此类单链抗体也可以包含在术语抗体“抗原-结合部位”当中。在chan&carter(2010)nat.rev.immunol.10：301中描述了这些及其他潜在的结构。这些抗体片段可采用本领域技术人员熟悉的常规技术制得，采用完整抗体相同的方法筛选片段的用途。可采用重组dna技术，或酶解或化学裂解完整的免疫球蛋白制备抗原-结合部位。
[0070]
术语抗体的“可变区”指的是抗体轻链的可变区，或抗体重链的可变区，单独或二者的组合。通常轻链和重链的可变区各包含四个框架区(fr)和三个互补决定区(cdr)，后者又叫做“高变区”。各链上的cdr及其他链上的cdr通过框架区紧密连接在一起，从而构成了抗体的抗原-结合部位。有至少两种技术测定cdr：(1)基于跨种属序列变异性的方法(即kabat et al.，1991，sequences of proteins of immunological interest，5th edition，national institutes of health，bethesda md.)，和(2)基于抗原-抗体复合物晶体学研究的方法(al lazikani et al.，1997，j.mol.biol.，273：927-948)。此外，在本领域中有时采用这两种方法的组合测定cdr。
[0071]
抗体可以是五种主要免疫球蛋白的任何一种：iga、igd、ige、igg和igm，或其亚型(同种型)(例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)，根据其重链恒定区分别为alpha、delta、epsilon、gamma和mu；为最有效地结合fcγriii(即其kd为10-7
或更小)，优选的cd39抗体为igg1和igg3同种型。
[0072]
在某些实施例中，抗体为“低岩藻糖基化修饰”，甚至为“无岩藻糖基化修饰”。“低岩藻糖基化”抗体制品指的是低聚糖链上α-1，6-岩藻糖含量低于50％的抗体制品。在“低岩藻糖基化”抗体制品中低聚糖链上α-1，6-岩藻糖含量一般低于约40％，低于约30％，低于约20％，低于约10％，或低于约5％，或低于约1％。“无岩藻糖基化”抗体其igg重链ch2结构域上连接的碳水化合物不含α-1，6-岩藻糖。
[0073]
本文中使用的术语“人源化抗体”指的是非-人类(例如鼠)抗体的形式，包含最小限度非-人类序列的特异性免疫球蛋白链，嵌合免疫球蛋白，或其片段。通常人源化抗体为人免疫球蛋白，其cdr残基以具有期望专属性、亲和力和/或结合能力的非-人类种属(例如小鼠、大鼠、兔或仓鼠)的cdr残基取代。在部分情况下，人免疫球蛋白的fv框架区残基以非-人类种属抗体相应的残基取代。人源化抗体可通过取代fv框架区和/或取代的非-人类残基内的其他残基，进一步修饰人源化抗体，以改进和优化抗体的专属性、亲和力和/或结合能力。人源化抗体包含可变区，其可变区包含所有或基本上所有非-人类免疫球蛋白相应的cdr，其全部或基本上全部框架区均为人免疫球蛋白序列。在某些实施例中，可变区包含来自人免疫球蛋白序列的框架区。在某些实施例中，可变区包含来自人免疫球蛋白共有序列的框架区。人源化免疫球蛋白还可包括至少部分免疫球蛋白的恒定区或结构域(fc)，一般为人免疫球蛋白。一般认为人源化抗体不同于嵌合抗体。
[0074]
″
fc受体”或
″
fcr”指的是与免疫球蛋白fc区结合的受体。与igg抗体结合的fcrs包
含fcγr家族受体，包括这些受体的等位基因变异体和可变剪接形式。fcγr家族包括三种激活(在小鼠中为fcγri、fcγriii和fcγriv；在人中为fcγria、fcγriia和fcγriiia)和一种抑制(fcγriib)受体。
[0075]“fcγriii结合单元”为肽、蛋白质、核酸或其他单元，在与抗-cd39抗体的抗原结合部位发生结合后，能够与fcγriii(cd16)结合并介导抗体-介导的靶向吞噬。
附图说明
[0076]
图1a-1e-抗人cd39抗体通过胞啃(trogocytosis)降低cd39阳性人b淋巴母细胞(hcc1739bl)上的cd39表达
[0077]
图2a-2e-抗人cd39抗体诱导cd39脱落或抗原内化
[0078]
图3a-3e-利用过表达人cd39的cho细胞(cho-hcd39)和celigo原位流式细胞仪测定pb1-5抗体的亲和力
[0079]
图4a-4e-利用过表达食蟹猴cd39的cho细胞(cho-cynocd39)和celigo原位流式细胞仪分析，测定pb1-5抗体的亲和力
[0080]
图5a-5e-利用流式细胞术和cd39阳性人b淋巴母细胞(hcc1739bl)测定pb1-5抗体的亲和力
具体实施方式
[0081]
定义
[0082]
术语“表位”和“抗原决定簇”在本文中可以互换使用，指的是能够被特定抗体识别并特异性结合的抗原部位。如抗原为多肽，其表位可由连续的氨基酸组成，也可以由蛋白质三级折叠后并列的非连续氨基酸组成。由连续氨基酸形成的表位(又称为线性表位)一般在蛋白质变性后仍能保留；而有蛋白质三级折叠形成的表位(又称为构象表位)一般在蛋白质变性后失去。表位通常包含具有独特空间构象的至少3个，更常见包括至少5、6、7或8-10个氨基酸。
[0083]
在本文中，术语“特异性结合”或“具有特异性”指的是靶点与抗体之间的结合是可测定的和可重现的相互作用，也就是在包含生物分子的异质性分子群中所含的靶点是决定性的。例如，与靶点(可能是表位)特异性结合的抗体，其结合亲和力、亲合力比其他靶点更大，结合更加容易，及持续时间更长。在其中一个实施例中，采用如放射免疫分析(ria)测定，发现抗体与无关靶点的结合程度不到抗体与其靶点结合的10％。在某些实施例中，与靶点特异性结合抗体的解离常数(kd)低于或等于1μm、100nm、10nm、1nm，或甚至低于0.1nm。在某些实施例中，抗体与存在于不同物种的蛋白质中的一个表位特异性结合。在另外的实施例中，特异性结合包含但不要求专一性结合。
[0084]
本文中的术语“多聚核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”是可互换使用的，指的是任何长度的核苷酸聚合物，包括dna和rna。核苷酸可以是脱氧核糖核酸、核糖核酸、修饰核酸或碱基，和/或其类似物，或可通过dna或rna聚合酶加入聚合物中的任何反应物。
[0085]
在本中使用的术语“核酸分子编码”、“dna序列编码”和“dna编码”，指的是沿一股脱氧核糖核酸的核苷酸顺序或序列。这些脱氧核糖核苷酸的顺序决定了多肽链(蛋白质)上的氨基酸顺序。因此，核酸的顺序编码了氨基酸的顺序。
[0086]
在本文中使用的术语“可操作地连接”指的是在调控序列与异源性核酸序列之间的功能性连接，连接使得后者被表达。例如，当第一个核酸序列与第二个核酸序列之间存在功能性关系时，第一个核酸序列和第二个核酸序列为可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。一般可操作地连接的dna序列是连续的，必要时可在相同的读码框内加入两个蛋白质编码区。
[0087]
在本文中使用的术语“启动子”定义为在细胞转录特定多聚核苷酸序列或引入序列时要求合成装置识别的启动子dna序列。
[0088]“检查点分子”指的是组织和/或免疫分析表达的蛋白质，能够以依赖于检查点分子的表达水平的方式降低免疫应答反应。在这些蛋白质被阻断是，免疫系统的“刹车”被松开，例如t细胞能够更加有效的杀死癌细胞。例如在t细胞或癌细胞上发现的检查点蛋白质包括pd-1/pd-l1和ctla-4/b7-1/b7-2、pd-l2、nkg2a、kir、lag-3、tim-3、cd96、vista和tigit。
[0089]“检查点抑制剂”指的是可以逆转检查点分子免疫抑制信号的药物实体。
[0090]“协同刺激分子”指的是免疫细胞如t细胞的同源结合伴侣，可特异性结合协同刺激配体，从而介导协同刺激信号，例如但不限于增殖。协同刺激分子是除抗原受体或配体外的细胞表面分子，可促进有效的免疫应答。协同刺激分子包括但不限于mhci分子，btla受体和toll配体，及ox40、cd27、cd28、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)和4-1bb(cd137)。例如协同刺激分子包括但不限于：cds、icam-1、gitr、baffr、hvem(lightr)、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd160、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11a、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、nkg2d、nkg2c、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244，2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、cd19a和cd83配体。
[0091]“协同刺激激动剂”指的是可激活(激动)协同刺激分子的药物实体，如协同刺激配体的作用，可产生免疫刺激信号，或者增强免疫应答的效力或效能。
[0092]“化疗药物”指的是可用于治疗癌症的化合物。化疗药物的示例包含烷化剂类如塞替派和环磷酰胺(cytoxan)；磺酸烃基酷类如白消安、丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类如苯佐替派、卡波醌、美妥替派和乌瑞替派；乙撑亚胺类和和甲基蜜胺类类，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺；番荔枝内酯类(尤其是布拉他辛和布拉他辛酮；delta-9-四氢大麻酚(屈大麻酚，marinol)；beta-拉帕醌；拉帕醇；秋水仙素类；白桦脂酸；喜树碱(包括合成类似物托泊替康(hycamtin)，cpt-11(伊立替康，camptosar)、乙酰喜树碱、东莨菪亭和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素；callystatin；cc-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新的合成类似物)；鬼臼毒素；鬼臼酸；替尼泊苷；隐藻素类(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀；duocarmycin(包括合成类似物：kw-2189和cb1-tm1)；艾榴塞洛素；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素；氮芥类，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、双氯乙基甲胺、帮酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝脲类，如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、
洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素类，如烯二炔类抗生素(例如加利车霉素，尤其是加利车霉素gammali和加利车霉素omegail(参见nicolaou et al.，angew.chem intl.ed.engl.，33：183-186(1994))；蒽环类抗生素，包括dynemicina；埃斯波霉素；以及新制癌素发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素、放线菌素、氨茴霉素、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素c、carabicin、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素d、柔红霉素、地托比星、6-二氮-5-氧-l-正亮氨酸、多柔比星(包括adriamycin、吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、盐酸多柔比星脂质体注射液(doxil)和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素；丝裂霉素类，如丝裂霉素c、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、potfiromycin、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢剂类，如甲氨蝶呤、吉西他滨gemzar)、替加氟((uftoral)、卡培他滨(xeloda)、埃坡霉素和5-氟尿嘧啶(5-fu)；叶酸类似物，如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸、三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷和伊马替尼(2-苯基氨基嘧啶衍生物)，以及其他c-kit抑制剂；抗肾上腺类，如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；地美可辛；地吖醌；elfomithine；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟脲；香菇多糖；氯尼达明；美登木素生物碱类，如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；psk多糖复合物(jhs natural products，eugene，oreg.)；雷佐生；根霉素；西索菲兰；螺旋锗；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2’，2’，2
”-
三氯三乙胺；单端孢菌素类(尤其是t-2毒素、疣孢菌素a、杆孢菌素a和蛇行菌素；乌拉坦；长春地辛(eldisine，fildesin)；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(
″
ara-c
″
)；塞替派；紫杉烷类，如紫杉醇(taxol)、白蛋白结合型紫杉醇纳米颗粒制剂(abraxanetm)和多西他塞(taxotere)；苯丁酸氮芥；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，如顺铂和卡铂；长春碱(velban)；铂；依托泊苷(etoposide)(vp-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；奥沙利铂；亚叶酸；长春瑞滨；能灭瘤；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；伊本膦酸盐；拓扑异构酶抑制剂rfs 2000；二氟甲基鸟氨酸(dmfo)；类视黄酸，如视黄酸；上述物质任何在药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或多种上述物质的组合，如chop(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写)和folfox(奥沙利铂(eloxatin)联合5-fu和亚叶酸的治疗方案的缩写)。
[0093]
此定义还包括作用为调节、降低、阻断、或抑制可促进癌生长的激素效果的抗激素剂，且常常采用系统或全身治疗形式。它们自身可以是激素。其示例包括抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂类(serm)，包括如他莫昔芬(包括报(包括nolvadex他莫昔芬)、雷洛昔芬(evista)、屈洛昔芬，4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、那洛昔芬、ly117018、奥那司酮和托瑞米芬(fareston)；抗孕酮类；雌激素受体下调剂类(erd)；雌激素受体拮抗剂，如氟维司群(faslodex)；功能为抑制或关闭卵巢的药物，如促黄体生成激素释放激素(lhrh)激动剂，诸如醋酸亮丙瑞林(lupron和eligard)、醋酸戈舍瑞林、醋酸布舍瑞林和曲普瑞林；抗雄激素类，如氟他米特、尼鲁米特和比卡米特；及抑制在肾上腺内调节雌激素生成芳香酶的芳香酶
抑制剂，如4(5)-咪唑、氨鲁米特、醋酸甲地孕酮(megase)、依西美坦((aromasin)、福美坦、法倔唑、伏罗唑(rivisor)、来曲唑(femara)和阿那曲唑(arimidex)。另外，此化疗药物定义还包括二膦酸酸类，如氯膦酸盐(例如bonefos或ostac)、依替膦酸钠(didrocal)、ne-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(zometa)、阿伦膦酸帮(fosamax)、帕米膦酸盐(aredia)、替鲁膦酸盐(skelid)或利塞膦酸盐(actonel)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制异常细胞增殖相关信号传导途径中的基因表达的反义寡核苷酸，如例如pkc-alpha、raf、h-pas和表皮生长因子受体(egf-r)；疫苗，如theratope疫苗和基因治疗疫苗，如allovectin疫苗、leuvectin疫苗和vaxid疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如lurtotecan)；抗雌激素如氟维司群；kit抑制剂如伊马替尼或exel-0862(一种酪氨酸激酶抑制剂)；egfr抑制剂如厄洛替尼或西妥昔单抗；抗-vegf抑制剂如贝伐单抗；arinotecan；rmrh(例如abarelix)；拉帕替尼和甲苯磺酸拉帕替尼(一种erbb-2和egfr双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，又称为gw572016)；17aag(格尔德霉素衍生物，一种热休克蛋白(hsp)90poison)，及上述物质在药学可接受盐、酸或衍生物。
[0094]
在本文中使用的术语“细胞因子”一般指的是一个细胞群释放的蛋白质可作为细胞间介质作用于另外的细胞，或对产生该蛋白质的细胞产生自分泌作用。细胞因子的示例包括淋巴因子、单核因子、白介素(
″
ils
″
)；如il-1、il-1α、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il10、il-11、il-12、il-13、il-15、il-17a-f、il-18至il-29(如il-23)、il-31、包括proleukin ril-2；肿瘤坏死因子tnf-α或tnf-β、tgf-β1-3；及其他多肽因子，包括白血病抑制因子(
″
lif
″
)，睫状节神经细胞营养因子(
″
cntf
″
)、cntf-样细胞因子(
″
clc
″
)、心肌营养素(
″
ct
″
)和kit配体(
″
kl
″
)。
[0095]
在本文中使用的术语“趋化因子”指的是能够选择性诱导趋化和活化白细胞的可溶性因子(如细胞因子)。趋化因子还能引起血管生成、炎症、伤口愈合和肿瘤发生。趋化因子的例子包括il-8，这是鼠角质化细胞趋化因子(kc)的人类同源物。
[0096]
在本文中使用的术语“癌症”和“癌性的”指的是或描述一种哺乳动物的生理状况，其特征为一群细胞不受控制地生长。癌症的例子包括但不限于癌、胚细胞瘤、肉瘤和血液肿瘤如淋巴瘤和白血病。
[0097]
在本文中使用的术语“肿瘤”和“新生物”指的是由于细胞过度生长或增殖产生的任何组织团块，包括良性(非癌性的)或恶性(癌性的)，及癌前病变。肿瘤生长通常不受控制和进行性的，不会诱导或抑制正常细胞增殖。肿瘤会影响到多种细胞、组织或器官，包括但不限于膀胱、骨骼、脑部、乳房、软骨、神经胶质细胞、食道、输卵管、胆囊、心脏、肠道、肾脏、肝脏、肺、淋巴结、卵巢、胰腺、前列腺、骨骼肌、皮肤、脊髓、脾脏、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、尿道、输尿管、子宫、阴道器官或组织，或相应的细胞。肿瘤包括癌症，如肉瘤、癌、浆细胞瘤或恶性浆细胞。本发明涉及的肿瘤包括但不限于白血病(如急性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、急性骨髓性白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性骨髓性-单核细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、急性白血病、慢性白血病、慢性粒细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、真性红细胞增多症)、淋巴瘤(霍奇金和非霍奇金淋巴瘤)、原发性巨球蛋白血症、重链疾病；实体瘤，如肉瘤(例如肉瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、血管肉瘤、淋巴管内皮瘤肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、癌细胞、卵巢癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺
癌、乳头状癌、乳头状腺癌、癌、支气管癌、髓样癌、肾细胞癌、肝癌、尼罗河导管癌、绒毛膜癌、精原细胞癌、胚胎癌、威尔姆斯氏肿瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤)、食管癌、胆囊癌、肾癌、多发性骨髓瘤。所述“肿瘤”优选但不限于：胰腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、食道癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、淋巴癌、胆囊癌、肾癌白血病、多发性骨髓瘤、卵巢癌、子宫颈癌及神经胶质瘤。
[0098]
本文中的术语“转移”指的是癌症扩散或从原发灶转移至身体其他部位的过程，在新的部位发生相似的癌症病灶。“转移”或“转移中”细胞指的是失去与相邻细胞粘附接触的细胞，通过血管或淋巴液从原发病灶侵袭邻近的身体结构。
[0099]
本文中使用的术语“有效量”指的是达到治疗或预防效果的数量。
[0100]
在本文中使用的术语“治疗”指的是试图改变个体或细胞疾病自然进程的临床干预，可以是预防性干预临床病理学的进程。包括但不限于治疗或预防疾病的发生或复发，缓解症状，削弱疾病的任何直接或间接病理学后果，防止转移，减缓疾病进展的速度，改善或减轻疾病状态，或改善预后。
[0101]
术语“受试者”指的是任何动物(包括哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类动物、犬、猫科动物、啮齿类动物，及可接受特定治疗的类似动物。在本文中用于人体受试者时，术语“受试者”和“患者”通常可互换使用。
[0102]
在本文中术语“激动剂”和“激动剂的”指的是，或描述抗-cd39抗体能够直接或间接地，显著诱导、激活、促进、增加或增强靶点和/或通路的生物活性。在本文中使用的术语“激动剂”包括可部分或完全诱导、激活、促进、增加或增强目标蛋白或其他靶点活性的任何药物。
[0103]
在本文中使用的术语“拮抗剂剂”和“拮抗剂的”指的是，或描述抗-cd39抗体能够直接或间接地，部分或完全阻断、抑制、降低或抵消靶点/或通路的生物活性。在本文中使用的术语“拮抗剂剂”包括可部分或完全阻断、抑制、降低或抵消目标蛋白或其他靶点活性的任何药物。
[0104]
术语“在药学上可接受”指的是联邦政府或州政府监管部门批准或可批准，或收录在美国药典或其他公认药典内，用于动物包括人的物质。
[0105]
术语“在药学上可接受的辅料、载体或配料”或“在药学上可接受的载体”指的是可与本项发明披露的至少一种药物一起给予受试者的辅料、载体或配料，不会破坏所述药物的药理学活性，在给予足以达到治疗效果的剂量时无毒性作用。通常，本领域技术人员和美国fda认为药物制剂中的在药学上可接受的辅料、载体或配料是非活性成分。
[0106]
术语“有效量”、“治疗有效量”或“治疗效果”指的是本文所述抗-cd39抗体(如融合蛋白、溶解性受体、抗体、多肽和聚核苷酸、有机小分子或其他药物)在“治疗”受试者如哺乳动物的疾病或病变时有效的量。对于癌症或肿瘤，治疗有效量抗-cd39抗体(例如多肽、溶解性蛋白或抗体)具有治疗效果，此效果可增强免疫应答，增强抗肿瘤反应，增加免疫细胞的细胞溶解活性，增加免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，减少肿瘤细胞的数量；降低肿瘤发生、肿瘤发生频率或肿瘤发生能力；减少肿瘤干细胞的数量或频率；缩小肿瘤；减少肿瘤细胞数量；抑制或停止癌细胞侵袭至外周器官，例如包括癌细胞扩散至软组织和骨骼；抑制或
停止癌细胞转移；抑制或停止肿瘤或癌细胞生长；减轻癌症相关的一种或多种症状；降低发病率和死亡率；改善生活质量；或上述效果的组合。
[0107]
术语“治疗中”、“治疗”、“待治疗”或“待缓解”指的是(1)治疗方案治愈、减缓、减轻已诊断病理状况或疾病的症状，或减慢其进展，和(2)预防或防治方案防止或减慢目标病理状况或病变的发展。因此，需要治疗的包括患病的患者；容易发病的人；预防疾病的人。对于癌症或肿瘤，如患者出现下述一种或多种情况，则说明本项发明所述方法成功“治疗”了受试者：免疫应答增强，抗肿瘤反应增强，免疫细胞的细胞溶解活性增强，免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用增强，癌细胞数量减少或完全消失；肿瘤缩小；侵袭至外周器官的癌细胞被抑制或消失，包括扩散至软组织和骨骼；癌症或癌细胞转移被抑制或消失；癌症生长抑制或消失；特定癌症相关的一种或多种症状缓解；发病率和死亡率下降；生活质量改善；肿瘤发生下降；癌症干细胞的数量或频率下降；或上述部分效果的组合。
[0108]
本公开中采用的分子生物学方法，均可以参见“最新分子生物学实验方法汇编(current protocols in molecular biology，wiley出版)”，“分子克隆实验指南(molecular cloning：a laboratory manual，冷泉港实验室出版)”等公开出版物中记载的相应方法。
[0109]
实施例
[0110]
本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
[0111]
实施例1：抗原制作
[0112]
从genscript购买表达人entpd1(cd39)的质粒。该质粒在genscript的克隆标号为ohu15001。该质粒的名称为pcdna3.1+/c-(k)dyk。其编码区序列对应national center for biotechnology information(ncbi)数据库中的nm_001776.5。具体的编码区核苷酸序列为seq id no 11和氨基酸序列seq id no 12。在10cm培养皿中接种raji(atcc)细胞并培养。待细胞浓度达到1x 106/ml时进行转染。转染时首先使用opti-mem培养基分别溶解14μg pcdna3.1+/c-(k)dyk和15μl lipofectamine 2000(thermofisher scientific)。然后将两者混合均匀，并在室温下静置5分钟。在此期间将raji细胞重悬到opti-mem的培养基中并放入6孔板中。五分钟结束后将含有质粒和lipofectamine 2000的opti-mem的培养基混合，并加入到含有raji细胞的六孔板中。然后将培养板放入细胞培养箱孵育48小时。孵育结束后，取部分细胞，用抗人cd39荧光抗体对其染色，并用流式细胞仪检测raji表面cd39的表达量。若细胞表面高表达人cd39，则可将该细胞扩大培养用作免疫动物的抗原。
[0113]
seq id no 11：
[0114][0115][0116]
seq id no 12：
[0117][0118]
实施例2：利用过表达人cd39的raji细胞免疫兔子并检测兔子的血清中是否产生了抗人cd39的抗体
[0119]
收集1x 107个过表达人cd39的raji细胞。并将这些细胞通过兔的耳缘静脉注射入兔的血管内。一周后，从兔子的耳缘静脉取血，提取血清。并用elisa的方法检测血清中是否含有抗人cd39的抗体。具体的elisa方法为，先用重组人entpd1/cd39(r&d systems)包被elisa板，4℃孵育过夜。次日，用含有牛血清的pbs封闭elisa板。随后加入待测血清，并在室温摇床上放置2小时，在用pbst清洗elisa板。清洗后往elisa板中加入携带有hrp的goat anti-rabbit igg。室温下在摇床上放置1小时。之后再次清洗，并加入四甲基联笨胺进行显色，最后用硫酸终止反应并检测a450。在获得检测结果的次日，再次使用1x 107个过表达人cd39的raji细胞免疫兔子。并在免疫之后一周再次用elisa的方法检测兔血清中抗人cd39抗体的含量。结果显示兔子血清中含有大量抗人cd39抗体。
[0120]
实施例3：分离、提取扩增兔脾脏中的单个b细胞，及筛选能够分泌抗人cd39抗体的阳性克隆
[0121]
手术取出接受了细胞免疫的兔子的脾脏。将脾脏在70μm筛子上轻柔碾碎。用细胞培养基清洗筛子，并收取过滤后的细胞悬液。利用红细胞裂解液去除细胞悬液中的红细胞。随后计数细胞浓度，并按每孔0.8个细胞的量，将脾脏细胞悬液中的细胞放入384孔板中培养。随后向384孔板中加入含有细胞因子的培养基，促进b细胞增殖。48小时后收取384孔板中细胞的上清液，并用elisa的方法检测上清中是否含有抗人cd39的抗体。具体的elisa方法为，先用重组人entpd1/cd39(r&d systems)包被elisa板，4℃孵育过夜。次日，用含有牛血清的pbs封闭elisa板。随后加入待测上清，并在室温摇床上放置2小时，在用pbst清洗elisa板。清洗结束后，向elisa板中加入携带有hrp的goat anti-rabbit igg。室温下在摇床上放置1小时。之后再次清洗，并加入四甲基联笨胺进行显色，最后用硫酸终止反应并检测a450。
[0122]
实施例4：收集阳性克隆细胞，进行测序，获得抗体基因序列
[0123]
收集阳性克隆细胞，利用trizol(thermofisher scientific)裂解细胞，然后用异丙醇沉淀，分离rna；最后以70％乙醇洗涤，得到细胞总rna。采用smarter race 5’/3’(takara)试剂盒进行逆转录反应，将所得总rna转化为第一链cdna。在第一链cdna的基础上利用pcr扩增出抗体的基因序列，并通过凝胶电泳觉回收试剂盒纯化pcr产物。利用t4连接酶，将纯化的抗体基因片段与t载体相连接。得到含有抗体的基因的载体后，通过转化将其进一步扩大。具体方法是，将含有抗体序列的t载体转入感受态中，在37℃中培养过夜。通过蓝白斑筛选阳性克隆。挑选白色阳性菌落，扩大培养。最后抽提细菌中的质粒dna，并进行sanger测序获得抗体序列。
[0124]
实施例5：将抗体基因序列转入载体，并在细胞中表达抗体
[0125]
对于纯兔单克隆抗体，在获得抗体序列后，直接委托genscript公司合成抗体的重链和轻链，并分别嵌入两个pcdna3.4质粒中。然后将两个质粒同时转染至expi293f
tm
(thermofisher scientifc)中。在转染后48小时收取细胞上清液，用protein a亲和柱分离纯化抗体，再进行透析进一步去除小分子杂质，最后用紫外光吸收法检测抗体的浓度。
[0126]
对于兔人嵌合的单克隆抗体，我们在抗体核苷酸序列层面上将兔单克隆重链的ch2和ch3及其hinge结构域置换为人抗体重链的ch2和ch3及其hinge结构域。并委托genscript公司合成重组后的重链并直接嵌入pcdna3.4质粒中。然后再将该质粒和含有兔单克隆抗体轻链的pcdna3.4质粒同时转染至expi293f
tm
(thermofisher scientific)中。并在转染后的48小时收取细胞上清液，提纯，获得抗体。
[0127]
实施例6：抗人cd39抗体的功能特征测试
[0128]
抗人cd39抗体可通过胞啃(trogocytosis)降低cd39阳性人b淋巴母细胞(hcc1739bl)上的cd39表达。将thp-1细胞(单核细胞)与hcc1739bl细胞共培养。共培养的比例为thp-1∶hcc1739bl＝3∶2。与此同时设有一组是hcc1739bl细胞单独培养，作为对照组。向实验组和对照组加入嵌合人fc(igg1)的兔抗人cd39抗体(4μg/ml)，或人igg1同种型对照(4μg/ml)，培养43小时或2小时。采用识别不同抗原表位的染色抗体(其识别表位不同于嵌合抗体)，检测hcc1739bl细胞上的cd39表达。采用cytoflexlx流式细胞仪，通过cd20染色分析thp-1和hcc1739bl细胞。分析结果如图1a-1e所示。图1a-1e中的左图为嵌合抗体和人igg1对照抗体对共培养细胞上cd39表达量影响的比较。图1a-1e中的右图为二种抗体对hcc1739bl单独培养细胞上cd39量的影响。结果显示抗人cd39抗体可显著降低cd45阳性免
疫细胞上cd39的表达量。
[0129]
实施例7：抗人cd39抗体的功能特征测试
[0130]
抗人cd39抗体可诱导cd39脱落或抗原内化。往表达cd39的hcc1739bl细胞中加入嵌合人fc(igg1)的兔抗人cd39抗体(2μg/ml)，在细胞培养箱中孵育指定的时间。孵育之后，洗涤细胞两次，然后以二抗染色(驴特异性抗人igg，fc片段的抗体，该二抗所带荧光标计alexa flour 488)。最后在cytoflexlx流式细胞仪上对样品进行分析。分析结果见图2a-2e。分析显示抗人cd39抗体可显著诱导cd39脱落或抗原内化，造成荧光强度下降。
[0131]
实施例8：pb1-5抗体的亲和力分析
[0132]
利用过表达人cd39的cho细胞(cho-hcd39)和celigo原位流式细胞仪测定pb1-5抗体的亲和力。梯度稀释各嵌合人fc(igg1)的兔抗人cd39抗体(从5μg/ml开始)，然后在室温下与cho-hcd39细胞孵育30分钟，接着用celigo原位流式细胞仪对样品进行分析。分析结果参见图3a-3e，及表1。
[0133]
实施例9：pb1-5抗体的亲和力分析
[0134]
利用过表达食蟹猴cd39的cho细胞(cho-cynocd39)和celigo原位流式细胞仪分析，测定pb1-5抗体的亲和力。梯度稀释各嵌合人fc(igg1)的兔抗人cd39抗体(从5μg/ml开始)，然后在室温下与cho-cynocd39细胞孵育30分钟，接着用celigo原位流式细胞仪对样品进行分析。分析结果参见图4a-4e，及表1。
[0135]
实施例10：pb1-5抗体的亲和力分析
[0136]
利用流式细胞术和cd39阳性人b淋巴母细胞(hcc1739bl)测定pb1-5抗体的亲和力。梯度稀释各嵌合人fc(igg1)的兔抗人cd39抗体(从10μg/ml开始)，然后在4℃与hcc1739bl细胞孵育30分钟，接着用cytoflexlx流式细胞仪对样品进行分析。分析结果参见图5a-5e，及表1。
[0137]
表1 利用流式细胞术测定的cho-hcd39和cho-cynocd39细胞，及cd39阳性b淋巴母细胞(hcc1739bl)测定的亲和力数据表
[0138]
克隆编号cho-hcd39cho-cynocd39hcc1739blpb11.8nm2.6nm2.2nmpb2987pm2.8nm2nmpb31.5nm2.0nm2.3nmpb41.8nm2.6nm1.7nmpb51.8nm2.9nm1.7nm
[0139]
本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例，而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。