本发明涉及重金属污染治理技术领域，具体属于一种微生物土壤修复剂的制备方法及其应用。
背景技术：
土壤是指陆地表面具有肥力、能够生长植物的疏松表层，其厚度一般在2m左右，土壤不但为植物生长提供机械支撑能力，并能为植物生长发育提供所需要的水、肥、气、热等肥力要素。近年来，由于人口急剧增长，工业迅猛发展，固体废物不断向土壤表面堆放和倾倒，有害废水不断向土壤中渗透，汽车排放的废气，大气中的有害气体及飘尘不断随雨水降落在土壤中。农业化学水平的提高，使大量化学肥料及农药散落到环境中，导致土壤遭受非点源污染的机会越来越多，其程度也越来越严重，在水土流失和风蚀作用等的影响下，污染面积不断扩大。当土壤中有害物质过多，超过土壤的自净能力，引起土壤的组成、结构和功能发生变化，微生物活动受到抑制，有害物质或其分解产物在土壤中逐渐积累，通过生物循环途径被人体吸收，达到危害人体健康的程度，就是土壤污染。
重金属污染土壤的修复主要基于2种策略：一是去除化，将重金属从土壤中去除，达到清洁土壤的目的；二是固定化，将重金属固定在土壤中限制其释放，从而降低其风险。近年来，关于重金属污染土壤的修复技术研究取得了长足发展，按照工艺原理主要分为物理/化学修复、生物修复和农业生态修复。
近年来利用微生物对土壤进行修复的方法研究越来越多，但是利用发酵工程技术生产出微生物活菌制剂用于重金属污染土壤的修复在国内鲜有报道。
技术实现要素：
本发明的目的是提供了一种微生物土壤修复剂的制备方法及其应用，克服了现有技术的不足，通过高耐镉菌株的活菌制备土壤修复剂，可实现改善土壤环境、有效的降低土壤中的镉含量。
为解决上述问题，本发明所采取的技术方案如下：
一种微生物土壤修复剂的制备方法，包括如下工艺步骤：
(1)选取由重金属污染的土壤中分离出的高耐镉菌株qn-3，经扩大培养制成种子液；
(2)在无菌条件下，将种子液按10％的接种量接种于液体发酵培养基中，在28-32℃进行液体种子扩大发酵培养3-5d制成液体菌液；
(3)称取0.05％-0.3％w/v的吐温-20、0.1％-0.5％w/v的黄原胶、1％-5％w/v的甘油、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和硫酸镁，混合均匀后再加入无菌水定容，制得保护剂；
(4)在高耐镉菌株qn-3的液体菌液中按照液体菌液：保护剂的体积比＝0.5-1:1的比例加入保护剂，混匀后制成微生物土壤修复剂，所述微生物土壤修复剂中高耐镉菌株qn-3有效活菌含量不低于2亿个/毫升。
进一步，所述高耐镉菌株qn-3的筛选方法为：选取多种重金属污染土壤样品制成土壤悬液，取其上清液均匀涂布到含100mg/l氯化镉的固体蛋白胨培养基分别挑取单个菌落，采用平板划线分离法将菌落分别种到镉浓度为100、150、200mg/l的固体培养基，然后从中筛选出耐镉性较强的高耐镉菌株，对其单菌落连续4次采用平板划线分离法进行纯化，将纯化所得菌株依次接种到含镉浓度分别为250-24000mg/l的系列浓度梯度的同种筛选培养基上，室温下进行培养，挑选出抗高浓度镉的菌株，得到高耐镉菌株qn-3。
进一步，所述高耐镉菌株qn-3于2018年05月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，菌种保藏号为gdmccno：60378。
进一步，所述步骤(2)中液体培养基为：蛋白胨27-33g，酵母粉9-11g，葡萄糖27-33g，吐温-800.9-1.1ml，柠檬酸三铵1.8-2.2g，七水硫酸镁0.6-0.8g，一水硫酸锰0.045-0.055g，碳酸钙9.0-11.0g；ph调至6.9-7.3。
进一步，所述步骤(3)中保护剂各组分的重量份数为：吐温-20200-240份、黄原胶1-8份、甘油4-10份、磷酸氢二钠0.2-0.8份和磷酸二氢钾和硫酸镁0.1-0.5份，余量为无菌水。
根据上述的一种微生物土壤修复剂制备方法及其应用，所述微生物土壤修复剂应用包括以下应用方法：
a.用旋耕机翻耕镉污染土壤表层厚10-18cm的土壤，保持土壤透气性；
b.加水灌溉保持土壤水分在60％—80％，选择环境温度在10-30℃，做好遮阳措施，将微生物土壤修复剂与水按1：100的质量比进行稀释，将稀释后的微生物土壤修复剂按30-60l/亩的用量均匀喷施到土壤中；
c.放置30天后，重复步骤b的操作进行二次喷药，微生物土壤修复剂的用量和用法均与步骤b相同，再放置30天。
进一步，在进行所述步骤a的翻耕之前，先采用网格多点法进行土壤样品采集，然后对所采集的土壤样品的镉含量进行测定。
本发明与现有技术相比较，本发明的实施效果如下：
本发明所述一种微生物土壤修复剂的制备方法及其应用，通过高耐镉菌株的活菌制备土壤修复剂，可实现改善土壤环境、有效地降低土壤中的镉含量；在菌剂内添加保护剂，可为微生物提供有效的营养元素，使得修复后的土壤可用作农业耕地。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明不仅限于这些实例，在为脱离本发明宗旨的前提下，所为任何改进均落在本发明的保护范围之内。
一种微生物土壤修复剂的制备方法，包括如下工艺步骤：
(1)选取由重金属污染的土壤中分离出的高耐镉菌株qn-3，经扩大培养制成种子液；
(2)在无菌条件下，将种子液按10％的接种量接种于液体发酵培养基中，在28-32℃进行液体种子扩大发酵培养3-5天制成液体菌液；
(3)称取0.05％-0.3％w/v的吐温-20、0.1％-0.5％w/v的黄原胶、1％-5％w/v的甘油、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和硫酸镁，混合均匀后再加入无菌水定容，制得保护剂；
(4)在高耐镉菌株qn-3的液体菌液中按照液体菌液：保护剂的体积比＝0.5-1:1的比例加入保护剂，混匀后制成微生物土壤修复剂，微生物土壤修复剂中高耐镉菌株qn-3有效活菌含量不低于2亿个/毫升。
高耐镉菌株qn-3的筛选方法为：选取多种重金属污染土壤样品制成土壤悬液，取其上清液均匀涂布到含100mg/l氯化镉的固体蛋白胨培养基分别挑取单个菌落，采用平板划线分离法将菌落分别种到镉浓度为100、150、200mg/l的固体培养基，然后从中筛选出耐镉性较强的高耐镉菌株，对其单菌落连续4次采用平板划线分离法进行纯化，将纯化所得菌株依次接种到含镉浓度分别为250-24000mg/l的系列浓度梯度的同种筛选培养基上，室温下进行培养，挑选出抗高浓度镉的菌株，得到高耐镉菌株qn-3。
高耐镉菌株qn-3于2018年05月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，菌种保藏号为gdmccno：60378，提议的分类学名称：cystobasidiunoligophagu，保藏单位地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院实验大楼5楼。
步骤(2)中液体培养基为：蛋白胨27-33g，酵母粉9-11g，葡萄糖27-33g，吐温-800.9-1.1ml，柠檬酸三铵1.8-2.2g，七水硫酸镁0.6-0.8g，一水硫酸锰0.045-0.055g，碳酸钙9.0-11.0g；ph调至6.9-7.3。
步骤(3)中保护剂各组分的重量份数为：吐温-20200-240份、黄原胶1-8份、甘油4-10份、磷酸氢二钠0.2-0.8份和磷酸二氢钾和硫酸镁0.1-0.5份，余量为无菌水。
根据上述的一种微生物土壤修复剂制备方法及其应用，微生物土壤修复剂应用包括以下应用方法：
a.用旋耕机翻耕镉污染土壤表层厚10-18cm的土壤，保持土壤透气性；
b.加水灌溉保持土壤水分在60％—80％，选择环境温度在10-30℃，做好遮阳措施，将微生物土壤修复剂与水按1：100的质量比进行稀释，将稀释后的微生物土壤修复剂按30-60l/亩的用量均匀喷施到土壤中；
c.放置30天后，重复步骤b的操作进行二次喷药，微生物土壤修复剂的用量和用法均与步骤b相同，再放置30天。
在进行步骤a的翻耕之前，先采用网格多点法进行土壤样品采集，然后对所采集的土壤样品的镉含量进行测定。
实施例1
本实施例按照本发明的方法制备该微生物土壤修复剂，实施例1的液体培养基为：蛋白胨27g，酵母粉9g，葡萄糖27g，吐温-800.9ml，柠檬酸三铵1.8g，七水硫酸镁0.6g，一水硫酸锰0.045g，碳酸钙9.0g；
保护剂各组分的重量g数为：吐温-20200g、黄原胶1g、甘油4g、磷酸氢二钠0.2g和磷酸二氢钾和硫酸镁0.1g，余量为无菌水，定容至1000ml；
使用时，旋耕机翻耕镉污染土壤表层厚10cm的土壤；稀释后的微生物土壤修复剂按30l/亩的用量均匀喷施到土壤中。
实施例2
本实施例按照本发明的方法制备该微生物土壤修复剂，实施例2的液体培养基为：蛋白胨30g，酵母粉10g，葡萄糖30g，吐温-801.0ml，柠檬酸三铵2.0g，七水硫酸镁0.7g，一水硫酸锰0.05g，碳酸钙10g；
保护剂各组分的重量g数为：吐温-20220g、黄原胶4.5g、甘油7g、磷酸氢二钠0.5g和磷酸二氢钾和硫酸镁0.3g，余量为无菌水，定容至1000ml；
使用时，旋耕机翻耕镉污染土壤表层厚10cm的土壤；稀释后的微生物土壤修复剂按30l/亩的用量均匀喷施到土壤中。
实施例3
本实施例按照本发明的方法制备该微生物土壤修复剂，实施例2的液体培养基为：蛋白胨33g，酵母粉11g，葡萄糖33g，吐温-801.1ml，柠檬酸三铵2.2g，七水硫酸镁0.8g，一水硫酸锰0.055g，碳酸钙11g；
保护剂各组分的重量份数为：吐温-20240g、黄原胶8g、甘油10g、磷酸氢二钠0.8g和磷酸二氢钾和硫酸镁0.8g，余量为无菌水，定容至1000ml；
使用时，旋耕机翻耕镉污染土壤表层厚10cm的土壤；稀释后的微生物土壤修复剂按30l/亩的用量均匀喷施到土壤中。
实施例4
本实施例按照本发明的方法制备该微生物土壤修复剂，实施例1的液体培养基为：蛋白胨27g，酵母粉9g，葡萄糖27g，吐温-800.9ml，柠檬酸三铵1.8g，七水硫酸镁0.6g，一水硫酸锰0.045g，碳酸钙9.0g；
保护剂各组分的重量g数为：吐温-20200g、黄原胶1g、甘油4g、磷酸氢二钠0.2g和磷酸二氢钾和硫酸镁0.1g，余量为无菌水，定容至1000ml；
使用时，旋耕机翻耕镉污染土壤表层厚14cm的土壤；稀释后的微生物土壤修复剂按45l/亩的用量均匀喷施到土壤中。
实施例5
本实施例按照本发明的方法制备该微生物土壤修复剂，实施例1的液体培养基为：蛋白胨27g，酵母粉9g，葡萄糖27g，吐温-800.9ml，柠檬酸三铵1.8g，七水硫酸镁0.6g，一水硫酸锰0.045g，碳酸钙9.0g；
保护剂各组分的重量g数为：吐温-20200g、黄原胶1g、甘油4g、磷酸氢二钠0.2g和磷酸二氢钾和硫酸镁0.1g，余量为无菌水，定容至1000ml；
使用时，旋耕机翻耕镉污染土壤表层厚18cm的土壤；稀释后的微生物土壤修复剂按60l/亩的用量均匀喷施到土壤中。
对比例1
本对比例与实施例1相比的区别在于，微生物土壤修复剂的制备方法中制成的液体菌液冷冻干燥后粉碎得到粉剂，再将粉剂与保护剂混合。
对比例2
本对比例与实施例1相比的区别在于，未添加保护剂。
效果例：
(1)实验样品：本发明实施例1至5和对比例1和2所制得的土壤修复剂。
(2)实验方法：重金属污染土壤：7亩重度镉污染土壤选自江苏省徐州市泉旺头村。
(a)按照标准gb/t23739-2009《土壤质量有效态铅和镉的测定原子吸收法》和《土壤环境监测技术规范》中的检测方法测定重金属污染土壤各种形态的镉含量；
(b)将7亩重金属污染土壤平均分成七组，按照使用方法将七组实验样品分别施加在重金属污染土壤，放置养护30天后再次施加样品，再放置养护30天，使七组样品分别与重污染土壤中的镉充分反应，充分稳定化，分别测定7组混合土壤中各种形态镉的含量，测定结果见表1。
表1修复前后土壤镉形态变化统计(mg/kg)
(3)实验结果：从表1中可以看出，经过本发明实施例1至5所制得微生物土壤修复剂处理过的重金属污染土壤中残渣态镉和铁锰态镉的含量均满足gb15618-1995《土壤环境质量标准》，而经过对比例1和对比例2生产的微生物土壤修复剂处理过的重金属污染土壤中残渣态镉和铁锰态镉的含量较高，未达到gb15618-1995《土壤环境质量标准》的要求，实验结果表明，本发明实施例1至5所制得的微生物土壤修复剂对重金属污染土壤具有很好的治理修复效果。
以上内容仅仅是对本发明构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。