1.一种利用重组胞内rna支架固定重组酶促进细胞催化阿洛醇生产的方法,步骤是:
(1)构建用于细胞内重组蛋白固定的三角形网状rna支架;
合成一段如seqidno.6所示的dna序列,利用引物1和2将质粒pet22b线性化,根据同源重组构建重组质粒pet22b-scaffold;将同源重组液转化到dh5α感受态细胞中,通过菌落pcr验证获得阳性转化子,再提取重组质粒pet22b-scaffold,通过重组质粒转化到大肠杆菌中实现支架的构建;其中,所述引物1和2如下:
引物1:5’>ccctatagtgagtcgtattaacctaatgcaggtcccggaaga<3’,下划线序列为与pet22b质粒重叠序列;
引物2:5’>ccaatggcgcgccgagcttggcgtaatgctcgccacttcgggctcatgagcg<3’,下划线序列为与pet22b质粒重叠序列;
(2)构建三角形网状rna支架锚定核糖醇脱氢酶和甲酸脱氢酶的重组质粒;
从genebank基因库中查询获得的核糖醇脱氢酶基因片段和甲酸脱氢酶基因片段,利用大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化,确定seqidno.4所示的pp7的适配体序列和seqidno.5所示的biv-tat的适配体序列,将biv-tat标记fdh,将pp7标记rdh,利用引物5和6合成pp7-rdh和biv-tat-fdh基因,利用引物7,引物8通过pcr扩增得到核糖醇脱氢酶基因序列,利用引物9,引物10通过pcr扩增得到甲酸脱氢酶基因序列,同时利用引物3和4将pacycduet1质粒进行线性化,并将线性化的pacycduet1质粒与合成得到的pp7-rdh/biv-tat-fdh基因进行同源重组,通过菌落pcr验证获得将目标基因亚克隆到质粒pacycduet1中的重组菌株,对获得阳性转化子提取质粒,所获得的重组质粒命名为pacycduet1-pp7-rdh::biv-tat-fdh;将此构建的重组质粒转化到大肠杆菌blstar细胞中,并通过iptg诱导两种酶融合体的表达,确认重组质粒的正确性;其中,所述涉及的引物序列如下:
引物3:5’>ttaacctaggctgctgccac<3’,下划线序列为与pacycduet1质粒重叠序列;
引物4:5’>tcctgatcctttttcgaactgc<3’,下划线序列为与pacycduet1质粒重叠序列;
引物5:5’>cagcggtggcagcagcctaggttaattacacggcttttttgaattttg<3’下划线序列为与pacycduet1质粒重叠序列。
引物6:5’>agccacccgcagttcgaaaaaggatcaggaatgtccaaaaccatcgttctttcggt<3’下划线序列为与pacycduet1质粒重叠序列;
引物7:5’>ggatcaggaggaggaggatcaggaggaatggccattagcctggaaaataagg<3’下划线序列为与核糖醇脱氢酶基因重叠序列;
引物8:5’>tttcgattatgcggccgtgtacaatacgattacagatcaacactattcggcagaat<3’下划线序列为与核糖醇脱氢酶基因重叠序列;
引物9:5’>gtcatcaccatcatcaccacggatcaggaatggcaaaagtgctgtgcgtgctgt<3’下划线序列为与甲酸脱氢酶基因重叠序列;
引物10:5’>ttgctcagcggtggcagcagcctaggttaattacacggcttttttgaattttg<3’下划线序列为与甲酸脱氢酶基因重叠序列;
(3)构建利用三角形网状rna支架固定重组酶催化阿洛醇的大肠杆菌工程菌;
将重组质粒pacycduet1-pp7-rdh::biv-tat-fdh及pet22b-scaffold共同转化到大肠杆菌blstar中构建工程菌株,并进行鉴定验证即获得利用三角形网状rna支架固定核糖醇脱氢酶和甲酸脱氢酶催化阿洛醇的大肠杆菌工程菌,该工程菌包含大肠杆菌blstar的全基因组,重组质粒pet22b-scaffold和重组质粒pacycduet1-pp7-rdh::biv-tat-fdh;
(4)利用步骤(3)构建的大肠杆菌工程菌发酵生产阿洛醇;
活化步骤(3)构建的大肠杆菌工程菌菌种,按体积比1~2%的量将活化后的菌种接种到每100ml的发酵培养基中,先以37℃和200rpm培养,培养3h后,当培养菌液的od为0.6~0.8时,加入iptg至终浓度为1mm,并将发酵条件改变为28℃和140rpm,继续培养6~9h;然后将培养的菌液进行收菌,采用全细胞转化法,将d-阿洛酮糖转化为阿洛醇,通过标准曲线确定阿洛醇的产量并验证大肠杆菌工程菌内已将核糖醇脱氢酶和甲酸脱氢酶锚定在rna支架上;其中,所述发酵培养基的配方是:每100ml的发酵培养基中,含1g胰蛋白胨、0.5g酵母提取物、1gnacl、0.5g葡萄糖、终浓度为100μg/ml的氯霉素和氨苄青霉素、20mm的mgcl2。
2.根据权利要求1所述的利用重组胞内rna支架固定重组酶促进细胞催化阿洛醇生产的方法,其特征在于:所述用于细胞内重组蛋白固定的三角形网状rna支架是由二维的三角形网状rna支架与seqidno.4所示的pp7的适配体序列和seqidno.5所示的biv-tat的适配体序列组成,该用于细胞内重组蛋白固定的三角形网状rna支架的总核苷酸序列如seqidno.6所示;其中所述二维的三角形网状rna支架是由以3',5'-磷酸二酯键连接seqidno.1、seqidno.2和seqidno.3所示单链rna的核苷酸序列构成回文序列在细胞内形成三角形支架单元,该三角形支架单元中的每条seqidno.1、seqidno.2和seqidno.3所示单链rna的核苷酸序列又分别与相邻的三角形支架单元中与之完全相同的单链rna的核苷酸序列根据碱基配对形成rna双链,并以此方式不断配对形成rna双链,在细胞内构成了空间上呈二维的三角形网状rna支架。
3.一种利用三角形网状rna支架固定核糖醇脱氢酶和甲酸脱氢酶催化阿洛醇的大肠杆菌工程菌,其特征在于:所述工程菌是以大肠杆菌blstar为出发菌株,通过构建重组质粒pet22b-scaffold和重组质粒pacycduet1-pp7-rdh::biv-tat-fdh获得,该工程菌包含大肠杆菌blstar的全基因组,重组质粒pet22b-scaffold和重组质粒pacycduet1-pp7-rdh::biv-tat-fdh。
4.一种适于利用三角形网状rna支架固定核糖醇脱氢酶和甲酸脱氢酶催化阿洛醇的大肠杆菌工程菌的发酵培养基,其特征在于:所述发酵培养基的配方是:每100ml的发酵培养基中,含1g胰蛋白胨、0.5g酵母提取物、1gnacl、0.5g葡萄糖、终浓度为100μg/ml的氯霉素和氨苄青霉素、20mm的mgcl2。