本发明涉及一种基于人工双碳源的产n-乙酰神经氨酸的重组菌，属于遗传工程领域。
背景技术：
n-乙酰神经氨酸是一种功能性单糖，广泛存在于微生物以及哺乳动物体内。在人体中，n-乙酰神经氨酸参与细胞识别、信号转导等多个生理过程。因此，n-乙酰神经氨酸被广泛应用于增强婴儿免疫力，促进婴儿大脑发育。目前，n-乙酰神经氨酸主要采取天然产物提取法(鸡蛋、燕窝等)，存在其他产物难以分离，且成本较高；另外可以通过全细胞转化的方法获得，但是需要成本较高的底物乙酰氨基葡萄糖和丙酮酸为底物，由于底物转化率较低，导致神经氨酸生产成本较高。
枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被fda认证为“generallyregardedassafe”(gras)安全级别。因此以枯草芽孢杆菌为宿主，通过代谢工程改造，以葡萄糖等廉价碳源为底物，高效从头合成神经氨酸是一种有效的策略。
目前在枯草中构建的n-乙酰神经氨酸代谢途径主要通过n-乙酰氨基葡萄糖为前体的neub关键酶合成途径，由于胞内磷酸烯醇式丙酮酸(pep)浓度较低，限制了神经氨酸的合成效率。这个问题的存在严重限制了神经氨酸产量的提高，进一步限制了其市场应用。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提供了一种可利用双碳源的枯草芽孢杆菌，可解除葡萄糖存在时的碳源代谢分解阻遏效应，高效供给胞内pep浓度。
本发明的第一个目的是提供一种可以利用人工双碳源葡萄糖和甘油双碳源生长、合成的枯草芽孢杆菌，以seqidno.11所示的组成型启动子过表达甘油激酶；所述甘油激酶含有seqidno.1所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌还过表达氨基葡萄糖-6-磷酸-n-乙酰基转移酶(gna1)和n-乙酰氨基葡萄糖异构酶(age)。
在一种实施方式中，所述氨基葡萄糖-6-磷酸-n-乙酰基转移酶的氨基酸序列如seqidno.3所示。
在一种实施方式中，所述n-乙酰氨基葡萄糖异构酶的氨基酸序列如seqidno.5所示。
在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌还过表达脑膜炎奈瑟菌(neisseriameningitidis)来源的n-乙酰神经氨酸合酶。
在一种实施方式中，所述n-乙酰神经氨酸合酶的氨基酸序列如seqidno.7所示，并通过seqidno.9所示的p1启动子调控表达。
在一种实施方式中，所述氨基葡萄糖-6-磷酸-n-乙酰基转移酶通过seqidno.9所示的p1启动子调控表达。
在一种实施方式中，所述n-乙酰氨基葡萄糖异构酶通过seqidno.10所示的p10启动子调控表达。
本发明的第二个目的是提供一种n-乙酰神经氨酸的合成方法，是以葡萄糖和甘油为碳源，应用上述任一所述的枯草芽孢杆菌进行发酵。
在一种实施方式中，所述葡萄糖的含量为40～80g/l，所述甘油的含量为10～20g/l。
在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌的培养基还含有：胰蛋白胨、酵母粉、硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和硫酸镁。
在一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌接种在lb培养基中，培养12～18h获得种子液，再以1～10％的接种量转接至发酵培养基中进行发酵。
在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌在30～37℃发酵16～72h。
本发明还要求保护所述重组枯草芽孢杆菌在制备含n-乙酰神经氨酸或其衍生产品中的应用。
在一种实施方式中，所述应用是用于制备药物或保健品。
在一种实施方式中，所述衍生产品包括但不限于抗病毒药物扎那米韦(zanamivir)或奥司他韦(oseltamivir)。
有益效果：
(1)本发明通过以组成型启动子p6过表达甘油激酶，使枯草芽孢杆菌能够利用人工双碳源葡萄糖和甘油双碳源，克服了葡萄糖存在时的碳源代谢分解阻遏效应，提高了胞内磷酸烯醇式丙酮酸的供应；
(2)本发明通过启动子合理调控甘油激酶基因的整合表达，使重组枯草芽孢杆菌的n-乙酰神经氨酸产量提高至8.7g/l。
具体实施方式
甘油激酶(glpk)的氨基酸列如seqidno.1所示，核苷酸序列如seqidno.2所示；
氨基葡萄糖-6-磷酸-n-乙酰基转移酶(gna1)的氨基酸列如seqidno.3所示，核苷酸序列如seqidno.4所示；
n-乙酰氨基葡萄糖异构酶(age)的氨基酸序列如seqidno.5所示，核苷酸序列如seqidno.6所示；
n-乙酰神经氨酸合酶(neub)的酶氨基酸列如seqidno.7所示，核苷酸序列如seqidno.8所示；
p1启动子核苷酸序列如seqidno.9所示；p2启动子核苷酸序列如seqidno.12所示；p3启动子核苷酸序列如seqidno.13所示；p6启动子核苷酸序列如seqidno.11所示；p10启动子核苷酸序列如seqidno.10所示。
n-乙酰神经氨酸枯草芽孢杆菌培养条件：
发酵培养基(g/l)：胰蛋白胨6，酵母粉12，硫酸铵6，磷酸氢二钾12.5，磷酸二氢钾2.5，硫酸镁3，葡萄糖60g/l，甘油20g/l。
培养条件：37℃、200rpm，条件下培养72h。
n-乙酰神经氨酸检测方法：
agilent液相色谱：色谱柱为aminexhpx-87hcolumn(300×7.8mm)，紫外210nm检测吸收峰，流动相为10mm硫酸，流速为0.5ml/min。n-乙酰神经氨酸出峰时间约为9.8分钟。实施例1构建基因组重组整合gna1片段
以枯草芽孢杆菌168基因组为模版，设计引物gna1-l-f:5’-cgtgatatcgtcattcagtctcttgaacgcca-3’和gna1-l-r:5’-cgcaataacgcaggcgttctgtgacattaacttatttcatgttctttttagttagacgattttaatacaagcctcgcca-3’，扩增重组整合gna1左臂基因片段；
合成如seqidno.9所示的p1启动子片段；
合成如seqidno.4所示的编码gna1的基因片段；
以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，以引物gna1-r-l：5’-ataacttgtcagactgccgggaaatcccggcagtcttttttccattaaaacacggcccagtcataaaatagttttcctaataagacctgg-3’和gna1-r-r：5’-cctacttaagctgctaccacttgtga-3’，扩增重组整合gna1右臂基因片段。
将gna1左臂基因片段、启动子片段(seqidno.9所示)、gna1的基因片段和gna1右臂基因片段通过融合pcr获得重组整合，通过融合pcr技术，构建成重组整合gna1基因片段，将重组整合gna1基因的片段命名为gna1-1。
实施例2构建基因组重组整合age片段
以枯草芽孢杆菌168基因组为模版，设计引物age-l-f:5’-cgtgatatcgtcattcagtctcttgaacgcca-3’和age-l-r:5’-cgcaataacgcaggcgttctgtgacattaacttatttcatgttctttttagttagacgattttaatacaagcctcgcca-3’，扩增重组整合age片段左臂基因序列；
合成如seqidno.12所示的p2启动子片段；合成如seqidno.6所示的编码age的基因片段；
以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，以引物age-r-l：5’-ataacttgtcagactgccgggaaatcccggcagtcttttttccattaaaacacggcccagtcataaaatagttttcctaataagacctgg-3’和age-r-r：5’-ataaccaacgcagcaagtggcaacct-3’，扩增重组整合age右臂基因片段。
将age片段左臂基因序列、启动子片段(seqidno.12所示)、age基因片段和age片段右臂基因序列通过融合pcr技术构建成重组整合age基因片段，并将其命名为age-2。
实施例3构建基因组重组整合nemneub片段
以枯草芽孢杆菌168基因组为模版，设计引物nemneub-l-f:5’-cggtgtctgtatatcacaaaaatagtgagcagggtaacga-3’和nemneub-l-r:5’-cgcaataacgcaggcgttctgtgacattaacttatttccacctattttgttacagcgtgtgccacttttatgca-3’，扩增重组整合nemneub左臂基因片段；
合成如seqidno.9所示的p1启动子片段；合成如seqidno.8所示的编码nemneub的基因片段；
以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，以引物nemneub-r-l：5’-taacttgtcagactgccgggaaatcccggcagtcttttttccattaaaacacggcgcttgaacagctttttttgaataccttgtccagct-3’和nemneub-r-r：5’-gcgtcatcgcagtttttgcacctgact-3’，扩增重组整合nemneub右臂基因片段。
将nemneub左臂基因片段、启动子片段(seqidno.9所示)、nemneub基因片段和nemneub右臂基因片段通过融合pcr技术，构建成重组整合nemneub基因片段，将其命名为nemneub-1。
实施例4构建基因组重组整合p6-glpk片段
以枯草芽孢杆菌168基因组为模版，设计引物glpk-l-f:5’-gtcgtactgccatctgtttctgtatacattctcccaat-3’和glpk-l-r:5’-cgcaataacgcaggcgttctgtgacattaacttatttctttttaccttgtgataaacaggcacatgacggca-3’，扩增重组整合glpk左臂基因片段；
合成如seqidno.11所示的p6启动子片段；合成如seqidno.2所示的编码glpk的基因片段；
以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，以引物glpk-r-l：5’-gaataacttgtcagactgccgggaaatcccggcagtcttttttccattaaaacacggcccgctgtccttgtttttttcagtcaatattgc-3’和glpk-r-r：5’-gacatttgcagcgccggttatcgctca-3’，扩增重组整合glpk右臂基因片段。
分别将glpk左臂基因片段、p6启动子片段(seqidno.11所示)、glpk基因片段和glpk右臂基因片段通过融合pcr技术，构建成重组整合glpk基因片段，将其命名为glpk-6。
实施例5重组整合gna1基因的枯草芽孢杆菌的构建
将实施例1构建的重组整合gna1-1的基因片段转化至枯草芽孢杆菌bsgn6-comk(构建方法公开于论文《modularpathwayengineeringofkeycarbon-precursorsupply-pathwaysforimprovedn-acetylneuraminicacidproductioninbacillussubtilis》)基因组上，获得的重组枯草芽孢杆菌工程菌命名为bs-gna1。
实施例6重组整合age基因的枯草芽孢杆菌的构建
将实施例2构建的重组整合age-2的基因片段转化至实施例5构建的重组枯草芽孢杆菌bs-gna1基因组上，获得的重组枯草芽孢杆菌工程菌命名为bsg-age-2。
实施例7重组整合nemneub基因的枯草芽孢杆菌的构建
将实施例3构建的重组整合nemneub-1的基因片段转化至实施例6构建的重组枯草芽孢杆菌bsg-age-2基因组上，获得的重组枯草芽孢杆菌工程菌命名为bsga-nemneub-1。
实施例8重组整合p6-glpk的枯草芽孢杆菌的构建
将实施例4构建的重组整合glpk-6的基因片段转化至实施例7构建的重组枯草芽孢杆菌bsga-nemneub-1基因组上，获得的重组枯草芽孢杆菌命名为bsgan-glpk-6。
将重组枯草芽孢杆菌bsgan-glpk-6接种于lb培养基中培养12～18小时，获得od约为6的种子液，再将种子液按体积计，以1％的接种量接种于发酵培养基中，于37℃、200rpm下培养72h，测定发酵液中的neuac产量为8.7g/l。
对比例1：未整合p6-glpk的重组枯草芽孢杆菌生产neuac
将按照实施例7的方法制备的重组枯草芽孢杆菌bsga-nemneub-1接种于lb培养基中培养12～18小时，获得od约为6的种子液，再将种子液按体积计，以1％的接种量接种于发酵培养基中，于37℃、200rpm下培养72h，测定发酵液中的neuac产量为7.6g/l。
对比例2：
按照实施例4相同的策略，区别在于，将启动子分别替换为seqidno.9的p1启动子、seqidno.12的p2启动子，以及seqidno.13的p3启动子，构建重组整合glpk片段，并按照实施例8的方式将重组整合glpk片段转化至枯草芽孢杆菌bsga-nemneub-1基因组上，在相同条件下发酵。结果显示，发酵相同时间后的n-乙酰神经氨酸产量分别为7.4g/l、7.2g/l和7.5g/l，低于本发明产量的8.7g/l。
表1不同启动子强化glpk对n-乙酰神经氨酸产量的影响
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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<110>江南大学
<120>一种基于人工双碳源的产n-乙酰神经氨酸的重组菌
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