一种引导耐热甘露聚糖酶分泌表达的改造信号肽、重组质粒、基因工程菌、生产方法和应用与流程

本发明涉及生物领域，尤其涉及一种引导耐热甘露聚糖酶分泌表达的改造信号肽、重组质粒、基因工程菌、生产方法和应用。

背景技术：

甘露聚糖是一类半纤维素多糖，是自然界中半纤维素的第二大组分，广泛存在于植物细胞壁及一些豆科植物种籽中。然而，存在于植物细胞壁或种籽中的甘露聚糖遇水后极易膨胀，黏度大幅提高，水解困难，难以被动物和人体直接利用，因此会对这些物质的开发和利用造成非常不利的影响。

β-甘露聚糖酶是甘露聚糖降解过程中的关键酶，主要催化水解甘露聚糖中的β-1,4-d-甘露糖甘键，通过与β-甘露糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和α-半乳糖苷酶的协同作用可完全水解线性甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳葡甘露聚糖等，因此，利用甘露聚糖酶有效降解处理甘露聚糖，可对含甘露聚糖的物质的利用产生重要作用，因而使得β-甘露聚糖酶在饲料、食品、医药等领域均有广泛的应用前景。

传统微生物发酵产β-甘露聚糖酶往往受初始酶活低、菌株生物安全性无保障等限制，难以大规模工业化生产。随着基因工程和蛋白质工程技术的广泛运用，甘露聚糖酶的生产开始转向异源表达方面，不同来源的β-甘露聚糖酶已在多个表达宿主中成功进行异源表达，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母等。然而随着β-甘露聚糖酶的应用越来越广泛，β-甘露聚糖酶的产量有待进一步提高，因此提高β-甘露聚糖酶的表达量满足工业化生产需求，降低工业化生产成本具有重要意义。

技术实现要素：

本发明利用改造信号肽引导耐热甘露聚糖酶在宿主细胞中的分泌表达，提高耐热甘露聚糖酶的分泌表达量，提供了相应的改造信号肽、重组质粒、基因工程菌、耐热甘露聚糖酶生产方法和基因工程菌的应用。

本发明提供的技术方案为一种引导耐热甘露聚糖酶分泌表达的改造信号肽，所述改造信号肽的氨基酸序列为在seqidno:1第二位和第三位氨基酸之间添加精氨酸的序列或seqidno:1倒数第一位和第二位氨基酸之间添加赖氨酸的氨基酸序列。

而且，所述改造信号肽氨基酸序列如seqidno:3所示、核苷酸序列如seqidno:4所示或所述改造信号肽氨基酸序列如seqidno:5所示、核苷酸序列如seqidno:6所示。

而且，所述耐热甘露聚糖酶的氨基酸序列如seqidno:7所示，核苷酸序列如genebankaccessionno.kj806637所示。

一种含有改造信号肽的重组质粒，所述含有改造信号肽的重组质粒是通过将改造信号肽的编码基因替换表达载体中信号肽基因获得。

而且，所述表达载体为ppic9k、ppiczαa、ppiczαb、ppiczαc、pgapzαa、pgapzαb、pgapzαc中的任一种。

一种引导耐热甘露聚糖酶分泌表达的重组质粒，所述引导耐热甘露聚糖酶分泌表达的重组质粒是通过将耐热甘露聚糖酶核苷酸序列插入到含有改造信号肽的重组质粒多克隆位点处获得。

一种产耐热甘露聚糖酶的基因工程菌，所述基因工程菌是通过将引导耐热甘露聚糖酶分泌表达的重组质粒转化至酵母宿主细胞获得。

而且，所述宿主细胞为pichiapastorissmd1168、pichiapastorisgs115、pichiapastorisx-33、pichiapastoriskm71中的任一种。

而且，利用产耐热甘露聚糖酶的基因工程菌在28-30℃条件下发酵5-7天获得。

以及，所述的产耐热甘露聚糖酶的基因工程菌在饲用酶制剂和纺织用酶制剂方面的应用。

与现有技术相比，该技术方案的有益效果在于：本发明通过改造信号肽，提高了耐热甘露聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达量，使耐热甘露聚糖酶的酶活由309u/ml提高到476u/ml，酶活提高1.54倍，转录水平表达量提高2.64倍。且与毕赤酵母常用信号肽α-factor相比，改造信号肽引导甘露聚糖酶分泌表达时酶活提高1.37倍。应用本发明中的改造信号肽明显提高了耐热甘露聚糖酶的分泌表达量，降低了工业上生产耐热甘露聚糖酶的成本，同时也为毕赤酵母高效分泌表达外源蛋白奠定了一定的基础。

附图说明

图1为以改造信号肽引导耐热甘露聚糖酶mana在毕赤酵母中分泌表达重组载体的示意图。其中signalpeptide分别为gas1-3或gas1-2k的基因序列。

图2为以gas1、gas1-3、gas1-2k和α-factor为信号肽引导耐热甘露聚糖酶mana在毕赤酵母中分泌表达酶活的比较。

图3为以gas1、gas1-3和gas1-2k为信号肽引导耐热甘露聚糖酶mana在毕赤酵母中分泌表达时转录水平表达量的比较。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细具体说明，本发明的内容不局限于以下实施例。

术语解释：

低盐lb平板：0.5％nacl，1％蛋白胨，0.5％酵母浸粉，2％琼脂粉。

ypd平板：2％葡萄糖，2％蛋白胨，1％酵母浸粉，2％琼脂粉。

bmgy培养基：1％酵母浸粉，2％胰化蛋白胨，1.34％ynb，4×10^-5％生物素，1％甘油，100mmph6.0的磷酸缓冲液。

bmmy培养基：1％酵母浸粉，2％胰化蛋白胨，1.34％ynb，4×10^-5％生物素，1％甲醇，100mmph6.0的磷酸缓冲液。

实施例1：出发菌株重组质粒的构建

(1)信号肽gas1基因的克隆

根据信号肽gas1的基因序列seqidno:2以及表达载体ppiczαa上的α-factor基因序列的特征，设计合成引物：

p1：5’-gcgcttcgaaatgtttaaatctctgtgc-3’(seqidno:8)

p2：5’-ccgggaattctgccaagactgaactcaa-3’(seqidno:9)

其中引物p1下划线部分为bspt104ⅰ酶切位点，引物p2下划线部分为ecorⅰ酶切位点。以毕赤酵母x33基因组为模板，以p1和p2为引物，通过pcr扩增获得信号肽gas1的基因片段。

(2)含信号肽gas1基因的重组质粒的构建

将pcr扩增获得的信号肽gas1的基因片段用bspt104ⅰ和ecorⅰ双酶切，同时将表达载体ppiczαa也用bspt104ⅰ和ecorⅰ双酶切，然后将gas1的双酶切产物和ppiczαa的双酶切产物进行连接，并用化学法转化至大肠杆菌宿主top10感受态细胞中，涂布于含25μg/mlzeocin抗生素的低盐lb平板上进行筛选，挑取转化子于含25μg/mlzeocin抗生素的低盐lb液体培养基中过夜培养，提取质粒，通过bspt104ⅰ和ecorⅰ双酶切鉴定并测序验证，成功获得重组质粒ppicza-gas1。

(3)耐热甘露聚糖酶mana基因的克隆

根据耐热甘露聚糖酶的基因序列(genebankaccessionno.kj806637)以及重组质粒ppicza-gas1上的多克隆位点特征，设计合成引物：

p3：5’-gacgaattctctggtggaccaaacttgt-3’(seqidno:10)

p4：5’-tagatagcggccgcagaggtaccgatagcgt-3’(seqidno:11)

其中引物p3下划线部分为ecorⅰ酶切位点，引物p4下划线部分为notⅰ酶切位点。以实验室构建的重组质粒pao815hr-mana为模板，以p3和p4为引物，通过pcr扩增获得耐热甘露聚糖酶mana的基因片段。

(4)出发菌株重组质粒ppicza-gas1-mana的构建

将pcr扩增获得的耐热甘露聚糖酶mana的基因片段用ecorⅰ和notⅰ双酶切，同时将重组质粒ppicza-gas1也用ecorⅰ和notⅰ双酶切，然后将mana的双酶切产物和ppicza-gas1的双酶切产物进行连接，并用化学法转化至大肠杆菌宿主top10感受态细胞中，涂布于含25μg/mlzeocin抗生素的低盐lb平板上进行筛选，挑取转化子于含25μg/mlzeocin抗生素的低盐lb液体培养基中过夜培养，提取质粒，通过ecorⅰ和notⅰ双酶切鉴定并测序验证，成功获得重组质粒ppicza-gas1-mana。

实施例2：产耐热甘露聚糖酶出发菌株的构建

使用限制性内切酶sacⅰ对出发菌株重组质粒ppicza-gas1-mana进行线性化后，使用电转化法转化至毕赤酵母x33感受态细胞中，涂布于含100μg/mlzeocin抗生素的ypd平板上进行筛选，挑取转化子于ypd液体培养基中过夜培养，进行菌液pcr鉴定，分别以p1/p2和p3/p4为引物，进行pcr扩增，结果表明信号肽gas1的基因序列和耐热甘露聚糖酶mana的基因序列均整合至x33基因组中，获得的产耐热甘露聚糖酶出发菌株命名为x33/gas1-mana。

实施例3：含改造信号肽重组质粒的构建

(1)改造信号肽gas1-3和gas1-2k基因的克隆

根据改造信号肽gas1-3和gas1-2k的基因序列seqidno:4和seqidno:6以及表达载体ppiczαa上的α-factor基因序列的特征，分别设计合成引物：

p5：5’-cgcgttcgaaatgtttagaaaatctctgtgc-3’(seqidno:12)

p2：5’-ccgggaattctgccaagactgaactcaa-3’(seqidno:9)

p1：5’-gcgcttcgaaatgtttaaatctctgtgc-3’(seqidno:8)

p6：5’-ctctgaattctgccttcaagactgaactc-3’(seqidno:13)

其中引物p5和p1下划线部分为bspt104ⅰ酶切位点，引物p2和p6下划线部分为ecorⅰ酶切位点。以ppicza-gas1-mana为模板，分别以p5/p2和p1/p6为引物，通过pcr扩增获得改造信号肽gas1-3和gas1-2k的基因片段。

(2)含gas1-3或gas1-2k基因的重组质粒的构建

将pcr扩增获得的信号肽gas1-3和gas1-2k的基因片段分别用bspt104ⅰ和ecorⅰ双酶切，同时将表达载体ppiczαa也用bspt104ⅰ和ecorⅰ双酶切，然后分别将gas1-3和gas1-2k的双酶切产物和ppiczαa的双酶切产物进行连接，并分别用化学法转化至大肠杆菌宿主top10感受态细胞中，涂布于含25μg/mlzeocin抗生素的低盐lb平板上进行筛选，挑取转化子于含25μg/mlzeocin抗生素的低盐lb液体培养基中过夜培养，提取质粒，通过bspt104ⅰ和ecorⅰ双酶切鉴定并测序验证，成功获得重组质粒ppicza-gas1-3和ppicza-gas1-2k。

(3)改造信号肽引导耐热甘露聚糖酶分泌表达重组质粒的构建

将pcr扩增获得的耐热甘露聚糖酶mana的基因片段用ecorⅰ和notⅰ双酶切，同时将重组质粒ppicza-gas1-3和ppicza-gas1-2k也分别用ecorⅰ和notⅰ双酶切，然后将mana的双酶切产物与ppicza-gas1-3和ppicza-gas1-2k的双酶切产物分别进行连接，并分别用化学法转化至大肠杆菌宿主top10感受态细胞中，分别涂布于含25μg/mlzeocin抗生素的低盐lb平板上进行筛选，分别挑取转化子于含25μg/mlzeocin抗生素的低盐lb液体培养基中过夜培养，分别提取质粒，通过ecorⅰ和notⅰ双酶切鉴定并测序验证，成功获得重组质粒ppicza-gas1-3-mana和ppicza-gas1-2k-mana。

实施例4：改造信号肽引导耐热甘露聚糖酶分泌表达重组菌的构建

使用限制性内切酶sacⅰ分别对重组质粒ppicza-gas1-3-mana和ppicza-gas1-2k-mana进行线性化后，均使用电转化法分别转化至毕赤酵母x33感受态细胞中，涂布于含100μg/mlzeocin抗生素的ypd平板上进行筛选，挑取转化子于ypd液体培养基中过夜培养，进行菌液pcr鉴定，分别以p5/p2和p3/p4与p1/p6和p3/p4为引物，进行pcr扩增，结果表明改造信号肽gas1-3基因序列和mana基因序列与改造信号肽gas1-2k基因序列和mana基因序列均分别整合至x33基因组中，获得的两株改造信号肽引导耐热甘露聚糖酶分泌表达重组菌分别命名为x33/gas1-3-mana和x33/gas1-2k-mana。

实施例5：各重组菌的摇瓶发酵培养及产耐热甘露聚糖酶的分析

(1)各重组菌的摇瓶发酵培养及酶活性测定

将实施例4获得的改造信号肽引导耐热甘露聚糖酶分泌表达重组菌x33/gas1-3-mana和x33/gas1-2k-mana为生产菌株，以实施例3构建的产耐热甘露聚糖酶出发菌株x33/gas1-mana为对照，对上述3株重组菌分别进行摇瓶水平的发酵培养。将各重组菌接种于25mlbmgy培养基中，30℃、250prm条件下过夜培养至od600值到2-6，离心收集适量菌体重悬至25mlbmmy液体培养基中，控制od600值为1，30℃、250prm培养至168h，每隔24h补加1％的甲醇进行诱导表达。

发酵结束后取各重组菌上清液，利用dns法测定各样品甘露聚糖酶的酶活力：将稀释后的酶液100μl与0.5％甘露聚糖底物900μl混匀，75℃反应10min后立即加入1.5mldns终止反应并煮沸5min显色，将试管置于冷水浴中完全冷却后，测得od540的值，计算酶活力。1个酶活力单位定义为在最适温度和ph条件下，1min内水解0.5％甘露聚糖底物产生1μmol甘露糖所需要的甘露聚糖酶的量。

甘露聚糖酶酶活力测定结果如图2所示，改造信号肽gas1-3和gas1-2k引导耐热甘露聚糖酶mana分泌表达时，与gas1相比，酶活均有提高，其中gas1-2k引导mana分泌表达时酶活达476u/ml，提高1.54倍。

(2)各重组菌产mana转录水平表达量的检测

各重组菌摇瓶发酵至48h时，取等量新鲜菌体利用热酸性酚法提取rna，采用宝生物工程(大连)有限公司的反转录试剂盒primescriptrtreagentkitwithgdnaeraser去除基因组dna并进行逆转录反应，获得各重组菌的cdna。利用实时荧光定量pcr试剂盒sybrpremixextaq和bio-radcfxconnecttmreal-timepcrsystem进行实时荧光定量pcr，以gapdh作为内参基因，使用相对定量分析法2^-δδct法分析改造信号肽引导mana分泌表达时转录水平表达量的变化情况。

各重组菌产耐热甘露聚糖酶mana转录水平表达量的测定结果如图3所示，改造信号肽gas1-3和gas1-2k引导耐热甘露聚糖酶mana分泌表达时，与gas1相比，mana转录水平的表达量分别提高1.85倍和2.64倍。

实施例6：本发明所述改造信号肽与毕赤酵母常用信号肽α-factor引导mana分泌表达酶活的比较

(1)本发明所述改造信号肽引导耐热甘露聚糖酶分泌表达重组菌的构建方法参见实施例4。

(2)毕赤酵母常用信号肽α-factor引导mana分泌表达重组菌的构建方法如下：

将耐热甘露聚糖酶mana基因片段插入到表达载体ppiczαa多克隆位点的ecorⅰ和notⅰ之间，获得重组质粒ppiczαa-mana。

将重组质粒ppiczαa-mana电转化至毕赤酵母x33感受态细胞中，用含100μg/mlzeocin抗生素的ypd平板上筛选阳性转化子，获得α-factor引导mana分泌表达重组菌x33/mana。

对x33/gas1-3-mana、x33/gas1-2k-mana和x33/mana进行摇瓶水平的发酵培养，并测定各上清液样品的甘露聚糖酶酶活，具体方法参见实施例5。

甘露聚糖酶酶活的测定结果如图2所示，gas1-2k引导mana在毕赤酵母中分泌表达时酶活明显高于α-factor，提高1.37倍。

序列表

<110>中南民族大学

<120>一种引导耐热甘露聚糖酶分泌表达的改造信号肽、重组质粒、基因工程菌、生产方法和应用

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>19

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

metphelysserleucysmetleuileglysercysleuleuserser

151015

valleuala

<210>2

<211>57

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

atgtttaaatctctgtgcatgttaataggatcctgcctattgagttcagtcttggca57

<210>3

<211>20

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

metphearglysserleucysmetleuileglysercysleuleuser

151015

servalleuala

20

<210>4

<211>60

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

atgtttagaaaatctctgtgcatgttaataggatcctgcctattgagttcagtcttggca60

<210>5

<211>20

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

metphelysserleucysmetleuileglysercysleuleuserser

151015

valleulysala

20

<210>6

<211>60

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

atgtttaaatctctgtgcatgttaataggatcctgcctattgagttcagtcttgaaggca60

<210>7

<211>284

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

serglyglyproasnleuservalasnthrglnglyleuvalglyile

151015

asnhisprohisalatrptyrargaspargleuserserserleugln

202530

glyileargsertrpglyalaasnalavalargilevalleuserasn

354045

glycysargtrpthrlysileproalasergluvalalaaspileile

505560

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65707580

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859095

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100105110

asnphevalilevalasnileglyasngluprotyrglyasnasnasn

115120125

tyrglnasntrpvalthraspthrargasnalavalglnalaleuarg

130135140

asnalaglyileasnasnthrilemetvalaspalaproasntrpgly

145150155160

glnasptrpserphethrmetargaspasnalaprothrilepheasn

165170175

alaaspproglnargasnleuvalpheserilehismettyrglyval

180185190

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195200205

argglyleuproleuvalileglyglupheglyhismethisserasp

210215220

glyaspproasngluglnalailevalglntyralalysglntyrasn

225230235240

ileglyleupheglytrpsertrpserglyasnglyglyglyvalglu

245250255

tyrleuaspmetvalthrasnpheasnalaasnserprothralatrp

260265270

glythrtrppheargthrasnalaileglythrser

275280