含穿膜肽、多巴和还原可离去PEG接枝共聚物及其合成方法和应用与流程

本发明属于生物医药技术、纳米医药及新材料领域，具体涉及含穿膜肽、多巴和还原可离去peg接枝共聚物的合成以及应用于增强肿瘤细胞内吞及溶酶体ph控制的药物释放的智能纳米胶束载体。

背景技术：

化疗作为恶性肿瘤临床治疗的主要方法之一，普遍存在易产生耐药性、选择性差、毒副作用大等共性问题。因为小分子抗肿瘤药物通常会通过静脉注射或口服给药，经全身循环后杀死病变部位的肿瘤细胞。而这些传统的给药方法存在许多不足，如小分子治疗药物在体内代谢速度快、半衰期短等。因此只有很少一部分药物能够到达病变部位，严重影响了药物的治疗效果。同时由于肿瘤细胞对药物的摄取效率较低，通常需要多次给药才能维持药物的最佳浓度。因此往往会引起耐药性和严重的全身毒副作用。利用实体瘤的高渗透和长滞留效应(epr效应)，智能纳米药物传递系统能够在肿瘤组织富集，同时利用肿瘤组织与人体正常组织的微环境差异，在肿瘤微环境作用下快速解体，迅速释放出抗肿瘤药物，实现药物的定点控制释放，抑制肿瘤细胞增殖。

然而，非交联的纳米药物传递系统在血液长循环过程中稳定性较差，受到血液的稀释作用和高剪切力，容易解体，不能够有效在肿瘤组织富集，同时容易提前渗出药物，产生毒副作用，降低治疗效果。因此通过核交联策略稳定纳米胶束，可以提高纳米药物传递系统在血液循环过程中的稳定性及药物传递能力。

穿膜肽cpps是一类具有主动跨膜运输作用的小分子多肽，它可以有效地携带纳米药物或各种大分子物质进入细胞，并且不会破坏细胞膜的完整性。尽管穿膜肽能够有效的携带药物及各种大分子进入细胞，但是穿膜肽是一种非特异性的小分子多肽，能穿透肿瘤细胞也能穿透正常细胞，没有选择性，从而限制了穿膜肽在纳米药物靶向传递系统中的应用。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的不足而提出的。制备了一种接枝穿膜肽、多巴和还原可离去peg的接枝共聚物，利用三价铁离子与多巴可形成酸敏感配位键，从而驱动接枝共聚物发生纳米尺度自组装的原理，构建核可逆交联的载带阿霉素等抗肿瘤药物而得到纳米胶束药物；该胶束药物对肿瘤可实现主动智能响应：长效循环经epr效应充分富集于肿瘤组织→二硫键对肿瘤组织还原环境响应断裂脱去peg壳→裸露出的穿膜肽克服p糖蛋白对药物的泵出作用而主动递送药物入溶酶体→在溶酶体酸性环境下三价铁/多巴配位键裂解→交联核崩解快速释药足剂量抗肿瘤药物而“杀死”肿瘤细胞。

实现本发明目的的具体技术方案是：

一种含穿膜肽、多巴和还原可离去peg的接枝共聚物，具有式i结构：

其中，x＝10-30％，y＝10-20％，z＝5-10％，d＝50-70％，m＝71。

一种所述含穿膜肽、多巴和还原可离去peg接枝共聚物的合成方法，该方法包括以下具体步骤：

步骤1：将l-天冬氨酸溶于无水环丁砜，加入磷酸用于催化反应，在氮气的保护下，170℃加热回流12h，并用油水分离器去除产物水。待反应结束后，趁热过滤掉反应液中的不溶物，反应液用冰甲醇重沉淀三次，过滤、干燥后得白色固体产物聚琥珀酰亚胺(psi)；

步骤2：将psi溶解于dmf中，再缓慢将其滴加到装有乙二胺的烧瓶中，psi与乙二胺的摩尔比为5：18，连续搅拌反应10小时后，减压蒸干以除去过量的乙二胺和dmf，所得固体用甲醇溶解，乙醚重沉淀三次，过滤得淡粉色固体聚氨乙基天冬氨酸(p(ae-asp))；

步骤3：将p(ae-asp)与mpeg-ss-nhs摩尔比4:1溶于去离子水中，室温反应24h，反应液透析、冻干得到白色固体mpeg-ss-g-p(ae-asp)；将6-马来酰亚胺基己酸活性酯与mpeg-ss-g-p(ae-asp)以1:5的摩尔比溶于dmf，室温反应12h后，反应液透析、冻干得到白色固体mpeg-ss-g-p(ae-asp)-mca；将多巴酸与mpeg-ss-g-p(ae-asp)-mca以1:3的摩尔比溶于dmf中，氮气保护下室温反应12h后，反应液透析、冻干得到浅灰色固体mpeg-ss-g-p(ae-asp)-mca-da；将穿膜肽(tat)与mpeg-ss-g-p(ae-asp)-mca-da以1:10的摩尔比溶于dmf和水的混合溶剂中，室温反应12h后，反应液透析、冻干得到浅灰色固体mpeg-ss-g-p(ae-asp)-mca-da-tat。具有式i结构：

其中，x＝10-30％，y＝10-20％，z＝5-10％，d＝50-70％，m＝71。

一种所述含穿膜肽、多巴和还原可离去peg接枝共聚物用于制备药物载体的应用。

所述药物为脂溶性药物。

所述载体为核交联纳米胶束。优选为ph敏感型核交联纳米胶束载体。

所述脂溶性药物为阿霉素、sn38或紫杉醇。

所述核交联纳米胶束以聚乙二醇为亲水层，内部带有穿膜肽作为主动递送单元，可脱卸peg壳层的存在使穿膜肽具有靶向性，主动穿膜递送纳米药物实现增强的细胞内吞；其内部由是多巴构成的疏水内核，疏水内核在加入铁离子后通过多巴胺和铁离子之间形成配位键进行交联，该配位键能够响应肿瘤细胞溶酶体内酸性微环境，实现溶酶体ph敏感释药。

其中，所述肿瘤细胞包括乳腺癌细胞、耐药乳腺癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞等；优选地，为耐药乳腺癌细胞。

本发明的有益效果在于，本发明提供了一种含穿膜肽、多巴和还原可离去peg接枝共聚物及其合成方法和应用，该聚合物以聚乙二醇为亲水端，内部带有穿膜肽作为主动递送单元，多巴结构作为疏水端。本发明制备的含穿膜肽、多巴和还原可离去peg接枝共聚物可以用于包裹阿霉素形成载药纳米胶束，再加入铁离子通过多巴胺和铁离子之间形成配位键进行交联，形成核交联的阿霉素胶束药物。本发明制备的核交联胶束制备方法简便，核交联策略能够抵抗血液的无限稀释效应，在血液循环中保持稳定，有利于其在肿瘤组织富集；该ph敏感核交联胶束表面具有可脱卸peg壳层，因此在长效循环过程能克服穿膜肽的非选择性；而二硫键对肿瘤组织胞外还原环境响应可断裂脱去peg壳层，裸露穿膜肽，实现主动递送增强的细胞内吞；进入肿瘤细胞后，可在细胞溶酶体内实现ph敏感的药物释放，同时对肿瘤细胞较强的抑制活性。

附图说明

图1为本发明所述含含穿膜肽、多巴和还原可离去peg接枝共聚物mpeg-ss-g-p(ae-asp)-mca-da-tat的¹hnmr谱图；

图2为核交联阿霉素纳米胶束药物的结构示意图；

图3为核交联空胶束的粒径分布(dls)图；

图4为核交联空胶束的形貌(tem)图；

图5为核交联空胶束经pbs稀释100倍后的粒径分布(dls)图；

图6为未交联空胶束经pbs稀释100倍后的粒径分布(dls)图；

图7为核交联阿霉素纳米胶束药物的粒径分布(dls)图；

图8为核交联阿霉素纳米胶束药物的形貌(tem)图；

图9为核交联阿霉素纳米胶束药物在不同ph条件下的累积药物释放曲线图；

图10为mcf-7/adr细胞对核交联阿霉素纳米胶束药物的细胞吞噬行为荧光强度统计图；

图11为核交联空白胶束对mcf-7/adr的细胞毒性图；

图12为核交联阿霉素纳米胶束药物对mcf-7/adr的细胞毒性图。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1

聚琥珀酰亚胺(psi)的合成

称取13.3gl-天冬氨酸(0.1mmol)加入三口烧瓶中，向烧瓶中加入35ml无水环丁砜作为反应溶剂，同时加入0.5ml磷酸用于催化反应，在氮气的保护下，170℃加热回流12h，并用油水分离器去除产物水，待反应结束后，趁热过滤掉反应液中的不溶物，用冰甲醇重沉淀三次，过滤、干燥后得白色固体产物psi8.4g，产率87％。

所述psi结构如式(1)所示。

式(1)，其中n＝100。

实施例2

聚氨乙基天冬氨酸(p(ae-asp))的合成

将psi5g(0.05mol)溶于50ml无水处理的dmf中，氮气保护条件下，缓慢滴加到12ml乙二胺(0.18mol)中，室温下搅拌10h，反应液过滤后，减压浓缩除去绝大部分乙二胺和dmf后，用甲醇溶解，用乙醚重沉淀3次，得到淡粉色固体7.4g，产率92％。

所述p(ae-asp)结构如式(2)所示

式(2)其中n＝100。

实施例3

含穿膜肽、多巴和还原可离去peg接枝共聚物mpeg-ss-g-p(ae-asp)-mca-da-tat的合成

(1)称取mpeg-ss-cooh1g(0.4mmol)加入三口烧瓶中，再向瓶中加入nhs0.23g(2mmol)和edc·hcl0.38g(2mmol)，置换氮气后，用注射器向三口瓶中加入5ml二氯甲烷，反应12小时后，减压蒸馏除去二氯甲烷，再用5ml去离子水将减压蒸干所得的产物溶解，随后加入p(ae-asp)(0.25g，1.6mmol)，持续搅拌反应24小时后，反应液透析处理，冻干得白色固体mpeg-ss-g-p(ae-asp)，产率80％。

所述mpeg-ss-g-p(ae-asp)结构如式(3)所示

式(3)，其中x＝20，b＝80，m＝71。

(2)将0.11g6-马来酰亚胺基己酸(0.5mmol)，0.12gedc·hcl(0.6mmol)，0.5gmpeg-ss-g-p(ae-asp)加入到烧瓶中，加入4mldmf作为反应溶剂。反应12小时后，将反应液透析处理，冻干得白色固体mpeg-ss-g-p(ae-asp)-mca，产率90％。

所述mpeg-ss-g-p(ae-asp)-mca结构如式(4)所示

式(4)，其中x＝20，y＝14，c＝66，m＝71。

(3)将0.47gmpeg-ss-g-p(ae-asp)-mca、0.2gedc·hcl(1mmol)、0.17g多巴酸(1mmol)加入三口烧瓶中，并且置换氮气。然后加入5ml的dmf作为反应溶剂。反应12小时后，反应液透析处理，冻干得浅灰色固体mpeg-ss-g-p(ae-asp)-mca-da，产率78％。

所述mpeg-ss-g-p(ae-asp)-mca-da结构如式(5)所示

式(5)，其中x＝20，y＝14，z＝7，d＝59，m＝71。

(4)将0.2gmpeg-ss-g-p(ae-asp)-mca-da、12mg穿膜肽(tat)溶于4mldmf和水的混合溶剂中，在氮气保护下反应12小时，反应液透析处理，冻干得到终产物mpeg-ss-g-p(ae-asp)-mca-da-tat，产率90％。

所述mpeg-ss-g-p(ae-asp)-mca-da结构如式i所示

其中x＝20，y＝14，z＝7，d＝59，m＝71。

实施例4

核交联空胶束的制备

(1)未交联空胶束的制备：称取10mg具有式i结构的mpeg-ss-g-p(ae-asp)-mca-da-tat(其中，式i中，x＝20，y＝14，z＝7，d＝59，m＝71)，溶于1ml分析纯二甲亚砜，滴加入搅拌速度为500r/min的10ml超纯水中，继续搅拌0.5h，将得到的混合溶液用0.45μm的针式过滤器过滤，然后透析48h以除去有机溶剂。

(2)空胶束的交联：向未交联纳米胶束溶液加入30μl浓度为40mm的氯化铁水溶液，继续室温下搅拌1h，然后调节ph至7.4。随后透析除去未络合的铁离子。将透析后的溶液进行冷冻干燥，得到核交联空胶束。

如图3所示，dls测得核交联空胶束平均粒径为180.1nm，图4所示的tem图片显示该胶束为球形纳米胶束。

实施例5

核交联空胶束抗稀释能力

为了进一步证明纳米胶束交联的有效性，对交联和未交联的胶束样品进行了稀释实验。图5和图6分别为核交联空胶束和未交联空胶束用pbs稀释100倍后的尺寸分布图。图6表明未交联空胶束经稀释后已经不符合dls测试条件。相反，核交联空胶束经稀释后的平均尺寸为238.7nm(图5)。由此证明了核交联空胶束具有抗稀释的能力，可以避免纳米胶束在体内循环过程中的解体。

实施例6

核交联阿霉素胶束药物的制备

称取10mg具有式i结构的mpeg-ss-g-p(ae-asp)-mca-da-tat(其中，式i中，x＝20，y＝14，z＝7，d＝59)，溶于1ml分析纯二甲亚砜。称取2mg的盐酸阿霉素加入适量三乙胺脱盐，将脱盐后的阿霉素和溶于二甲亚砜的mpeg-ss-g-p(ae-asp)-mca-da-tat搅拌混匀，滴加入搅拌速度为500r/min的10ml超纯水。继续搅拌0.5h，将得到的混合溶液用0.45μm的针式过滤器过滤，然后透析48h以除去有机溶剂，得到未交联的阿霉素胶束药物溶液。向未交联的阿霉素胶束药物溶液加入30μl浓度为40mm的氯化铁水溶液，继续室温下搅拌1h，然后调节ph至7.4。随后透析除去未络合的铁离子。将透析后的溶液进行冷冻干燥，得到所述的核交联阿霉素纳米胶束药物。

用紫外分光光度法测定载药胶束的载药量(dlc)和包封率(dle)。

取5ml未交联的阿霉素纳米胶束药物溶液，冷冻干燥并称重，用dmso充分溶解并定容至10ml。之后测定待溶液在480nm的吸光度值，代入预先绘制的标准曲线计算得到待测dmso溶液中的阿霉素的浓度，进而计算载药胶束的载药量(dlc)和包封率(dle)。

载药量(dlc)＝(胶束中阿霉素质量/载药胶束质量)×100％

包封率(dle)＝(胶束中阿霉素质量/阿霉素投料量)×100％

测得载药胶束的dlc为10.18±0.24％，dle为61.16±1.65％。

实施例7

核交联阿霉素胶束药物的表征

所述核交联阿霉素胶束药物结构如图2所示，以聚乙二醇为亲水层，内部带有穿膜肽作为主动递送单元。以多巴结构为疏水内核，疏水内核加入铁离子后，通过多巴和铁离子之间形成配位键进行交联。

图7和图8分别为测定的核交联阿霉素胶束药物的粒径与形貌图。结果表明该纳米胶束药物是平均粒径为251.7nm(图7)的球形纳米胶束(图8)。该粒径符合纳米胶束具有被动靶向所需的特质，即纳米粒径范围在5-500nm的纳米胶束，能够通过被动靶向聚集在肿瘤组织。

实施例8

核交联阿霉素胶束药物在不同ph条件下的释药行为

利用荧光分光光度法测定核交联阿霉素胶束药物在不同ph条件下的阿霉素累积释放量。分别取1ml核交联阿霉素纳米胶束药物(1mg/ml)置于ph5.0和ph7.4的磷酸缓冲液中透析64h(mwco500)，荧光分光光度法测定透析后各组的阿霉素含量，与测得阿霉素的标准曲线对照，计算出各组释药量。

实验结果如图9所示，核交联阿霉素纳米胶束药物的释药量与ph呈现出一定的依赖关系。核交联阿霉素胶束药物在ph5.0的磷酸缓冲液介质中，64h后累计释药量约为70％。而在ph7.4条件下64h累计释药量仅为20％。在ph5.0条件下的累积释药量为ph7.4条件下累积释药量的3.5倍。该实验证明了核交联阿霉素胶束药物的ph触发释药性能以及血液循环条件下纳米胶束的稳定性。

实施例9

核交联阿霉素纳米胶束药物的细胞吞噬行为

采用bio-tek酶标仪定量核交联阿霉素胶束药物的细胞摄取效率，具体过程如下：将mcf-7/adr细胞种于6孔板中(2×10⁵个细胞/孔)。培养24小时后，用含有核交联阿霉素胶束药物或dox·hcl(dox浓度：5μg/ml)的新鲜培养液(含10mmgsh)代替旧培养液。分别培养2、4、8h后，移去培液，然后加入细胞裂解缓冲液(0.01mhcl，10％十二烷基磺酸钠和5％异丁醇)破坏细胞结构。最后，用bio-tek酶标仪在595nm处测定每个时间点的荧光值。

实验结果如图10所示，在不同培育时间下，与dox·hcl组相比，核交联阿霉素纳米胶束药物组被mcf-7/adr细胞摄取的量明显较高。特别是培养8h后，核交联阿霉素纳米胶束药物组所孵育的mcf-7/adr细胞中的平均荧光强度约是dox·hcl组的8倍。这一结果证明修饰tat的纳米胶束载体能显著增加肿瘤细胞内dox的含量。

实施例10

核交联阿霉素胶束药物抑制mcf-7/adr的ic50

将处于对数生长期的mcf-7/adr细胞接种于96孔板上，每孔5×10³个细胞，恒温培养箱培养12h后，分别加入20μl培养基，各组含有一系列浓度梯度的核交联阿霉素胶束药物和盐酸阿霉素，最终浓度均以阿霉素含量为标准，分别为0.3125，0.625，0.02，1.25，2.5，5，10，20，40，80和160μg/ml；继续培养72h之后，吸去80μl培养基，加入10μl的mtt溶液(5mg/ml)后继续培养4h，加入50μl三联液，溶解甲瓒晶体，用酶标仪于570nm波长处测定吸光度。细胞存活率计算如下：

细胞存活率(％)＝(od实验组-od空白组/od对照组-od空白组)×100％

如图11所示，由本发明所述含穿膜肽、多巴和还原可离去peg接枝共聚物制备的核交联空胶束对mcf-7/adr细胞表现出低毒性，证明其良好的生物相容性。本发明中，如图12所示，核交联阿霉素胶束药物对mcf-7/adr的细胞毒性在不同阿霉素浓度下优于盐酸阿霉素。所述核交联阿霉素胶束药物和盐酸阿霉素对于mcf-7/adr的ic50分别为11.61±0.95μg/ml和42.77±1.93μg/ml。与图10结合分析可知，本法制备的纳米胶束增强了细胞对纳米胶束的内吞，而且结合图9可知制备的纳米胶束在溶酶体ph条件下能够快速释放阿霉素，因此核交联阿霉素纳米胶束药物能够被mcf-7/adr细胞内吞并且快速释放阿霉素，进而抑制肿瘤细胞增殖。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。