一种磁性固定化酶纳米反应器及其制备方法与应用与流程

本发明属于生物催化技术领域，涉及生物催化剂酶，尤其涉及一种磁性固定化酶纳米反应器及其制备方法与应用。

背景技术：

磁性纳米颗粒(magneticnanoparticles，mnps)是在20世纪80年代以后发展起来的新型磁性材料，主要包括铁、锰、钴等元素和氧、硫组成的复合物。由于磁性纳米颗粒粒径小、比表面积大、吸附能力强、表面灵活易于修饰，因此在催化反应、生物分离、靶向载药、磁共振成像、分析化学等领域均得到了广泛应用。固定化酶在使用后通常需要经过离心分离或过滤等方法进行回收，在操作过程中容易造成催化剂的损失且复杂耗时。磁性固定化酶在完成催化后可使用外加磁场将其回收，并使用不同有机溶剂、盐溶液清洗，上述操作不仅方便快捷，还能降低成本。然而，磁性固定化酶在盐溶液中清洗或使用时，容易导致酶从磁性颗粒表面脱附，使其失去活性。

金属有机框架(metal-organicframeworks，mofs)是一种由金属离子或金属簇与有机配体通过配位键连接而成的多孔晶体材料，且具有灵活性表面特性、较大的比表面积和孔体积。由于其独特的性质，包括可调节的孔隙率、极高的表面积和化学/热稳定性，以及较高的可重复利用性，金属有机框架在酶固定化方面有巨大的应用前景。根据合成方法，金属有机框架-酶复合材料可分为五种类型：表面物理吸附、表面共价连接、孔捕获、仿生矿化和共沉淀。表面吸附和共价连接很容易实现，通过物理和化学作用力将酶固定在金属有机框架表面，但是这两种方法对固定化酶均无保护作用，因为酶直接暴露于环境中很容易失活。孔捕获法固定化酶具有良好的重复使用性和稳定性，然而，由于大多数酶分子的尺寸都大于金属有机框架的孔径，能进入金属有机框架空腔的酶很少，因此不是一种通用的方法。共沉淀法包裹酶需要使用聚乙烯吡咯烷酮作为封盖剂，成本高、不易制备，且酶的生物活性温度范围小，稳定性差。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种磁性固定化酶纳米反应器及其制备方法与应用，利用磁性纳米颗粒和金属有机框架共同构建磁性固定化酶纳米反应器，通过外加磁场就可实现催化剂的回收利用，具有可磁力回收清洗并重复使用的特性以及良好的耐有机和耐热能力。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种磁性固定化酶纳米反应器的制备方法，该方法包括以下步骤：

1)将氯化铁及氯化亚铁与水混合，之后加热反应，得到四氧化三铁磁性纳米颗粒；

2)将四氧化三铁磁性纳米颗粒及聚多巴胺盐酸盐与缓冲液混合，之后搅拌反应，得到表面附着聚多巴胺的四氧化三铁磁性纳米颗粒；

3)将表面附着聚多巴胺的四氧化三铁磁性纳米颗粒及酶与水混合，之后先将ph值调至8.0-10.0并搅拌，再将ph值调至7.0-8.0并搅拌，得到磁性固定化酶；

4)将磁性固定化酶、金属盐及咪唑类化合物与水混合，之后搅拌反应，即得到所述的磁性固定化酶纳米反应器。

进一步地，步骤1)中，所述的氯化铁在水中的质量浓度为0.01-100g/l，所述的氯化铁与氯化亚铁的质量比为(0.1-10):1。

进一步地，步骤1)中，加热反应过程中，反应温度为100-200℃，反应时间为1-2000min，反应压力为2.5-3.5mpa。在上述数值范围内，不同反应温度和反应时间下都能合成四氧化三铁磁性纳米颗粒，区别在于颗粒的尺寸不同。

进一步地，步骤2)中，所述的缓冲液为tris-hcl缓冲液，该tris-hcl缓冲液的ph值为7.0-10.0，浓度为0.01-100g/l；所述的聚多巴胺盐酸盐在缓冲液中的质量浓度为0.01-15g/l，所述的四氧化三铁磁性纳米颗粒与聚多巴胺盐酸盐的质量比为(0.1-10):1。

进一步地，步骤2)中，搅拌反应过程中，反应温度为4-40℃，反应时间为1-2000min。该搅拌反应的目的是在四氧化三铁磁性纳米颗粒表面附着一层聚多巴胺盐酸盐，不同反应时间长短的结果是附着的厚度不一样。

进一步地，步骤3)中，所述的酶在水中的质量浓度为0.01-10g/l，所述的表面附着聚多巴胺的四氧化三铁磁性纳米颗粒与酶质量比为(0.2-5):1；所述的酶包括脂肪转移酶或脂肪水解酶中的一种或更多种；将ph值调至8.0-10.0后，搅拌0.1-5.0h；将ph值调至7.0-8.0后，搅拌0.1-5.0h。ph值的调节采用氢氧化钠作为碱、盐酸作为酸进行调节。

进一步地，步骤4)中，所述的金属盐在水中的质量浓度为0.01-15g/l，所述的磁性固定化酶、金属盐与咪唑类化合物的质量比为(0.2-5):1:(0.5-5)；所述的金属盐包括氯化锌、硝酸锌或硝酸钴中的一种或更多种，所述的咪唑类化合物包括二甲基咪唑、苯并咪唑或硝基咪唑中的一种或更多种。咪唑类化合物作为有机配体，可通过配位键与金属阳离子连接，从而影响金属有机框架的孔径尺寸与孔道结构。

进一步地，步骤4)中，搅拌反应过程中，反应温度为4-40℃，反应时间为10-3000min。搅拌采用磁力搅拌或机械搅拌。搅拌反应后采用冷冻干燥、真空干燥或鼓风干燥方式进行干燥。该搅拌反应的目的是在磁性固定化酶表面矿化一层金属有机框架，不同反应时间长短的结果是矿化的厚度不一样。

一种磁性固定化酶纳米反应器，该磁性固定化酶纳米反应器采用所述的方法制备而成。

一种磁性固定化酶纳米反应器在生物催化反应中的应用。

本发明在制备磁性固定化酶纳米反应器时，先将氯化铁与氯化亚铁混合，在水相环境中反应合成四氧化三铁磁性纳米颗粒；所得反应物与聚多巴胺盐酸盐混合，合成表面附着聚多巴胺的四氧化三铁磁性纳米颗粒；接着将脂肪酶均匀分散在碱性水相中，此时，脂肪酶的羧基失质子化，其疏水基团暴露；然后调整体系ph值至中性，磁性纳米颗粒带正电荷，而此时脂肪酶处在等电点以上的环境中，带负电荷，两者因静电引力以及疏水作用而结合，而且在脂肪酶疏水部位结构闭合的过程中会将磁性纳米颗粒装载在其内部，从而合成了磁性固定化酶；进一步将磁性固定化酶与金属盐和咪唑类化合物反应，将所得产物进行干燥，即制得磁性固定化酶纳米反应器。本发明赋予酶催化剂易清洗、可重复使用的特性以及良好的耐有机和耐热能力。

本发明以磁性纳米颗粒和金属有机框架作为载体，采用仿生矿化的方式，将酶固定在载体中形成负载催化系统。仿生矿化技术可以扩大酶的生物活性温度范围，提高酶的稳定性，具有成本低、制备方便、效率高的特点。而且，通过仿生矿化合成的金属有机框架/酶复合，酶被金属有机框架的骨架所包围，金属有机框架的外壳可以保护酶不受反应环境的影响，同时骨架的孔隙允许小分子底物和产物选择性的快速扩散。因此，在磁性固定化酶外表面覆盖金属有机框架层，可使酶具有易清洗和磁性回收功能，同时也增加酶的稳定性。

本发明中，磁性纳米颗粒作为内核可以使催化剂更容易回收利用，降低成本；金属有机框架作为外壳可以保护催化剂免受反应环境的干扰，从而提高其稳定性，包括良好的热稳定性和化学稳定性。上述两者的结合使用能够在生物催化领域开辟出更广阔的市场。

与现有技术相比，本发明具有以下特点：

1)以磁性纳米颗粒作为内核，利用外加磁场就可以实现固定化酶的分离与回收，显著降低回收清洗再利用所需的成本；

2)通过将磁性纳米颗粒表面包裹疏水的聚多巴胺层，不仅提高磁性纳米颗粒的稳定性，也为后续酶的疏水吸附提供结合位点；

3)利用ph循环法将酶附着在外层为疏水聚多巴胺的磁性纳米颗粒表面，使得酶的活性位点充分暴露，提高了酶的催化性能；

4)金属有机框架外层可保护酶免受反应环境的破坏，从而提高其稳定性，包括热稳定性和有机溶剂稳定性；

5)本发明工艺流程简单，反应条件易于控制，延长了酶的使用寿命，节约了成本，可实现大规模的工业化生产。

附图说明

图1为实施例1中制得的磁性固定化酶纳米反应器的tem图；

图2为实施例1中制得的磁性固定化酶纳米反应器的ftir图；

图3为实施例1中制得的磁性固定化酶纳米反应器的xrd图；

图4为实施例1中制得的磁性固定化酶纳米反应器的tga图；

图5为实施例1中制得的磁性固定化酶纳米反应器的磁学性能图。

图1-图5中，a表示四氧化三铁磁性纳米颗粒，b表示表面附着聚多巴胺的四氧化三铁磁性纳米颗粒，c表示磁性固定化酶，d表示磁性固定化酶纳米反应器。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：

取0.35g氯化铁和1.20g氯化亚铁，与1l水混合，并充分溶解。将该混合溶液置于高压反应釜中，密封，设置反应温度为198℃，反应压力为3mpa，保温时间为1990min。反应完成后，将所得液态反应物冷却后用超纯水和乙醇各洗三次，真空干燥。取0.24g所得干燥物和0.24g聚多巴胺盐酸盐，与0.02ltris-hcl缓冲液(0.02g/l，ph7.5)混合，超声分散均匀。将该混合溶液于机械搅拌装置上剧烈搅拌2000min，将所得液态反应物用超纯水和乙醇各洗三次，进行真空干燥。取0.2g所得干燥物和0.4g非固定化的可发生转酯化的脂肪酶，在0.1l超纯水中混合均匀。先用氢氧化钠调ph值至9.8，机械搅拌0.1h，再用盐酸调ph值至7.2，机械搅拌0.4h，将所得液态反应物用超纯水洗三次，进行冷冻干燥。取0.2g所得干燥物和0.66g2-甲基咪唑，分散在0.05l超纯水，将该混合溶液于机械搅拌装置上轻微搅拌5min，加入0.6g硝酸锌，继续轻微搅拌24h，将所得液态反应物用超纯水洗三次，进行冷冻干燥，即得磁性固定化酶纳米反应器。

将所得磁性固定化酶纳米反应器颗粒进行形貌学观察和性能表征，形貌学观察结果见图1。从tem图中可以看出，合成的四氧化三铁磁性纳米颗粒呈现出较均一的球形，直径约为400nm，表面附着的聚多巴胺盐酸盐层约为27nm，酶的固定和金属有机框架的矿化都没有改变颗粒的形状，仍然是完整光滑的球形。颗粒的化学基团和结晶性结果见图2和图3，可以看到图中的特征峰证明了颗粒含有的各个组成部分，包括四氧化三铁、聚多巴胺盐酸盐、酶和金属有机框架。颗粒的热稳定性结果见图4，可以看到矿化了金属有机框架层后，颗粒在高温下的损失率明显降低。颗粒的磁学性能见图5，表明了在反应完成后，磁性固定化酶纳米反应器颗粒可以很容易的通过外部磁铁从反应介质中进行分离和回收。

将磁性固定化酶纳米反应器用于催化胭脂树橙与甘油的酯交换反应：取2g胭脂树橙、30g甘油和0.5g磁性固定化酶纳米反应器颗粒，与4l溶剂(2-甲基-2-丁醇和四氢呋喃的混合溶液，体积比为1:4)混合，并充分溶解。将该混合溶液置于振荡培养箱中，设置温度为55℃，转速为180rpm，时间为40h。反应结束后，仅需要一块4kg的钕磁铁，就能在短短十几秒内将该磁性固定化酶纳米反应器从反应后的溶液中分离出来，清洗后可供重复使用。而且，使用磁性固定化酶纳米反应器的反应物转化率为31％，而使用自由酶的反应物转化率几乎为0，表明了相较于自由酶，该磁性固定化酶纳米反应器可以提高酶的催化性能，并且在有机介质中仍有较强的催化活性。

实施例2：

一种磁性固定化酶纳米反应器，其制备方法包括以下步骤：

1)将氯化铁及氯化亚铁与水混合，之后加热反应，得到四氧化三铁磁性纳米颗粒；

2)将四氧化三铁磁性纳米颗粒及聚多巴胺盐酸盐与缓冲液混合，之后搅拌反应，得到表面附着聚多巴胺的四氧化三铁磁性纳米颗粒；

3)将表面附着聚多巴胺的四氧化三铁磁性纳米颗粒及酶与水混合，之后先将ph值调至8.0并搅拌，再将ph值调至8.0并搅拌，得到磁性固定化酶；

4)将磁性固定化酶、金属盐及咪唑类化合物与水混合，之后搅拌反应，即得到磁性固定化酶纳米反应器。

步骤1)中，氯化铁在水中的质量浓度为0.01g/l，氯化铁与氯化亚铁的质量比为10:1。加热反应过程中，反应温度为100℃，反应时间为2000min。

步骤2)中，缓冲液为tris-hcl缓冲液，该tris-hcl缓冲液的ph值为7.0，浓度为100g/l；聚多巴胺盐酸盐在缓冲液中的质量浓度为0.01g/l，四氧化三铁磁性纳米颗粒与聚多巴胺盐酸盐的质量比为10:1。搅拌反应过程中，反应温度为4℃，反应时间为2000min。

步骤3)中，酶在水中的质量浓度为0.01g/l，表面附着聚多巴胺的四氧化三铁磁性纳米颗粒与酶质量比为5:1；酶包括脂肪转移酶及脂肪水解酶；将ph值调至8.0后，搅拌5.0h；将ph值调至7.0后，搅拌5.0h。

步骤4)中，金属盐在水中的质量浓度为0.01g/l，磁性固定化酶、金属盐与咪唑类化合物的质量比为5:1:0.5；金属盐为氯化锌，咪唑类化合物为二甲基咪唑。搅拌反应过程中，反应温度为40℃，反应时间为10min。

实施例3：

一种磁性固定化酶纳米反应器，其制备方法包括以下步骤：

1)将氯化铁及氯化亚铁与水混合，之后加热反应，得到四氧化三铁磁性纳米颗粒；

2)将四氧化三铁磁性纳米颗粒及聚多巴胺盐酸盐与缓冲液混合，之后搅拌反应，得到表面附着聚多巴胺的四氧化三铁磁性纳米颗粒；

3)将表面附着聚多巴胺的四氧化三铁磁性纳米颗粒及酶与水混合，之后先将ph值调至10.0并搅拌，再将ph值调至7.0并搅拌，得到磁性固定化酶；

4)将磁性固定化酶、金属盐及咪唑类化合物与水混合，之后搅拌反应，即得到磁性固定化酶纳米反应器。

步骤1)中，氯化铁在水中的质量浓度为100g/l，氯化铁与氯化亚铁的质量比为0.1:1。加热反应过程中，反应温度为200℃，反应时间为1min。

步骤2)中，缓冲液为tris-hcl缓冲液，该tris-hcl缓冲液的ph值为10.0，浓度为0.01g/l；聚多巴胺盐酸盐在缓冲液中的质量浓度为15g/l，四氧化三铁磁性纳米颗粒与聚多巴胺盐酸盐的质量比为0.1:1。搅拌反应过程中，反应温度为40℃，反应时间为1min。

步骤3)中，酶在水中的质量浓度为10g/l，表面附着聚多巴胺的四氧化三铁磁性纳米颗粒与酶质量比为0.2:1；酶为脂肪水解酶；将ph值调至10.0后，搅拌0.1h；将ph值调至8.0后，搅拌0.1h。

步骤4)中，金属盐在水中的质量浓度为15g/l，磁性固定化酶、金属盐与咪唑类化合物的质量比为0.2:1:5；金属盐包括硝酸锌及硝酸钴，咪唑类化合物包括苯并咪唑及硝基咪唑。搅拌反应过程中，反应温度为4℃，反应时间为3000min。

实施例4：

一种磁性固定化酶纳米反应器，其制备方法包括以下步骤：

1)将氯化铁及氯化亚铁与水混合，之后加热反应，得到四氧化三铁磁性纳米颗粒；

2)将四氧化三铁磁性纳米颗粒及聚多巴胺盐酸盐与缓冲液混合，之后搅拌反应，得到表面附着聚多巴胺的四氧化三铁磁性纳米颗粒；

3)将表面附着聚多巴胺的四氧化三铁磁性纳米颗粒及酶与水混合，之后先将ph值调至9.0并搅拌，再将ph值调至7.5并搅拌，得到磁性固定化酶；

4)将磁性固定化酶、金属盐及咪唑类化合物与水混合，之后搅拌反应，即得到磁性固定化酶纳米反应器。

步骤1)中，氯化铁在水中的质量浓度为50g/l，氯化铁与氯化亚铁的质量比为5:1。加热反应过程中，反应温度为150℃，反应时间为1200min。

步骤2)中，缓冲液为tris-hcl缓冲液，该tris-hcl缓冲液的ph值为8.0，浓度为50g/l；聚多巴胺盐酸盐在缓冲液中的质量浓度为4g/l，四氧化三铁磁性纳米颗粒与聚多巴胺盐酸盐的质量比为6:1。搅拌反应过程中，反应温度为24℃，反应时间为1300min。

步骤3)中，酶在水中的质量浓度为4g/l，表面附着聚多巴胺的四氧化三铁磁性纳米颗粒与酶质量比为3:1；酶为脂肪转移酶；将ph值调至9.0后，搅拌2.4h；将ph值调至7.5后，搅拌2.4h。

步骤4)中，金属盐在水中的质量浓度为7g/l，磁性固定化酶、金属盐与咪唑类化合物的质量比为2:1:2；金属盐为硝酸锌，咪唑类化合物为硝基咪唑。搅拌反应过程中，反应温度为23℃，反应时间为2100min。

综上所述，本发明构建磁性固定化酶纳米反应器的方法所需的设备简单，利用外加磁场就可以实现催化剂的分离或回收利用，不仅方便快捷，还降低了成本；利用ph循环法将酶包裹在改性的磁性纳米颗粒表面，使得酶的活性位点充分暴露，提高了酶的催化性能；金属有机框架作为外壳可以保护酶免受反应环境的破坏，从而提高了热稳定性、有机溶剂稳定性和离子稳定性；本发明工艺流程简单，反应条件易于控制，延长了酶的使用寿命，节约了成本，因此该技术适合应用于大规模的工业化生产。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。