一种新冠肺炎检测用磁珠及其制备方法与流程

本发明涉及纳米材料和细菌检验
技术领域：
，尤其涉及一种新冠肺炎检测用磁珠及其制备方法。
背景技术：
：自新型冠状病毒肺炎(coronavirusdisease2019,covid-19)发生以来，疫情迅速蔓延。鉴于covid-19对公众健康的危害极大,各级政府、卫生防疫、医疗、科研部门高度重视，围绕病原体鉴定、溯源、病例筛查、人群隔离、疾病诊断、疫苗和新药,以及治疗方案等开展了大量研究。由于该病为新发传染病，对其发病机制缺乏深入认识，尚缺乏特异有效的药物和疫苗,治疗措施多为对症和支持治疗。covid-19的基本病理生理机制是病毒与机体细胞膜上的血管紧张素转换酶2(angiotensin-convertingenzyme2,ace2)结合后,在进入细胞的同时,引起局部和全身的炎症反应、氧化应激、组织、细胞缺氧等,病程的发生发展和转归取决于损伤与抗损伤反应的斗争和力量对比,轻者可无明显表现,重者可发展为急性呼吸窘迫综合征(acuterespiratorydistresssyndrome,ards)、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍及多器官功能衰竭等,严重者导致死亡。该病可表现为轻型、普通型、重型和危重型,其中80％以上病例为轻型和普通型,重型和危重型的病例数较少,但救治难度大,病死率高。因此，对covid-19进行快速准确的检测是非常必要的。目前，一般检测新型冠状病毒肺炎的方法有三类：分子生物学检测方法(pcr检测)、免疫学方法(抗体检测)、细胞学方法(细胞培养)。单纯的pcr检测方法由于扩增产物有较强的非特异性，且容易发生污染，出现假阳性、假阴性现象，所以会出现无法确诊的情况。免疫学方法是基于病毒蛋白检测患者或疑似患者血液中的是否存在该病毒的抗体，而最早的血清抗体igm出现要7天左右，抗体igg的产生则在10后，20天左右才达到高峰。一般患者在刚发热时，血液中已经存在病毒，但抗体还没有发展起来，所以单纯用抗体检测方法会令医生难以判断sars病毒的存在。细胞培养方法是最早发展的实验室检测手段，能够在电子显微镜下直接观察到病毒颗粒，因而十分准确。但技术难道高，操作复杂，所需时间长，对设备要求相当高，不适于临床检测。此外，患者提供的样品中新型冠状病毒的含量往往非常低，尤其是盥洗液中只含有痕量的肺炎球菌，从而给诊断带来了极大的挑战。技术实现要素：本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种新冠肺炎检测用磁珠及其制备方法，首先采用高温多元醇法合成葡聚糖修饰的fe3o4纳米磁珠，然后通过简单、可控的生长诱导腐蚀法制得具有蛋黄-壳结构的fe3o4/sio2/pmo复合纳米磁珠，再将血管紧张素转换酶2(ace2)偶联到葡聚糖修饰的fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠上，利用ace2对新型冠状病毒的特异性，在吸附过程中ace2能够与新型冠状病毒特异性结合，从而能够从较为复杂、新型冠状病毒含量极低的样品中快速分离富集新型冠状病毒，以提高新型冠状病毒肺炎的检测效率和阳性率，且具有准确性高、灵敏度高、操作简便和特异性强等优势，从而为新型冠状病毒肺炎的早期筛查提供有效途径。为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种新冠肺炎检测用磁珠，包括fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠以及包覆在fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠表面的血管紧张素转换酶2(ace2)。作为上述方案的进一步限定，所述fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠的制备方法，包括如下步骤：s1、将fecl2·4h2o、fec13·6h2o溶解于一缩二乙二醇中，加入葡聚糖，加热搅拌反应10～30min后，加入naoh，继续加热搅拌反应，待反应结束后冷却至室温，经离心分离、洗涤后制得fe3o4纳米磁珠；s2、将步骤s1制得的fe3o4纳米磁珠分散于醇水混合液中，然后加入氨水和四乙氧基硅烷，室温下搅拌反应，待反应结束后经磁分离、洗涤以制得fe3o4/sio2复合纳米粒子；s3、将步骤s2制得的fe3o4/sio2复合纳米粒子分散于醇水混合液中，然后加入十六烷基三甲基溴化和氨水，搅拌10～30min后，加入1，4-二(三乙氧基硅基)苯和3-氨丙基三乙氧基硅烷，室温搅拌混合均匀后将全部溶液转入高压反应釜中进行反应高温反应，待反应结束后冷却至室温，然后经离心、洗涤即制得fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠；s4、向步骤s3制得的fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠中依次加入naoh、环氧氯丙烷、dmso，40～60℃下反应1～3h，反应结束后用大量去离子水洗涤至中性，得到改性后的fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠。作为上述方案的进一步限定，步骤s1中，fecl2·4h2o、fec13·6h2o的摩尔用量比为1:2；葡聚糖浓度为2～5％；naoh浓度为5～15％。作为上述方案的进一步限定，步骤s1中，加热搅拌反应条件为180～220℃下反应1～3h。作为上述方案的进一步限定，步骤s2中，fe3o4纳米磁珠与氨水、四乙氧基硅烷的用量比为1mg:(0.01～0.05)ml:(0.01～0.03)ml。作为上述方案的进一步限定，步骤s3中，fe3o4/sio2复合纳米粒子与十六烷基三甲基溴化、氨水、1，4-二(三乙氧基硅基)苯、3-氨丙基三乙氧基硅烷的用量比为100mg:(100～150)mg:(0.5～2)ml:(0.1～0.5)ml:(0.01～0.05)ml。作为上述方案的进一步限定，步骤s4中，所述fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠与环氧氯丙烷的用量比为1mg：(5～10)ml。本发明还提供所述的一种新冠肺炎检测用磁珠的制备方法，步骤如下：将fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠与血管紧张素转换酶2(ace2)偶联液在室温下搅拌4～12h，得到表面包覆血管紧张素转换酶2(ace2)的fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠。作为上述方案的进一步限定，所述血管紧张素转换酶2(ace2)偶联液为含0.2mol/lna2co3溶液、ph8.5、血管紧张素转换酶2(ace2)浓度为10mg/ml及1gna2so4的混合溶液。作为上述方案的进一步限定，所述fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠与血管紧张素转换酶2(ace2)偶联液的用量比为1mg：(5～15)ml。与现有技术相比，本发明的有益效果是：(1)本发明将血管紧张素转换酶2(ace2)偶联到葡聚糖修饰的fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠上，利用血管紧张素转换酶2(ace2)对新型冠状病毒(covid-19)的特异性，在吸附过程中细胞膜上的血管紧张素转换酶2(ace2)能够与新型冠状病毒(covid-19)特异性结合，从而能够从较为复杂、新型冠状病毒(covid-19)含量极低的样品中快速分离富集新型冠状病毒(covid-19)，以提高新型冠状肺炎病毒(covid-19)的检测效率和阳性率，且具有准确性高、灵敏度高、操作简便和特异性强等优势。(2)本发明利用葡聚糖修饰的fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠相比于其他磁性材料合成简便、成本低廉，葡聚糖的修饰还增大了fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠的生物相容性和化学稳定性，同时还赋予了fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠表面丰富的可活化羟基，增大了磁珠的比表面积，从而为血管紧张素转换酶2(ace2)配体的偶联提供了大量的活性位点，以制得了一种能够快速富集样品中痕量新型冠状病毒(covid-19)的功能性磁珠。(3)本发明首先采用高温多元醇法合成fe3o4纳米磁珠，然后通过简单、可控的生长诱导腐蚀法制得具有蛋黄-壳结构的fe3o4/sio2/pmo磁珠，通过fe3o4磁性无机有机硅杂化多孔材料的协同作用，大大提高了磁珠的比表面积，从而为血管紧张素转换酶2(ace2)配体的偶联及新型冠状病毒(covid-19)的吸附结合提供了大量的活性位点，以提高新型冠状病毒(covid-19)的检测灵敏度及准确性，从而为新型冠状肺炎病毒(covid-19)的早期筛查提供有效途径。附图说明图1为实施例1制得的改性后的fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠的透射电子显微镜表征结果。图2为实施例1制得的改性后的fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠吸附新冠肺炎病毒后的透射电子显微镜表征结果。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明；应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明；除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备。下面通过具体的实施例子并结合附图对本发明做进一步的详细描述。实施例1本实施例提供一种新冠肺炎检测用磁珠，包括fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠以及包覆在fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠表面的血管紧张素转换酶2(ace2)。所述fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠的制备方法，包括如下步骤：s1、将fecl2·4h2o、fec13·6h2o按摩尔比为1:2溶解于一缩二乙二醇中使fe2+浓度为0.05mol/l，加入葡聚糖，200℃加热搅拌反应20min后，加入naoh，继续加热搅拌反应2h，待反应结束后冷却至室温，经离心分离、洗涤后制得fe3o4纳米磁珠；所述葡聚糖浓度为3％；naoh浓度为10％；s2、将步骤s1制得的fe3o4纳米磁珠分散于醇水混合液中，然后加入氨水和四乙氧基硅烷，室温下搅拌反应，待反应结束后经磁分离、洗涤以制得fe3o4/sio2复合纳米粒子；fe3o4纳米磁珠与氨水、四乙氧基硅烷的用量比为1mg:0.02ml:0.02ml；s3、将步骤s2制得的fe3o4/sio2复合纳米粒子分散于醇水混合液中，然后加入十六烷基三甲基溴化和氨水，搅拌20min后，加入1，4-二(三乙氧基硅基)苯和3-氨丙基三乙氧基硅烷，室温搅拌混合均匀后将全部溶液转入高压反应釜中进行反应高温反应，待反应结束后冷却至室温，然后经离心、洗涤即制得fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠；所述fe3o4/sio2复合纳米粒子与十六烷基三甲基溴化、氨水、1，4-二(三乙氧基硅基)苯、3-氨丙基三乙氧基硅烷的用量比为100mg:120mg:1ml:0.2ml:0.03ml；s4、向步骤s3制得的1mgfe3o4/sio2/pmo纳米磁珠中依次加入15ml1mol/l的naoh、8ml环氧氯丙烷、20mldmso，50℃下反应2h，反应结束后用大量去离子水洗涤至中性，得到改性后的fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠。所述的一种新冠肺炎检测用磁珠的制备方法，步骤如下：将5mgfe3o4/sio2/pmo纳米磁珠与50ml血管紧张素转换酶2(ace2)偶联液在室温下搅拌8h，得到表面包覆血管紧张素转换酶2(ace2)的fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠；所述血管紧张素转换酶2(ace2)偶联液为含0.2mol/lna2co3溶液、ph8.5、血管紧张素转换酶2(ace2)浓度为10mg/ml及1gna2so4的混合溶液。图1为本实施例制得的改性后的fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠的透射电子显微镜表征结果，从图中可以看出，本实施例制得的fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠呈蛋黄-壳结构，且表层含有丰富的介孔孔道，纳米磁珠中丰富的孔道和空腔结构有利于血管紧张素转换酶2(ace2)的负载，因此在吸附过程中能够与新型冠状病毒(covid-19)特异性结合，从而能够从较为复杂、新型冠状病毒(covid-19)含量极低的样品中快速分离富集新型冠状病毒(covid-19)，以提高新型冠状肺炎病毒(covid-19)的检测灵敏度和阳性率。将本实施例制备的表面包覆血管紧张素转换酶2(ace2)的fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠加入到5ml盥洗液中，常温条件下吸附样品中的新型冠状肺炎病毒(covid-19)，吸附时间为10min，期间颠倒混匀2次。然后磁分离去除上清，得到利表面包覆血管紧张素转换酶2(ace2)的fe3o4/sio2/pmo磁珠吸附的新型冠状肺炎病毒(covid-19)，如图2所示，新型冠状肺炎病毒(covid-19)包被在磁珠表面，磁珠表面孔道变得模糊，对新型冠状肺炎病毒(covid-19)的吸附效率达到了99.9％。实施例2-5实施例2-5提供一种新冠肺炎检测用磁珠，与实施例1相比，不同之处在于，改变所述的新冠肺炎检测用磁珠的制备方法中fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠与血管紧张素转换酶2(ace2)偶联液的用量比，其余与实施例1均相同，在此不再赘述。实施例用量比(mg：ml)吸附效率(％)11:1099.921:08731:59841:159951:2091由上表结果可知，改变所述新冠肺炎检测用磁珠制备方法中fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠与血管紧张素转换酶2(ace2)偶联液的用量比，会对制得的纳米磁珠的吸附性能产生显著影响，且随着fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠与血管紧张素转换酶2(ace2)偶联液用量比的增大，制得的纳米磁珠的吸附性能先增大后减小；同时对比实施例1与实施例2结果可知，本发明通过在fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠表面偶联结合上血管紧张素转换酶2(ace2)，可协同提高fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠对新冠肺炎病毒的特异性吸附选择性。实施例6-9实施例6-9提供一种新冠肺炎检测用磁珠，与实施例1相比，不同之处在于，改变所述fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠制备方法步骤s1中葡聚糖的用量，其余与实施例1均相同，在此不再赘述。实施例葡聚糖用量(％)吸附效率(％)6085729685999699由上表结果可知，改变所述fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠制备方法步骤s1中葡聚糖的用量，会对制得的纳米磁珠的吸附性能产生显著影响，同时对比实施例1与实施例6结果可知，本发明通过采用葡聚糖作为修饰剂制备fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠，可协同提高fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠对新冠肺炎病毒的特异性吸附选择性。实施例10-13实施例10-13提供一种新冠肺炎检测用磁珠，与实施例1相比，不同之处在于，改变所述fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠制备方法步骤s1中naoh浓度，其余与实施例1均相同，在此不再赘述。实施例naoh浓度(％)吸附效率(％)1028811594121597131891对比实施例1与实施例10-13结果可知，改变所述fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠制备方法步骤s1中naoh浓度，会对制得的纳米磁珠的吸附性能产生显著影响，且随着氢氧化钠浓度的增大，制得的纳米磁珠的吸附性能先增大后减小，当氢氧化钠浓度为10％时，制得的纳米磁珠的新冠肺炎病毒的吸附性能最佳。实施例14-16实施例14-16提供一种新冠肺炎检测用磁珠，与实施例1相比，不同之处在于，改变所述fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠制备方法步骤s2中，fe3o4纳米磁珠与氨水、四乙氧基硅烷的用量比，其余与实施例1均相同，在此不再赘述。实施例用量比(mg：ml：ml)吸附效率(％)141:0:081151:0.01:0.0395161:0.05:0.0197对比实施例1与实施例14-16结果可知，改变所述fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠制备方法步骤s2中，fe3o4纳米磁珠与氨水、四乙氧基硅烷的用量比，会对制得的纳米磁珠的吸附性能产生显著影响，在本发明限定范围内制得的纳米磁珠对新冠肺炎病毒均具有较好的特异性吸附能力；同时对比实施例1与实施例14结果可知，本发明通过在fe3o4纳米磁珠表面包覆一层二氧化硅，能够显著提高fe3o4纳米磁珠对新冠肺炎病毒吸附性能，这是由于包覆二氧化硅后有助于增大fe3o4纳米磁珠的比表面积。实施例17-19实施例17-19提供一种新冠肺炎检测用磁珠，与实施例1相比，不同之处在于，改变所述fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠制备方法步骤s3中，fe3o4/sio2复合纳米粒子与十六烷基三甲基溴化、氨水、1，4-二(三乙氧基硅基)苯、3-氨丙基三乙氧基硅烷的用量比，其余与实施例1均相同，在此不再赘述。实施例用量比(mg：ml：ml)吸附效率(％)17100:0:0:0:08318100:100:2:0.5:0.059519100:150:0.5:0.1:0.0194对比实施例1与实施例17-19结果可知，改变所述fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠制备方法步骤s3中，fe3o4/sio2复合纳米粒子与十六烷基三甲基溴化、氨水、1，4-二(三乙氧基硅基)苯、3-氨丙基三乙氧基硅烷的用量比，会对制得的纳米磁珠的吸附性能产生显著影响，在本发明限定范围内制得的纳米磁珠对新冠肺炎病毒均具有较好的特异性吸附能力；对比实施例1与实施例17结果可知，通过在fe3o4/sio2纳米磁珠表面形成多孔无机有机杂化硅烷pmo中空的多孔壳层，能够显著提高fe3o4/sio2的比表面积，以协同提高纳米磁珠对新冠肺炎病毒吸附性能。实施例20-23实施例20-23提供一种新冠肺炎检测用磁珠，与实施例1相比，不同之处在于，改变所述fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠制备方法步骤s4中，所述fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠与环氧氯丙烷的用量比，其余与实施例1均相同，在此不再赘述。实施例用量比(mg：ml)吸附效率(％)201:086211:595221:1097231:1291由上表结果可知，改变所述fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠制备方法步骤s4中，所述fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠与环氧氯丙烷的用量比，会对制得的纳米磁珠的吸附性能产生显著影响，且随着环氧氯丙烷用量的增大，制得的纳米磁珠的吸附性能先增大后减小，当fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠与环氧氯丙烷的用量比为1mg：8ml时，活化后纳米磁珠的吸附性能最佳；同时对比实施例1与实施例20结果可知，本发明通过采用环氧氯丙烷活化fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠，可协同提高fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠对新冠肺炎病毒的特异性吸附选择性，这是由于环氧基易于血管紧张素转换酶2(ace2)上的氨基或巯基发生反应，从而使血管紧张素转换酶2(ace2)偶联结合到fe3o4/sio2/pmo纳米磁珠上，以提高其对新冠肺炎病毒的特异性吸附能力。以上所述，仅为本发明的说明实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，做出的若干改进和补充也应视为本发明的保护范围；凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明精神和范围的情况下，利用以上所揭示的技术内容做出的些许更改、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所做的任何等同变化的更改、修饰与演变，均仍属于本发明的保护范围。当前第1页12