一种用于检测中华鳖虹彩病毒的核酸适配体及其构建方法和应用与流程

本申请要求于2020年02月07日提交国家知识产权局、申请号为cn202010082169.1、发明名称为“一种用于检测中华鳖虹彩病毒的核酸适配体及其构建方法和应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

本发明属于生物工程技术领域，特别地，涉及一种用于检测中华鳖虹彩病毒的核酸适配体及其构建方法和应用。

背景技术：

鳖营养丰富，药用价值高，作为我国大宗、重要的水产养殖的种类，目前国内鳖养殖年产量已达30万吨以上，产业直接产值超过百亿元，经济价值极高。然而随着鳖养殖密度的增加、养殖规模的扩大，各种病害频繁暴发，造成了巨大经济损失。其中，中华鳖虹彩病毒(stiv)是从患“红脖子病”的中华鳖体内分离获得的，stiv作为导致中华鳖发病的主要病毒性病原，致死率极高，因此研发操作便捷、成本低、耗时短、准确度高的检测技术，对于控制中华鳖stiv病毒的危害极其重要。但是目前针对中华鳖stiv病毒的的诊断方法主要是分子生物学检测方法和免疫学检测方法等，包括pcr技术、巢式pcr技术、荧光定量pcr技术，elisa技术等。pcr技术检测结果精确可靠，但却存在操作繁琐、耗时长、仪器试剂昂贵等不足，无法满足现场快速准确检测诊断的要求。因此应着力发展操作便捷、成本低、耗时短、准确度高、可以在养殖场现场使用的中华鳖stiv病毒快速检测技术和功能产品，这对于及早发现、确定病原，进而有的放矢地制定治疗方案来控制病原扩散、降低损失至关重要。

核酸适配体是利用指数富集的配基系统进化技术(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichmenttechnology,selex)，从人工合成的随机序列文库中在体外经过多轮筛选获得的、能够特异性识别靶物质的单链寡核苷酸。核酸适配体具有特异性高、亲和性高、稳定性强、易化学合成和化学修饰等诸多优点。基于适配体能够高特异性识别病原微生物或病变细胞的生物学特性，核酸适配体广泛应用于检测技术开发和生物传感器的构建，能够实现对病原或疾病的精确检测诊断。因此核酸适配体在疾病诊断、病毒侵染机制研究等生物学各领域中具有广阔的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于检测中华鳖虹彩病毒的核酸适配体及其构建方法和应用，以提高中华鳖虹彩病毒的检测水平。

根据本发明的一个方面，提供一种用于检测中华鳖虹彩病毒的核酸适配体：包括如seqidno.1所示的dna序列或其衍生物。

优选地，衍生物为seqidno.1所示的dna序列上的至少一个碱基被磷酸化、巯基化、甲基化、氨基化或同位素化。

优选地，包括如seqidno.2所示的dna序列或其衍生物。

优选地，其二级结构如下：

优选地，衍生物为seqidno.2所示的dna序列上的至少一个碱基被磷酸化、巯基化、甲基化、氨基化或同位素化。

优选地，dna序列上接有功能基团，功能基团选自生物素标记物、发光标记物、酶标记物。可选地，发光标记物选自羟基荧光素、异硫氰酸荧光素或羧基四甲基罗丹明中的一种或一种以上。

根据本发明的另一个方面，提供上述用于检测中华鳖虹彩病毒的核酸适配体在制备检测中华鳖彩虹病毒的产品中的应用。

优选地，产品为荧光分子探针，核酸适配体上接有发光标记物。

根据本发明的另一个方面，提供一种构建上述用于检测中华鳖虹彩病毒的核酸适配体的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，提供第一ssdna文库和一对pcr引物，第一ssdna文库包含以下的单链dna序列：

5’-gacgcttactcaggtgtgactcg(50n)cgaaggacgcagatgaagtctc，pcr引物包括上游引物和下游引物，上游引物包括如seqidno.3所示的dna序列，下游引物包括如seqidno.4所示的dna序列；步骤二，将随机ssdna文库与感染了中华鳖虹彩病毒的胖头鲤细胞共同孵育，筛选得到特异性识别中华鳖虹彩病毒的第二ssdna文库；步骤三，以第二ssdna文库为模板，使用pcr引物进行pcr扩增，得到dsdna文库；步骤四，将dsdna文库与被链霉亲和素标记的磁珠进行孵育，孵育后对磁珠进行磁性分离，然后对结合在磁珠上的特异性识别中华鳖虹彩病毒的第三ssdna文库进行纯化与分离，得到用于检测中华鳖虹彩病毒的核酸适配体。在第一ssdna文库的单链dna序列中，两端为固定序列，中间的“50n”表示长度为50个核苷酸的随机序列。

优选地，在步骤三中，按照如下程序进行pcr扩增：92℃5分钟，92℃1分钟，60℃30秒，72℃1分钟，经过25轮循环；72℃5分钟。

与现有的蛋白类抗体相比，本发明通过selex技术筛选得到的核酸适配体对中华鳖虹彩病毒具有更高的亲和力和特异性，而且还具有蛋白类抗体所不具备的特点，包括无免疫原性、制备周期短、重现性好、分子量小、便于体外化学合成、便于标记、易于对核酸适配体的不同部位进行修饰和取代、序列稳定易于运输和保存等。采用基于本发明的核酸适配体的快速检测方法对中华鳖虹彩病毒进行检测时，操作简单迅速、能够达到较高的准确率和灵敏度。可利用该核酸适配体构建分子探针或检测试剂盒，并结合酶标仪、流式细胞仪、荧光显微镜等检测设备，实现中华鳖虹彩病毒的精确检测。这对于中华鳖stiv病毒的快速诊断具有重要意义，在中华鳖stiv病毒的检测领域有良好的应用前景。

附图说明

图1为dna序列为seqidno.2的核酸适配体的二级结构预测图；

图2为实施例2中流式细胞仪检测的样品fam荧光值测试结果；

图3为实施例2中激光扫描共聚焦显微镜的观测结果：(a)实验ⅱ组对应样品的光镜图，(b)实验ⅱ组对应样品样品的荧光图，(c)对照组对应样品的光镜图，(d)对照组对应样品的荧光图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。

实施例1检测stiv的核酸适配体的筛选和制备

s1.第一ssdna文库的构建和引物的合成

设计合成第一ssdna文库library50，其核苷酸序列如下：

5’-gacgcttactcaggtgtgactcg(50n)cgaaggacgcagatgaagtctc，其中，两端为固定序列，中间50个核苷酸为随机序列。

上游引物包括如seqidno.3所示的dna序列，并被羟基荧光素(fam)标记，其具体的序列为：5’-fam-gacgcttactcaggtgtgactcg-3’。

下游引物包括如seqidno.4所示的dna序列，并被生物素(biotin)标记，其具体的序列为：5’-biotin-gagacttcatctgcgtccttcg-3’。

第一ssdna文库和引物均由上海生工生物有限公司合成。

s2.selex筛选获得特异性识别stiv感染的胖头鲤细胞的核酸适配体(阳性筛选)

s2.1将10nmol上述第一ssdna文库溶解在500μlpbs中，92℃恒温水浴5min，然后迅速插入冰中，冰浴10min，将处理后的第一ssdna文库与stiv感染的胖头鲤细胞在冰上孵育1h；

s2.2孵育结合完成后，离心移除上清，用10ml的pbs洗涤被stiv感染的胖头鲤细胞，92℃恒温水浴10min，12000g离心收集上清，即为特异性识别stiv感染细胞的第二ssdna文库。

s3.pcr扩增

取100μl筛选得到的第二ssdna文库，使其与上游引物、下游引物进行pcr扩增。pcr反应体系如下(1000μl)：10×buffer100μl,dntpmix(2.5mm)80μl，上游引物40μl，下游引物40μl，第二ssdna文库100μl，rtaq酶12.5μl，ddh2o627.5μl。按照如下程序进行pcr扩增：92℃5分钟，92℃1分钟，60℃30秒，72℃1分钟，经过25轮循环；72℃5分钟。第一轮循环筛选后得到的上清，要全部用于进行后续的pcr扩增，得到扩增后的dsdna文库。

s4.第三ssdna文库的制备

将100μl链酶亲和素标记的磁珠与dsdna文库在常温下孵育20min，利用dsdna文库上的生物素与磁珠上链酶亲和素的亲和作用，将dsdna文库结合到磁珠表面，利用磁性分离器上除去上清，用2mlpbs洗涤磁珠，然后在ep管中加入200μlnaoh溶液(200mm)，常温反应10min，使dsdna文库变性解链，带有生物素的一条链与链亲和素结合留在磁珠上，以与磁珠结合的单链dna作为第三ssdna文库，利用磁性分离架回收得到上清；除盐柱用10ml无菌水洗涤后，将上清液加入除盐柱，靠重力作用自然滴完。加入500μlpbs，收集到的溶液用于下一轮的筛选。

s5.反复筛选

将s4中得到的第三ssdna文库代替第一ssdna文库，重复s2–s4所示的阳性筛选过程、pcr扩增及单链dna文库的制取过程10次。

s6.阴性筛选

在s5的第二轮及第二轮以后筛选中，用正常胖头鲤细胞为对照，将s5后筛选得到的ssdna文库进行阴性筛选以提高筛选效率。具体的阴性筛选过程为：将筛选得到的ssdna文库溶解，在92℃下恒温水浴，与正常胖头鲤细胞在冰上孵育1h，孵育完成后离心收集上清溶液，即为经过阴性筛选的ssdna文库。

s7.11轮筛选

将s6中收集到含有ssdna文库的上清液，经过s3的pcr扩增和s骤4的ssdna文库制备后，依次重复进行s6、s2、s3和s4的过程，利用流式细胞仪检测所得ssdna文库对stiv感染细胞的识别能力的变化情况，重复进行6轮筛选，此时得到的ssdna文库对stiv感染细胞识别能力达到最强。将所得扩增产物经克隆测序分析后，最终得到本实施例中可用于检测stiv感染细胞的核酸适配体，其dna序列为：

acacccaaattccgtcagtcgtgctcgtaattcacaacaccgctggccat(seqinno.1),

或，

gacgcttactcaggtgtgactcgacacccaaattccgtcagtcgtgctcgtaattcacaacaccgctggccatcgaaggacgcagatgaagtctc(seqidno.2)。

利用mfold软件(http://mfold.rna.albany.edu/？q＝mfold/dna-folding-form)在线预测seqidno.2的二级结构,预测结果如图3所示，dna序列为seqidno.2的核酸适配体形成特殊的茎环结构和发卡结构，其吉布斯自由能(δg)为-28.35。类似地，dna序列为seqidno.1的核酸适配体也形成特殊的茎环结构和发卡结构。

实施例2

2.1主要仪器

attunenxt流式细胞仪(赛默飞世尔科技)、fv3000激光扫描共聚焦显微镜(奥林巴斯)。

2.2实验组设置方式

利用fam分别标记实施例1构建的seqidno.1核酸适配体和seqidno.2核酸适配体。

实验ⅰ组：将10nmolseqidno.1核酸适配体溶解在500μlpbs中，92℃恒温水浴5min，然后迅速插入冰中，冰浴10min，将处理后的第一ssdna文库与stiv感染的胖头鲤细胞在冰上孵育1h，孵育结合完成后，离心移除上清。

实验ⅱ组：将10nmolseqidno.2核酸适配体溶解在500μlpbs中，92℃恒温水浴5min，然后迅速插入冰中，冰浴10min，将处理后的第一ssdna文库与stiv感染的胖头鲤细胞在冰上孵育1h，孵育结合完成后，离心移除上清。

对照组：将10nmolseqidno.1核酸适配体溶解在500μlpbs中，92℃恒温水浴5min，然后迅速插入冰中，冰浴10min，将处理后的第一ssdna文库与正常的胖头鲤细胞在冰上孵育1h，孵育结合完成后，离心移除上清。

利用流式细胞仪分别检测实验ⅰ组、实验ⅱ组和对照组的参试核酸适配体与胖头鲤细胞的结合效果及特异性。利用激光共聚焦显微镜观察实验ⅱ组和对照组的参试核酸适配体分别与胖头鲤细胞的孵育后得到的细胞沉淀物。

2.3实验结果

流式细胞仪的检测结果如图2所示，结果证实，与对照组中流式细胞仪检测到的正常胖头鲤细胞表面的荧光值相比，实验ⅰ组和实验ⅱ组中流式细胞仪检测到stiv感染的胖头鲤细胞表面的荧光值显著升高，即上述seqidno.1核酸适配体或seqidno.2核酸适配体对stiv感染的胖头鲤细胞具有高特异性识别能力。

激光共聚焦显微镜的检测结果如图3所示，结果证实，与对照组中正常细胞相比，实验ⅱ组的核酸适配体明显结合在stiv感染的胖头鲤细胞表面，即seqidno.2核酸适配体对stiv感染的胖头鲤细胞具有高特异性识别能力。与之类似，seqidno.2核酸适配体也能够结合在stiv感染的胖头鲤细胞表面，对stiv感染的胖头鲤细胞具有高特异性识别能力。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

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<110>广西科学院，广西壮族自治区水产科学研究院

<120>一种用于检测中华鳖虹彩病毒的核酸适配体及其构建方法和应用

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