一种海洋真菌来源azaphilones二聚体类化合物及其制备方法与流程

本发明涉及海洋天然药物化学领域，具体地说涉及一种海洋真菌来源azaphilones二聚体类化合物及其制备方法。

背景技术：

海洋约占地球总表面积的71％，蕴含了丰富多样的生物资源，是人类进行药物研发的宝贵资源库。自20世纪40年代以来，以头孢菌素、阿糖胞苷和et-743为代表的多种海洋来源药物被成功运用到临床上。几乎所有的海洋生物都能产生具有生物活性的次级代谢产物。其中，海洋来源真菌微生物资源因为其代谢产物丰富和可重复发酵等优点成为海洋药物最重要的来源之一。以海洋真菌来源的azaphilones类化合物为代表的抗肿瘤活性化合物已经成为现代海洋药物研究的一大亮点。但到目前为止，国内外均未见对海洋真菌来源含[2+2]二聚化的azaphilones类化合物及其抗肿瘤活性报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种海洋真菌来源azaphilones二聚体类化合物及其制备方法，以解决现有技术中海洋真菌来源azaphilones类化合物的种类及抗肿瘤活性有限的问题。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种海洋真菌，所述海洋真菌为格孢菌(pleosporalessp.)hbu-135菌株，保藏日期为2018年10月18日，保藏编号为cgmccno.16379，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

1.样品来源

海洋真菌hbu-135菌株分离自海洋沉淀物，所述海洋沉淀物样品于2015年6月采自河北省沧州市黄骅港海域。海底沉淀物样品采集后，立刻放于–20℃冰箱中保存，并送往实验室进行后续真菌的分离工作。

2.真菌的分离

2.1培养基的选择

(1)pda培养基

马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，海盐30g，琼脂20g，水1000ml。分离真菌时加25μg/ml硫酸链霉素，25μg/ml氨苄青霉素，抑制细菌生长。

(2)无盐pda培养基

马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml。分离真菌时加25μg/ml硫酸链霉素，25μg/ml氨苄青霉素，抑制细菌生长(无盐pda与加盐pda对比)。

(3)孟加拉红培养基

马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，海盐30g，孟加拉红(rosebengal)33mg(抑制生长快的霉菌蔓延生长)，琼脂20g，水1000ml。

2.2真菌的分离、纯化

将上述海洋沉淀物样品置于无菌玻璃器中，加入1ml无菌水调至黏稠状。取出0.1ml上述液体用无菌水分别稀释10倍、100倍、1000倍，得到4个浓度梯度的匀浆液，用无菌移液管分别取0.2ml各浓度匀浆液分别加入pda、无盐pda、孟加拉红培养基中，用涂布器涂匀。每个浓度梯度分别做三个平行。用封口膜封好，并写上编号。以上分离实验均在无菌条件下进行。

将上述加入样品的培养基分别放入28℃恒温箱，倒置培养。一般培养5–8d便有菌落或者菌丝体从培养基或者组织小块边缘长出来(细菌生长快，2–3d就有菌落生长出来)。用接种针挑取菌落或者菌丝体尖端，移至新的平板上，经几次分离纯化后，可获得真菌纯菌株。真菌分离工作一般进行35d。前两周每天检查一次，以后每隔3–4d检查一次。一旦发现有新的菌落或菌丝体长出，应马上将其转接到新的平板上。

3、菌株的筛选

采用活性筛选结合化学筛选的方法来筛选目标菌株。通过对菌株进行小规模发酵(2瓶)，获得粗浸膏，对粗浸膏进行抗菌活性测试，将对肿瘤细胞的抑制活性作为筛选目标菌株的考察因素之一；且对粗浸膏进行hplc指纹图谱分析，将次级代谢产物量作为筛选目标菌株的考察因素之二，最终确定抑菌活性高且次级代谢产物丰富的菌株hbu-135为目标菌株，并对其进行鉴定。

4、菌株的鉴定

在pda培养基平板上培养3-7d，生长至最佳状态的真菌，用灭菌枪头挑取单菌落上少量菌丝至装有50μllysisbuffer(裂解液)的ep管中，于80℃水浴锅中热变性15min，然后8000rpm离心1min，取3μl上清液即为pcr反应的模板dna。

用于扩增和测序的引物为its1和its4，上下引物序列为：

its1：tccgtaggtgaacctgcgg

its4：tcctccgcttattgatatgc

pcr反应体系为40μl体系，包括：

扩增条件为：

扩增产物用0.8％的琼脂糖凝胶，0.5×tbe电泳缓冲液样，5v/cm电压，上样5μl电泳检测，dnamarker指示分子量，凝胶成像仪观察并照相。将pcr扩增产物送北京三博远志公司进行测序，并最终鉴定为格孢菌(pleosporalessp.)。

一种海洋真菌来源azaphilones二聚体类化合物，所述化合物的结构式为：

上述的海洋真菌来源azaphilones类化合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将权利要求1所述的格孢菌(pleosporalessp.)hbu-135菌株接种于菌种培养基中进行菌种培养；

(2)菌种培养完成后，将其接种于发酵培养基中进行发酵，得到发酵物；

(3)用乙酸乙酯对发酵物进行萃取2–4次，合并乙酸乙酯萃取液后减压浓缩得到粗浸膏；

(4)对所得粗浸膏进行色谱分离即得所述azaphilones二聚体类化合物，所述的色谱分离为依次进行正相硅胶柱色谱分离、反相硅胶柱色谱分离、凝胶柱色谱分离和高效液相色谱分离。

步骤(1)中，所述菌种培养基为：葡萄糖1.0–10wt％、酵母膏0.1–4.0wt％、蛋白胨0.2–4.0wt％、琼脂1.0–6.0wt％、粗海盐3.0–10wt％，其余为水；菌种培养温度为15–35℃，培养时间为3–10天。

步骤(2)中，每单位份的所述发酵培养基包括马铃薯40–120g(水煮20分钟后除渣)、葡萄糖10–30g、cacl25–40g、水200–600ml；发酵培养条件为在15–35℃下，摇床培养10–20天。

步骤(4)中，所述正相硅胶柱色谱分离为：先采用固定相为100～200目硅胶，流动相为1.5–3vol％甲醇/二氯甲烷混合溶液进行洗脱，洗脱体积为3-5个柱体积，将所得洗脱液浓缩后再采用固定相为200～300目硅胶，流动相为25–30vol％乙酸乙酯/石油醚混合溶液进行洗脱，洗脱体积为2-3个柱体积。

步骤(4)中，所述凝胶柱色谱分离的固定相为sephadexlh-20，流动相为40–60vol％甲醇/二氯甲烷混合溶液进行洗脱，洗脱体积为3-5个柱体积。

步骤(4)中，所述反相硅胶柱色谱分离采用的固定相为c18硅胶，流动相为60–70vol％甲醇/水混合溶液，洗脱体积为2-3个柱体积。

步骤(4)中，所述高效液相色谱分离中采用的色谱柱为半制备c18色谱柱，xbridgeobd，5μm，10×250mm，流动相为70–90vol％的甲醇/水混合溶液。

本发明的另一实施方式中提供一种抗肿瘤剂，其特征在于包括式1和式2化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分。

本发明还提供所述的式1和式2化合物或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗由人乳腺癌细胞(mda-mb-231和mcf-7)、胃癌细胞(mgc-803)、宫颈癌细胞(hela)和肺上皮癌细胞(a-549)引起的肿瘤疾病的药物中的应用。

上述的式1和式2化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤剂中的应用。

本发明中术语“药学上可接受的盐”是指非毒性的无机或有机酸和/或碱的加成盐，可参见“saltselectionforbasicdrugs”,int.j.pharm.(1986),33,201–217。

本发明从海洋真菌pleosporalessp.中获得azaphilones二聚体类式1和式2化合物对人乳腺癌细胞(mda-mb-231和mcf-7)、胃癌细胞(mgc-803)、宫颈癌细胞(hela)和肺上皮癌细胞(a-549)具有强的抑制活性，可用作抗肿瘤药物，应用前景广阔。

具体实施方式

实施例1

(1)海洋真菌hbu-135菌种的培养

海洋真菌hbu-135的菌种培养所用的培养基含有葡萄糖1.0wt％、酵母膏0.1wt％、蛋白胨0.2wt％、琼脂1.0wt％、粗海盐3.0wt％，其余为水，使用时制成试管斜面，海洋真菌hbu-135菌株在28℃下培养3天。

(2)海洋真菌hbu-135的发酵培养

海洋真菌hbu-135的发酵培养所用的发酵培养基为每个1000ml锥形瓶中含有土豆100g(水煮20分钟后除土豆渣)、葡萄糖20g、cacl233g、水500ml，菌株于28℃摇床发酵培养14天，得发酵物；共使用20个1000ml锥形瓶发酵。

(3)azaphilones二聚体类的分离分析

取步骤(2)所得的发酵物，用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液减压浓缩得到粗浸膏，先进行正相硅胶柱色谱分离，固定相：100～200目硅胶，流动相为1.5vol％甲醇/二氯甲烷混合溶液，洗脱5个柱体积，洗脱液浓缩后再次进行正相硅胶柱色谱分离，固定相：200～300目硅胶，流动相为25vol％的乙酸乙酯/石油醚混合溶液，洗脱2个柱体积。

洗脱液浓缩后进行sephadexlh20凝胶柱色谱分离，流动相为50vol％甲醇/二氯甲烷混合溶液进行洗脱，洗脱3个柱体积。洗脱液浓缩后进行反相硅胶柱色谱分离，固定相优选为c18硅胶，流动相优选为70vol％甲醇/水混合溶液，洗脱3个柱体积。洗脱液浓缩后进行高效液相色谱分离，固定相：半制备c18色谱柱，xbridgeobd,5μm,10×250mm，流动相为80vol％的甲醇/水混合溶液，制备分离得到化合物1(10.6mg)、化合物2(22.0mg)，其结构确证数据分别如下：

化合物1黄色油状；[α]d²⁰+160(c1.00,meoh)；uv(meoh),λmax(logε)216(3.00),267(1.91),308(1.07)nm；ecd(c0.02，meoh)，λmax(δε)222(-46.0)，249(31.8)，331(19.5)nm；¹¹hnmr(dmso-d6,600mhz)δ:10.39,(1h,brs，17-oh),10.34,(1h,brs,17′-oh)，9.85,(1h,brs,15-oh),9.85,(1h,brs,15′-oh),6.18,(1h,brs,h-16),6.18,(1h,brs,h-18),6.18,(1h,brs,h-16′),6.18,(1h,brs，h-18′)，5.95，(1h，dt，j＝15.6/4.8hz，h-11),5.89,(1h,d,j＝15.6hz,h-10),5.74，(1h,brs,h-4′),5.71,(1h,brs,h-5′),5.05,(1h,d,j＝9.6hz,h-8′),4.93,(1h,d,j＝12.0hz,h-8),4.80,(1h,brs,12′-oh),4.77,(1h,brs,h-4),4.75,(1h,brs,12-oh),4.67,(1h,dd,j＝10.8/4.8hz,h-1′a),4.43,(1h,d,j＝10.8hz,h-1a),3.99,(2h,brs,h-12),3.71,(1h,dd,j＝13.2/10.8hz,h-1′b),3.50,(1h,d,j＝10.8hz,h-1b),3.45,(1h,m,h-12′a),3.37,(1h,m,h-12′b),3.28,(1h,m,h-11′),3.17,(1h,m,h-8a′),3.02,(1h,d,j＝12.0hz,h-8a),2.96,(1h,d,j＝10.2hz,h-10′),2.70,(1h,d,j＝9.6hz,h-5),2.29,(3h,s,h-20),2.26,(3h,s,h-20′),1.20，(3h，s，h-9′)，1.16，(3h,s,h-9)；¹³cnmr(dmso-d6,150mhz)δ:206.3,(c,c-6),194.7,(c,c-6′),168.5,(c,c-13′),168.0，(c,c-13),162.5,(c,c-3′),160.4,(c,c-15)，160.3，(c,c-15′)，159.2，(c，c-17)，158.6,(c,c-17′),150.2,(c,c-3),149.3,(c,c-4a′),140.0,(c,c-19),139.2,(c,c-19′),131.1，(ch,c-11),123.5,(ch,c-10),115.9,(ch,c-5′),109.9,(ch,c-16),109.6,(ch,c-16′),109.3,(c,c-14′),109.3,(c,c-14),107.4,(ch,c-4),102.7,(ch,c-4′),100.3,(ch,c-18),100.2,(ch,c-18′),75.7,(c,c-7),74.9,(ch,c-8),73.3,(c,c-7′),73.0,(ch,c-8′),67.3,(ch2,c-1′),63.1,(ch2,c-1),60.7,(ch2,c-12),60.1,(ch2,c-12′),49.5,(ch,c-5),49.1,(ch,c-10′),41.5,(ch,c-11′),40.6,(c,c-4a),34.2,(ch,c-8a′),31.4,(ch,c-8a)，20.9，(ch3，c-20′)，21.2，(ch3，c-20)，19.6,(ch3,c-9),19.2,(ch3,c-9′).hresimsm/z803.2512[m-h]^-(calcdforc42h43o16,803.2557).

化合物2黄色油状；[α]d²⁰+62(c1.00,meoh)；uv(meoh),λmax(logε)217(2.87),268(1.82),312(2.40)nm；ecd(c0.02,meoh),λmax(δε)267(13.1),305(-93.4),338(35.7)nm；¹hnmr(dmso-d6,600mhz)δ:10.44,(1h,brs,17/17′-oh),9.89,(1h,brs,15/15′-oh),6.19,(1h,brs,h-18/18′),6.18，(1h，brs，h-16/16′)，5.71,(1h,brs,h-4/4′),5.68,(1h,brs,h-5/5′),5.03,(1h,dt，j＝10.2hz,h-8/8′),4.65，(1h，dt,j＝10.8/4.8hz,h-1a/1′a)，4.61，(1h，brs，12/12′-oh)，3.74，(1h，dt，j＝13.2/10.8hz，h-1b/1′b),3.41,(2h,brs,h-12/12′),3.19,(1h,m,h-8a/8a′),2.89,(1h,d,j＝8.4hz,h-10/10′),2.26，(1h,m,h-11/11′),2.29,(1h,s,h-20/20′)，1.19，(3h,s，h-9/9′)；¹³cnmr(dmso-d6,150mhz)δ:194.6,(c,c-6/6′),168.6,(c,c-13/13′),166.1,(c,c-3/3′),160.5,(c,c-15/15′),159.2,(c,c-17/17′),150.0,(c,c-4a/4a′),115.4,(ch,c-5/5′),109.6,(ch,c-16/16′),109.2,(c,c-14/14′),100.3,(ch,c-18/18′),100.2,(ch,c-4/4′),75.0,(ch,c-8/8′),73.2,(c,c-7/7′),67.8,(ch2,c-1/1′),61.5,(ch2,c-12/12′),40.6,(ch,c-10/10′),40.2,(ch,c-11/11′),34.3,(ch,c-8a/8a′),21.2，(ch3，c-20/20′)，19.2，(ch3，c-9/9′).hresimsm/z805.2709[m+h]⁺(calcdforc42h45o16，805.2702).

实施例2

(1)海洋真菌hbu-135菌种的培养

海洋真菌hbu-135的菌种培养所用的培养基含葡萄糖10wt％、酵母膏4.0wt％、蛋白胨4.0wt％、琼脂6.0wt％、粗海盐10wt％，其余为水，使用时制成试管斜面，真菌菌株在35℃下培养5天。

(2)海洋真菌hbu-135的发酵培养

海洋真菌hbu-135的发酵培养所用的发酵培养基为每个1000ml锥形瓶中含有土豆120g(水煮20分钟后除土豆渣)、葡萄糖30g、cacl240g、水600ml；发酵培养条件为在35℃下，摇床培养20天，得发酵物。

(3)azaphilones二聚体类化合物的分离分析

取步骤(2)所得的发酵物，用乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液减压浓缩得到粗浸膏，先进行正相硅胶柱色谱分离，固定相：100～200目硅胶，流动相为3vol％甲醇/二氯甲烷混合溶液，洗脱3个柱体积，洗脱液浓缩后再次进行正相硅胶柱色谱分离，固定相：200～300目硅胶，流动相为30vol％的乙酸乙酯/石油醚混合溶液，洗脱3个柱体积。

洗脱液浓缩后进行sephadexlh20凝胶柱色谱分离，流动相为60vol％甲醇/二氯甲烷混合溶液进行洗脱，洗脱5个柱体积。洗脱液浓缩后进行反相硅胶柱色谱分离，固定相优选为c18硅胶，流动相优选为60vol％甲醇/水混合溶液，洗脱5个柱体积。洗脱液浓缩后进行高效液相色谱分离，固定相：半制备c18色谱柱，xbridgeobd,5μm,10×250mm，流动相为90vol％的甲醇/水混合溶液，制备分离得到化合物1和2，其结构确证数据与实施例1一致。

实施例1和2中未具体指明的其他菌种培养、发酵条件，以及正相硅胶柱色谱分离、反相硅胶柱色谱分离、凝胶柱色谱分离、高效液相手性色谱分离等其他实验操作条件均为本领域常规的实验操作条件，本领域的技术人员可以根据实际需要，进行合理的选择。

所得azaphilones二聚体类化合物的抗肿瘤活性

(1)抗肿瘤活性测试

采用mtt方法对人乳腺癌细胞(mda-mb-231和mcf-7)、胃癌细胞(mgc-803)、宫颈癌细胞(hela)和肺上皮癌细胞(a-549)的体外抑制活性进行测试。

(2)活性测试方法

按细胞生长速率，将一定数量处于对数生长期的细胞以90μl/孔的浓度接种于96孔培养板内，培养24h后加入待测样品10μl/孔，对每个细胞株，每个浓度梯度均做三个平行。细胞在37℃、5％co2条件下培养48h后，加mtt(sigma)液5mg/ml，用生理盐水配置20μl/孔；继续培养4h后，加入三联液(10％sds-5％异丁醇-0.01mol/lhcl)50μl/孔，置于co2培养箱中过夜。然后用酶标仪测od570值。阿霉素作为阳性对照药。

(3)活性测试结果

抑制肿瘤细胞株的ic50值(μm)见表1。

表1：

试验结果显示，化合物1能选择性的抑制肺上皮癌细胞(a-549)的生长，化合物2对人乳腺癌细胞(mda-mb-231和mcf-7)、胃癌细胞(mgc-803)、宫颈癌细胞(hela)和肺上皮癌细胞(a-549)均有较强的抑制作用。