本发明涉及环境微生物领域，特别地涉及一种耐高温复合菌制剂。
背景技术：
为了减少环境应激中的温度、酸、氧等因素对功能菌的负面影响，在研发污染降解菌株的同时，必须兼顾功能菌的耐热、耐酸、耐氧等能力的提高。研究表明，功能菌的稳定性主要由其胞内各种应激蛋白水平决定，可通过采用多种亚致死压力应激提高细胞内各种应激蛋白表达水平，从而提高益生菌的稳定性。
嗜热微生物是指最适宜生长温度在45℃以上的微生物。嗜热菌多生长在土壤、肥堆、热泉和火山地带，在晒热或自热的生境中，也常有存在。根据嗜热菌适应温度范围的不同，对嗜热菌分成生理上不同的三类:生长最高温度在70℃以上的极端嗜热菌、生长最高温度在50℃～65℃的兼性嗜热菌和生长最高温度在15℃～50℃的耐热细菌。
嗜热微生物不仅能耐受高温，而且能在高温下生长繁殖，其生存环境需要较高的温度。这与普通芽孢细菌的耐热性不同，普通芽孢细菌在高温下形成芽孢抵抗逆境，待环境条件恢复，芽孢萌发成营养体，而芽孢不具有繁殖能力，只是抗逆性休眠体。
生物固定化技术是现代生物工程领域中的一项新兴技术，为充分发挥高效菌种在难降解有机污染物治理中的降解潜力，防止其泄漏而引起生态问题提供了一个十分重要的方法。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供一种耐高温复合菌制剂。
本发明是以如下技术方案实现的：
一种耐高温复合菌制剂，获得经改造的转基因细菌，将转基因细菌接种至富集培养基，按常规方法制备菌悬液，向菌悬液中加入的炭粉吸附，之后依次加入海藻酸钠、聚乙烯醇、双蒸水、氧化石墨烯水溶液，氧化石墨烯使海藻酸钠和聚乙烯醇沉积，加热溶解后静置后加入氯化钙饱和硼酸溶液使菌体与其他成分交联获得高温复合菌剂。
进一步地，所述经改造的转基因细菌包括：
(a)具有seqidno:1、seqidno:2或seqidno:3所示的核苷酸序列；
(b)在(a)中的核苷酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或多个核苷酸且编码与(a)相同的氨基酸序列的核苷酸序列。
进一步地，包括表达盒，所述表达盒包括在有效连接的调控序列调控下的上述核苷酸序列。
进一步地，包括重组载体，所述重组载体包括权利要求3所述核苷酸序列或上述表达盒。
进一步地，所述改造的转基因细菌包括嗜热基因，所述嗜热基因的筛选方法包括构建堆肥样品嗜热基因文库，优选地，应用大肠杆菌表达系统构建堆肥样品耐高温基因文库。
进一步地，分别在不同环境温度下培养插入外源基因的大肠杆菌，用常见通用引物和古菌特异性引物测序鉴定插入片段长度及具体序列，将所得到的序列去除载体后，获得耐高温相关基因，之后随机插入芽孢杆菌对芽孢杆菌进行基因改造。
进一步地，将重组克隆载体分别用热激方法转化枯草芽孢杆菌感受态细胞，挑取白色菌落，培养后提取质粒，经酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体中分别对应的插入上述核苷酸序列。
本发明具有以下有益效果：嗜热微生物的基因序列同已知的微生物同源性存在着显著差异，接近半数的功能基因的序列还未确认。充分利用超嗜热古细菌的基因资源、发现和鉴定其未知基因的功能，对确定超嗜热酶的分子机制、酶学特性和对生命起源与生命进化的探索都有重要的理论意义。在此基础上，开发超嗜热微生物中与热耐受力有关的相关调节基因，并对上述基因进行合理的开发使用，在生物治污领域具有广泛的应用价值。本发明获得转基因枯草芽孢杆菌可耐受高温环境，适用于有深度污水处理需求的工业场景。生物固定化技术是现代生物工程领域中的一项新兴技术，为充分发挥高效菌种在难降解有机污染物治理中的降解潜力，防止其泄漏而引起生态问题提供了一个十分重要的方法。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明作进一步地详细描述，以下试剂或菌剂若无特殊说明，均为市售试剂或菌剂。
本领域技术人员所熟知的，dna典型的以双链形式存在。在这种排列中，一条链与另一条链互补，反之亦然。由于dna在植物中复制产生了dna的其它互补链。
本发明包括对序列表中示例的多核苷酸及其互补链的使用。本领域常使用的“编码链”指与反义链结合的链。为了在体内表达蛋白质，典型将dna的一条链转录为一条mrna的互补链，它作为模板翻译出蛋白质。mrna实际上是从dna的“反义”链转录的。
“有义”或“编码”链有一系列密码子(密码子是三个核苷酸，一次读三个可以产生特定氨基酸)，其可作为开放阅读框(orf)阅读来形成目的蛋白质或肽。本发明还包括与示例的dna有相当功能的rna。
基本同源的序列是一段核酸分子，该核酸分子在高度严格条件下能够和相匹配的另一段核酸分子的互补链发生特异性杂交。促进dna杂交的适合的严格条件，例如，大约在45℃条件下用6.0×氯化钠/柠檬酸钠(ssc)处理，然后在50℃条件下用2.0×ssc洗涤，这些条件对本领域技术人员是公知的。例如，在洗涤步骤中的盐浓度可以选自低度严格条件的约2.0×ssc、50℃到高度严格条件的约0.2×ssc、50℃。此外，洗涤步骤中的温度条件可以从低度严格条件的室温约22℃，升高到高度严格条件的约65℃。温度条件和盐浓度可以都发生改变，也可以其中一个保持不变而另一个变量发生改变。优选地，本发明所述严格条件可为在6×ssc、0.5％sds溶液中，在65℃下与seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3发生特异性杂交，然后用2×ssc、0.1％sds和1×ssc、0.1％sds各洗膜1次。
使用标准技术可以修饰基因和容易的构建基因变异体。例如，本领域熟知制造点突变的技术。又例如美国专利号5605793描述了在随机断裂后使用dna重装配产生其它分子多样性的方法。可以使用商业化核酸内切酶制造全长基因的片段，并且可以按照标准程序使用核酸外切酶。
由于遗传密码子的丰余性，多种不同的dna序列可以编码相同的氨基酸序列。产生这些编码相同或基本相同的蛋白的可替代dna序列正在本领域技术人员的技术水平内。这些不同的dna序列包括在本发明的范围内。所述“基本上相同的”序列是指有氨基酸取代、缺失、添加或插入但实质上不影响杀虫活性的序列，亦包括保留杀虫活性的片段。
在本发明中，与seqidno:1、seqidno:2或seqidno:3所表达的氨基酸序列具有一定同源性。这些序列与本发明序列类似性/相同性典型的大于78％，优选的大于85％，更优选的大于90％，甚至更优选的大于95％，并且可以大于99％。
根据更特定的相同性和/或类似性范围定义本发明的优选的多核苷酸和蛋白质。例如与本发明示例的序列有78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性和/或类似性。
实施例1：
嗜热微生物的基因序列同已知的微生物同源性存在着显著差异，接近半数的功能基因的序列还未确认。充分利用超嗜热古细菌的基因资源、发现和鉴定其未知基因的功能，对确定超嗜热酶的分子机制、酶学特性和对生命起源与生命进化的探索都有重要的理论意义。在此基础上，开发超嗜热微生物中与热耐受力有关的相关调节基因，并对上述基因进行合理的开发使用，在生物治污领域具有广泛的应用价值。
为实现上述目的，构建堆肥样品嗜热基因文库，具体地，样品分别取自江苏5家有机肥料厂的高温期畜禽粪便及秸秆堆肥，取样量为100g，运输过程中保持45-55℃的温度环境，将上述5种样品充分混合后，置于液体富集培养基中，55℃培养3天，采取冻融法裂解细胞并提取微生物总dna，纯化dna样品。
实施例2：
将实施例1中纯化获得的dna样品进行测序，应用大肠杆菌表达系统(购自上海邦景实业有限公司)构建堆肥样品耐高温基因文库。具体地，将基因组总dna随机打断至50bp、100bp、150bp、200bp、250bp、500bp、1.0kb、1.5kb、2.0kb长度的片段，将打断后的dna片段与接头连接，之后上机测序获得短序列文库(50bp、100bp、150bp、200bp、250bp、500bp序列)，采用cre-lox建库技术构建大片段文库(1.0kb、1.5kb、2.0kb序列)，在大片段两端连接loxp接头后进行环化测序，通过solexa测序平台完成基因组测序(南京金斯瑞)。
实施例3：
分别在不同环境温度下培养实施例2中插入外源基因的大肠杆菌。具体地，将上述插入外源基因的大肠杆菌接种至lb培养基(固体培养基)进行耐高温测试，温度分别为45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃，培养3天，每个温度条件设置3个培养皿，3天后，每个培养皿挑取20-30个长势旺盛的克隆进行测序。
分别用常见通用引物和古菌特异性引物测序鉴定插入片段长度及具体序列，将所得到的序列去除载体后，获得耐高温相关基因tns-013、aed-23w、tns-156、tns-18z、row-283、ncs-016、tns170x、x233zb、i318w-01，经过blast比对，将与芽孢杆菌同源性较高的aed-23w、ncs-016、x233zb进行密码子改造，之后随机插入芽孢杆菌对芽孢杆菌进行基因改造。
实施例4：
获得改造后的基因aed-23w核苷酸序列如seqidno:1所示，ncs-016核苷酸序列如seqidno:2所示，x233zb核苷酸序列如seqidno:3所示，上述序列5’端还连接有ncoi酶切位点，3’端还连接有swai酶切位点，所述aed-23w、ncs-016、x233zb的核苷酸序列由南京金斯瑞合成。
克隆载体pgem-t(购自promega)中分别连接所述合成的aed-23w、ncs-016、x233zb核苷酸序列，连接过程参考说明书，得到重组克隆载体pgem-aed-23w、pgem-ncs-016、pgem-x233zb(载体结构：amp表示氨苄青霉素抗性基因；f1表示噬菌体f1的复制起点；lacz为lacz起始密码子；sp6为sp6rna聚合酶启动子；t7为t7rna聚合酶启动子；aed-23w/ncs-016/x233zb为aed-23w/ncs-016/x233zb核苷酸序列；mcs为多克隆位点)。
将重组克隆载体pgem-aed-23w、pgem-ncs-016、pgem-x233zb分别用热激方法转化枯草芽孢杆菌感受态细胞(市售)。挑取白色菌落，培养后提取质粒，经酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体pgem-aed-23w、pgem-ncs-016、pgem-x233zb中分别对应的插入所述aed-23w/ncs-016/x233zb核苷酸序列。
实施例5：转基因枯草芽孢杆菌的耐高温测试
将上述插入外源基因的枯草芽孢杆菌分别接于50mllb液体培养基中，插入aed-23w核苷酸序列接种24瓶，分8组，每组3瓶，插入ncs-016核苷酸序列接种24瓶，分8组，每组3瓶，插入x233zb核苷酸序列接种24瓶，分8组，每组3瓶，取未经改造的枯草芽孢杆菌接于50mllb液体培养基中，分八组，每组1瓶；上述菌体接种量为1g，分别于40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃培养2h，测定od值，测定结果如表1所示：
表1不同温度条件下2小时od值测定
结果表明，转入aed-23w核苷酸序列的枯草芽孢杆菌40℃-60℃增殖较快，50℃-55℃长势旺盛；转入ncs-016核苷酸序列的枯草芽孢杆菌40℃-70℃均能保持较快的增殖速度，在40℃-70℃具有旺盛涨势；转入x233zb核苷酸序列的枯草芽孢杆菌40℃-65℃均能保持较快的增殖速度，在45℃-60℃具有旺盛涨势；转入aed-23w核苷酸序列的枯草芽孢杆菌和转入x233zb核苷酸序列的枯草芽孢杆菌在75℃下明显观察到高温对其生长发育起到了抑制作用。
实施例6：
制备耐高温复合菌制剂，将转入aed-23w核苷酸序列的枯草芽孢杆菌、转入ncs-016核苷酸序列的枯草芽孢杆菌、转入x233zb核苷酸序列的枯草芽孢杆菌分别固定进入石墨烯基复合材料。
首先，将转入aed-23w核苷酸序列的枯草芽孢杆菌、转入ncs-016核苷酸序列的枯草芽孢杆菌、转入x233zb核苷酸序列的枯草芽孢杆菌等质量比例接种至富集培养基，50℃下培养，离心去除上清液得菌体，按常规方法制备菌悬液，向菌悬液中加入0.5wt％的炭粉吸附5h，之后依次加入海藻酸钠、聚乙烯醇、双蒸水、氧化石墨烯水溶液，氧化石墨烯使海藻酸钠和聚乙烯醇沉积，加热溶解后静置于50℃后加入1.5wt％cacl2饱和硼酸溶液使菌体与其他成分交联获得高温复合菌剂，固定剂中氧化石墨烯的含量为0.4％，聚乙烯醇的含量为3％，海藻酸钠的含量为70％，余量为菌体，生理盐水清洗所述高温复合菌后，可常温保存。
实施例7：
小试：本实验所用测试污泥取自苏州市福星污水处理厂二沉池的回流污泥，取样量为1ml，静置沉淀30min后，通过2mm孔径的筛网除去其中颗粒较大的杂质，分别取200ml剩余污泥置于250ml锥形瓶中(9瓶，分三组)预热至55℃，分别向锥形瓶中加入5ml处于对数生长期、生长状态良好的嗜热菌悬液(1-3号转入aed-23w核苷酸序列的枯草芽孢杆菌、4-6号转入ncs-016核苷酸序列的枯草芽孢杆菌、7-9号转入x233zb核苷酸序列的枯草芽孢杆菌)，接种嗜热菌悬液的光密度(od)为0.55，10-12号锥形瓶的淤泥中直接加入5g实施例6提供的高温复合菌剂(常温保存10天后的高温复合菌剂)，13号锥形瓶加入5ml双蒸水作为ck，调节ph至7，放置于恒温水浴振荡器55℃处理3h，污泥初始化参数如表2所示，经嗜热菌(转入aed-23w核苷酸序列的枯草芽孢杆菌、转入ncs-016核苷酸序列的枯草芽孢杆菌、转入x233zb核苷酸序列的枯草芽孢杆菌)处理后污泥中参数如表2所示。
表2.污泥参数
protein为蛋白质，单位mg/l；
cod为溶剂性化学需氧量，单位mg/l；
tss为总悬浮固体，单位g/l；
vss为挥发性悬浮固体，单位g/l；
从表2结果可知，转入aed-23w核苷酸序列的枯草芽孢杆菌、转入ncs-016核苷酸序列的枯草芽孢杆菌、转入x233zb核苷酸序列的枯草芽孢杆菌对于高温污泥均有较理想的处理效果，其中转入ncs-016核苷酸序列的枯草芽孢杆菌对于高温污泥的处理效果最佳。高温复合菌剂在常温状态下可以保持降解活性，并且降解活性相较于单一菌种有一定提升。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
序列表
<110>上海国璨环境科技有限公司
<120>一种耐高温复合菌制剂
<130>czgzhuanc-sanhuan-2020042302
<141>2020-04-23
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>2211
<212>dna/rna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
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