一种新型冠状病毒SARS-Cov-2保存液及其制备方法和应用与流程

本发明属于体外诊断领域，涉及一种新型冠状病毒sars-cov-2保存液及其制备方法和应用。
背景技术：
：为了满足疫情防控需要，提升便捷程度，提高检测准确度，实现疑似患者的快速诊断和密切接触人群的现场筛查，需要快速进行核酸、抗体和抗原的快速检测试剂的开发，同时为提高检测的准确性，样本提取的后处理及保存显得尤为重要。技术实现要素：有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种新型冠状病毒sars-cov-2保存液及其制备方法和应用。为了实现上述目的，本发明提供了一种新型冠状病毒sars-cov-2保存液，1l的病毒保存液包括以下重量份的各组分：余量为缓冲液。在本发明的一个具体方案中，其中所述中和抗体包含一对抗sars抗体、一对抗合胞病毒抗体、一对抗腺病毒抗体、一对抗甲型流感病毒抗体和一对抗乙型流感病毒抗体中的至少一种。在本发明的一个具体方案中，其中当所述中和抗体包含一对抗sars抗体、一对抗合胞病毒抗体、一对抗腺病毒抗体、一对抗甲型流感病毒抗体和一对抗乙型流感病毒抗体时，所述一对抗sars抗体：一对抗合胞病毒抗体：一对抗腺病毒抗体：一对抗甲型流感病毒抗体：一对抗乙型流感病毒抗体的重量比为1：(0.5～2)：(0.5～2)：(0.5～2)：(0.5～2)。在本发明的一个具体方案中，当所述中和抗体包含一对抗sars抗体、一对抗合胞病毒抗体、一对抗腺病毒抗体、一对抗甲型流感病毒抗体和一对抗乙型流感病毒抗体中的任意两种时，二者的比例为1：(0.5～2)。在本发明的一个具体方案中，当所述中和抗体包含一对抗sars抗体、一对抗合胞病毒抗体、一对抗腺病毒抗体、一对抗甲型流感病毒抗体和一对抗乙型流感病毒抗体中的任意三种时，三者的比例为1：(0.5～2)：(0.5～2)。在本发明的一个具体方案中，当所述中和抗体包含一对抗sars抗体、一对抗合胞病毒抗体、一对抗腺病毒抗体、一对抗甲型流感病毒抗体和一对抗乙型流感病毒抗体中的任意四种时，四者的比例为1：(0.5～2)：(0.5～2)：(0.5～2)。在本发明的一个具体方案中，其中所述缓冲液为tris-hcl缓冲液、pb缓冲液或巴比妥钠-盐酸缓冲液中的一种。为了实现上述目的，本发明还提供了一种新型冠状病毒sars-cov-2保存液的制备方法，包括以下步骤：将配方量的酪蛋白、中和抗体、庆大霉素、牛血清白蛋白和缓冲液混合均匀，即得所述新型冠状病毒sars-cov-2保存液。为了实现上述目的，本发明还提供了一种新型冠状病毒sars-cov-2保存液的使用方法，包括以下步骤：在塑料软管、样品杯或试剂杯中加入0.2～2ml病毒保存液，将采集的样本加入到上述保存液中，混合均匀后，将含有样本的保存液在2～8℃下保存或者直接取30～100μl用于免疫检测。在本发明的一个具体方案中，其中所述样本选自鼻拭子、咽拭子、口腔拭子、唾液、痰液或肺泡灌洗液中的一种。在本发明的一个具体方案中，其中所述免疫检测选自化学发光、酶联免疫、免疫层析、磁微粒化学发光、电化学免疫和质谱免疫中的一种。本发明的有益效果：1、本发明所提供的新型冠状病毒保存液，其对鼻拭子、咽拭子、口腔拭子、唾液、痰液、血液等不同样本具有较好的兼容性，为病毒样本提供了一个合适稳定的缓冲环境，利于样本检测和保存。2、本发明所提供的新型冠状病毒保存液，其能够降低检测过程中的非特异性吸附，同时能够中和样本中的sars病毒、合胞病毒、腺病毒、甲型流感病毒、或乙型流感病毒等，有效降低交叉反应，提高检测灵敏度和特异性。附图说明图1为本发明所提供的快速检测新型冠状病毒n蛋白的免疫层析试纸条示意图；图2a为本发明所提供的快速检测新型冠状病毒n蛋白的免疫层析检测卡中一种上盖的内部结构示意图；图2b为本发明所提供的快速检测新型冠状病毒n蛋白的免疫层析检测卡中一种底槽的内部结构示意图；其中，1-pvc板，2-包被垫，3-标记物垫，4-吸水垫，5-检测线，6-质控线，7-标记物结合处，8-样本，9-样品垫，11-上盖，12-底槽，13-加样孔，14-观察窗，15-试纸条放置区域，16-定位柱，17-定位孔，18-第一限定部，19-第二限定部，20-第三限定部。具体实施方式下面结合具体实施例和说明书附图对本发明进行进一步说明。以下材料或试剂，除非特别说明，均为市售。新型冠状病毒sars-cov-2保存液也可以简称为做病毒保存液。实施例1新型冠状病毒sars-cov-2病毒保存液的配制其配方如下：酪蛋白200mg；庆大霉素30mg；牛血清白蛋白2000mg；nacl9g；l-谷氨酸4.8g；一株抗sars抗体10mg，另一株抗sars抗体10mg；一株抗合胞病毒抗体10mg，另一株抗合胞病毒抗体10mg；一株抗腺病毒抗体10mg，另一株抗腺病毒抗体10mg；一株抗甲型流感病毒抗体10mg，另一株抗甲型流感病毒抗体10mg；一株抗乙型流感病毒抗体10mg，另一株抗乙型流感病毒抗体10mg；上述原料用0.02m的pb缓冲溶液定容至1l后，混匀静置后备用。上述0.02m的pb缓冲溶液的配制如下(1l):0.2mna2hpo4溶液的配制如下：0.2mnah2po4溶液的配制如下：实施例2新型冠状病毒n蛋白免疫层析检测试剂盒的制备1)采用荧光微球标记另一株鼠抗新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体取0.5ml荧光微球加入1mg碳化二亚胺(edc)，1mgn-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，于室温，120r/min的转速下搅拌3h，然后加入100μl另一株鼠抗新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体，于室温，120r/min的转速下搅拌1h，再加入10mgbsa封闭液，继续以120r/min的转速搅拌1h。在2～8℃下，按照12000r/min的转速离心20min，除去上清液。最后，用0.2m的磷酸盐缓冲液(ph＝7.4)将离心后获得的固体沉淀物复溶至1ml，再加入1μl的proclin300在4℃下保存待用。2)采用荧光微球标记兔igg多克隆抗体取0.5ml荧光微球加入1mg碳化二亚胺(edc)，1mgn-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，于室温，120r/min的转速下搅拌3h，然后加入100μlmg羊兔igg多克隆抗体，于室温，120r/min的转速下搅拌1h，再加入10mgbsa封闭液，继续以120r/min的转速搅拌1h。在2～8℃下，按照11000r/min的转速离心30min，除去上清液。最后，用0.2m的磷酸盐缓冲液(ph＝7.4)将固体沉淀物复溶至1ml，再加入1μl的proclin300在4℃下保存待用。3)包被垫的制备将一株鼠抗新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体和羊抗兔多克隆抗体分别用0.2m的磷酸盐缓冲液(ph＝7.4)稀释成1mg/ml，用划膜喷金仪在硝酸纤维素膜(nc膜)上进行划膜。含有一株鼠抗新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体的作为检测线(t线)5，含有羊抗兔多克隆抗体的作为质控线(c线)6，然后在37℃，湿度<30％的环境下干燥4h制成包被垫2。4)标记物垫的制备①将玻璃纤维素膜在0.2m的磷酸盐缓冲液(ph＝7.4)中浸泡6h，然后在35℃下干燥8h，备用。②将摩尔比为1:1的荧光微球标记的一株鼠抗新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体和荧光微球标记的兔igg标记的荧光乳胶微球混合均匀后，按照10μl/cm的速度喷涂在玻璃纤维素膜上，然后放置在45℃下干燥2h制成标记物垫3。标记物垫3上包被有荧光微球标记的一株鼠抗新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体和荧光微球标记的兔igg的地方叫做标记物结合处7。5)免疫层析检测试剂盒的组装首先在pvc板1上粘接硝酸纤维膜2，然后在靠近硝酸纤维膜2上的质控线6的一端搭接吸水垫4，在靠近硝酸纤维膜2的检测线5的一端搭接标记物垫3及其连接的样品垫9，用切条机切成4mm±0.1mm的试纸条(见图1)，将试纸条放入卡壳中制备成新型冠状病毒n蛋白免疫层析检测试剂盒。所述卡壳选自现有技术，例如，所述卡壳(如图2所示)可以包括：底槽12，其连接于所述pvc板1；上盖11，其连接于所述底槽12，所述上盖11上设置有用于向所述样品垫9上加样的加样孔13；观察窗14，其设置于上盖11上，用于检测线5和质控线6的数据采集。如图2b所示，所述底槽12包括：位于其内表面的对称分布的多个定位孔17，多个所述定位孔17之间设有多个用于限定试纸条横向移动的第一限定部18以及用于限定试纸条纵向移动的第二限定部19；对称设置的所述第一限定部18与所述第二限定部19围设成纸条放置区域15(虚线区域)，用于放置试纸条；如图2a所示，所述上盖11包括：与多个所述定位孔17相配合的多个定位柱16，这样配合使用以将上盖11和底槽12固定在一起；所述上盖11还包括用于限定试纸条的上下移动的第三限定部20。所述包被垫2的上方设有用于数据采集的观察窗14，以露出全部所述检测线5和质控线6，用于收集其检测结果；且所述观察窗14开设于所述上盖11上与试纸条放置区域15的中部相对应的位置。所述上盖11在与所述样品垫9相对应的位置处开设有加样孔，以用于样品垫9上滴加样本8。所述检测线距离加样孔15-25mm。实施例3临床检测使用在塑料软管中加入0.5ml实施例1中配制的病毒保存液，随后将采集咽拭子和鼻拭子样本后的棉棒浸在病毒保存液中并搅拌；用手指挤压塑料软管外侧多次，使病毒保存液充分浸透棉棒，然后拔出棉棒，绞出(即将棉棒上采集的样本混合到病毒保存液中)的液体即为待测样本。取60μl待测样本采用实施例2所述的新型冠状病毒n蛋白免疫层析试剂盒进行检测，将待测样本滴加到试剂盒加样孔处，静置15min，然后插入荧光免疫层析分析仪进行检测，仪器自动计算出样本t/c值，通过与正常值范围判断阴阳性；或者当在紫外灯照射下呈现出两条荧光条带时，即为阳性。检测结果如下表1所示。表1从表1的临床检测数据可以看出，采用新型冠状病毒n蛋白免疫层析试剂盒检测咽拭子样本的检测结果中，9例新型冠状病毒肺炎患者样本中，7例检测为阳性，阳性检测率为77％；2例甲型流感病毒患者样本全部检测为阴性；3例乙型流感病毒患者样本全部检测为阴性；10例正常人样本全部检测为阴性。采用新型冠状病毒n蛋白免疫层析试剂盒检测鼻拭子样本的检测结果中，9例新型冠状病毒肺炎患者样本中，6例检测为阳性，阳性检测率为77％；2例甲型流感病毒患者样本全部检测为阴性；3例乙型流感病毒患者样本全部检测为阴性；10例正常人样本全部检测为阴性。实施例3进行sars交叉反应验证病毒保存液1：不加任何一种中和抗体，具体配制如下：病毒保存液2：添加一对抗sars抗体，具体配制如下：采用样本保存液1配制浓度为5μg/ml的sars重组蛋白溶液，作为对照样本；采用样本保存液2配制浓度为5μg/ml的sars重组蛋白溶液，作为检测样本；然后分别取60μl的对照样本和检测样本采用新型冠状病毒n蛋白免疫层析试剂盒进行检测，结果如下表2所示。表2检测值(t/c)正常值范围(t/c)对照样本0.0620-0.05检测样本0.0090-0.05从表2的检测结果中可以看出，在样本保存液中添加一对抗sars抗体，可以明显减少sars的交叉反应。以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的实施例，本发明的保护范围不限于此。本
技术领域：
的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。当前第1页12