一种微拟球藻工业化培养的方法与流程

本发明属于微藻工业化培养领域，具体是一种微拟球藻工业化培养的方法。

背景技术：

微拟球藻(nannochloropsis.sp)属褐藻门、大眼藻纲、微拟球藻属，是一类球形或近似球形的单细胞微藻，其细胞小(通常2-4μm)，形态简单，呈球形，微拟球藻细胞内油脂很高，据文献报到可以达到细胞干重的30-60％，其中油脂中含有高含量的二十碳五烯酸(epa)，此种脂肪酸属于ω-3系列多不饱和脂肪酸，此种脂肪酸对于水产动物和人体都具有十分重要的作用，在鱼类、虾类和贝类的育苗中，epa是对水产动物幼苗正常生长发育不可或缺的营养成分，对于人类来说是自身不能合成但又不可缺少的重要营养素，因此被人们称为人体必需脂肪酸。epa具有帮助降低胆固醇和甘油三酯的含量促进体内饱和脂肪酸代谢，从而起到降低血液粘稠度，增进血液循环，提高组织供氧而消除疲劳。也可防止脂肪在血管壁的沉积，预防动脉粥样硬化的形成和发展、预防脑血栓、脑溢血、高血压等心血管疾病。.

目前藻类培养多采用粗放分级式扩配方法，任然存在较多不足，例如在培养液方面，采用过滤海水制成，成本较高，过程较为繁琐，适用性不广，往往需要针对不同的藻类进行配方调整；而在培养方法方面，由于培养流程不合理，导致培养周期长，藻类易受污染，资源浪费等情况。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种微拟球藻工业化培养的方法，针对目前粗放分级式微藻扩培方法，该方法由一种封闭式连续化微拟球藻培养生物反应器取代常规微藻工业化养殖分级式扩培得模式，使此微藻工业化培养前期扩种效率大大提高，此外与传统的微藻跑道池一次性培养不同的是，该方法在后期跑道池培养模式中采用半连续培养，培养完成后通过收取一半藻液后，对另一半藻液进行补充藻液和营养盐的模式进行连续培养，这种前期封闭式反应器扩种后期跑道池半连续培养的模式大大节省了一次性培养的接种时间、人工，提高了微拟球藻工业化养殖的成功率。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种微拟球藻工业化培养的方法，包括如下步骤，

步骤一，搭建封闭式连续化微拟球藻培养生物反应器：所述生物反应器包括三口三角瓶、三口圆底烧瓶、三口封闭式玻璃平板，其中三口三角瓶、三口圆底烧瓶和三口封闭式玻璃平板通过管路相互进行联通组成统一整体，三种容器分别有三个开口，分别是营养液注入口、藻液流出口、通气和出气口；且三种容器在水平位置上分别呈现不同的高度，三者的水平高度分别为三口三角瓶＞三口圆底烧瓶＞三口封闭式玻璃平板，待不同的容器达到额定培养容积后，上一级的藻液会通过连通管由液位差自然流入到下一个容器；

步骤二，微拟球藻接种：对已知微拟球藻采用平板划线的方法进行纯化，得到单克隆藻株后进行纯培养，待藻液体积达到200ml，生物量达到1g/l后，开始进行接种工作；

步骤三，微拟球藻扩培：将培养得到的微拟球藻接种入三口三角瓶，后通过每天向三口三角瓶中流加营养液进行培养，待培养藻液体积达到三口三角瓶额定体积后，藻液通过管路进入到三口圆底烧瓶中，此后每天向三口圆底烧瓶中流加一定量的营养液，待藻液体积达到三口圆底烧瓶额定体积后，藻液通过管路进入到三口封闭式玻璃平板中，继续向三口封闭式玻璃平板中流加营养液进行培养至藻液达到三口封闭式玻璃平板额定体积；

步骤四，工业化培养：完成一个周期的步骤三的微拟球藻培养后，将三口封闭式玻璃平板中藻液注入至开放式跑道池进行培养，经过10-12天的培养，待微拟球藻生物量达到1-1.5g/l后进行收集；

步骤五，藻液收集和再培养：将开放式跑道池中培养得到的藻液抽取一半通过管路泵进离心机进行收集，藻液收集后通过向开放式跑道池中补充新鲜营养液和三口封闭式玻璃平板中培养的藻液进行多次循环培养收集。

优选地，所述三口三角瓶容积为2l，所述三口圆底烧瓶容积为15l，所述三口封闭式玻璃平板容积为200l，所述开放式跑道池容积为5t。

进一步地，所述步骤三中在微拟球藻接种扩培阶段初始接种密度为2×10⁷cell/ml。

进一步地，所述步骤三中，藻类培养需要进行温度、光照及其通气控制，培养条件为：营养液为ph值6-8的f/2灭菌培养基，光源为人工led光源、光照强度3000lx全光照24h培养，温度为恒温23℃，培养周期为10-15天，通入气体co2的过滤空气，通气流量200ml/min。

进一步地，所述步骤四中，微拟球藻的培养条件为：营养液为ph值6-8的f/2灭菌培养基，温度23-25℃，光照和黑暗周期比12:12，通气量5l/min。

进一步地，所述f/2灭菌培养基组成为：nano30.3-0.35g/l，kh2po40.15-0.2g/l、cacl20.05-0.1g/l、edta-na24-7mg/l。

进一步地，通入co2的过滤空气，其中co2的体积占空气体积的3-5％。

本发明有益效果：

本发明一种微拟球藻工业化培养的方法，针对目前粗放分级式微藻扩培方法，该方法由一种封闭式连续化微拟球藻培养生物反应器取代常规微藻工业化养殖分级式扩培得模式，使此微藻工业化培养前期扩种效率大大提高，此外与传统的微藻跑道池一次性培养不同的是，该方法在后期跑道池培养模式中采用半连续培养，培养完成后通过收取一半藻液后，对另一半藻液进行补充藻液和营养盐的模式进行连续培养，这种前期封闭式反应器扩种后期跑道池半连续培养的模式大大节省了一次性培养的接种时间、人工，提高了微拟球藻工业化养殖的成功率；本发明通过藻液纯培养(平板划线)→封闭式连续化微拟球藻培养生物反应器扩种→微拟球藻连续化生产(椭圆形开放式跑道池)的技术路线进行微拟球藻不断传代放大培养，并最终实现微拟球藻的工业化稳定生产，此种培养方法能够实现藻液在工业化培养过程中有效衔接，前期通过连续封闭式的微拟球藻生物反应器对藻液进行连续无菌扩培，通过调控培养方法和培养模式使得微拟球藻生产速率提高，活性增强，能够实现稳定高效培养，极大的节省了人力和物力，为微拟球藻连续工业化培养提供有力的保障。

附图说明

图1为本发明中培养装置结构示意图；

图2为三口圆底烧瓶中藻液体积与培养时间对应关系；

图3为三口封闭式玻璃平板中藻液体积与培养时间对应关系

图中：1营养液储存罐，2三口三角瓶，3三口圆底烧瓶，4三口封闭式玻璃平板，5开放式跑道池，6碟式离心机，7风机，8反应器通气供应管路，9反应器营养液供应管路。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做如下说明：

步骤一，如图1所示，首先搭建封闭式连续化微拟球藻培养生物反应器，所述生物反应器包括三口三角瓶、三口圆底烧瓶、三口封闭式玻璃平板，所述三口封闭式玻璃平板为长方体形封闭容器结构，其可打开，方便接种，在进行培养前整个系统需要消毒杀菌。其中三口三角瓶、三口圆底烧瓶和三口封闭式玻璃平板通过管路相互进行联通组成统一整体，三种容器分别有三个开口，分别是营养液注入口、藻液流出口、通气和出气口；且三种容器在水平位置上分别呈现不同的高度，三者的水平高度分别为三口三角瓶＞三口圆底烧瓶＞三口封闭式玻璃平板，待不同的容器达到额定培养容积后，上一级的藻液会通过连通管由液位差自然流入到下一个容器。三种容器之间通过管路相互连通，且在三口三角瓶上方安装营养液储存罐，所述营养液储存罐分别通过反应器营养液供应管路与三种容器相连，三种容器上部出口封闭，并通过反应器通气供应管路与风机相连，风机向三种容器中通入的气体均为混有co2的过滤空气，其中co2的体积占空气体积的3-5％。所述反应器通气供应管路、反应器营养液供应管路优选地在三种容器内采用插底管式插入。所述反应器通气供应管路、反应器营养液供应管路还设置有控制阀用以控制供气和供液流量保证微藻存活。所述营养液为ph值6-8的f/2灭菌培养基，具体组成为：nano30.3-0.35g/l，kh2po40.15-0.2g/l、cacl20.05-0.1g/l、edta-na24-7mg/l。

步骤二，微拟球藻接种：对已知微拟球藻采用平板划线的方法进行纯化，按1％琼脂糖含量加入到含有f/2灭菌培养基的灭菌海水中，在超净工作台中进行微拟球藻平板划线或涂布，待平板中单克隆藻株长出后进行灭菌培养基纯种培养。待藻液体积达到200ml，生物量达到1g/l后，开始进行接种工作。

步骤三，微拟球藻扩培：得到纯培养的纯种微拟球藻藻液按照1:5比例进行2l三口三角瓶扩种，微拟球藻接种密度2×10⁷cell/ml、体积200ml，在3000lx人工led光源下24h恒温23℃通气流加营养液进行培养，接种后通过反应器的营养液供应系统控制反应器营养液供应管路流量，每天对三口三角瓶进行200ml营养液补充供应，经过十天流加培养达到三口三角瓶的额定体积2l后，通过调整反应器营养液供应管路流量每天继续对三口三角瓶进行500ml营养液补充，持续向三口三角瓶中每天通入500ml营养液15天进行流加培养，在持续通入营养液的过程中三口三角瓶中培养的藻液会由于液位差自动流入三口圆底烧瓶，。

在上述2l三口三角瓶达到额定容积后，流加培养每天可为15l三口圆底烧瓶提供500ml微拟球藻纯种藻液，此时，通过调整与三口圆底烧瓶相连的反应器通气供应管路、反应器营养液供应管路上的控制阀，每天往三口圆底烧瓶中直接加入500ml新鲜灭菌营养液进行扩培(培养条件为f/2培养基、led光源24h、恒温23℃通混有co2(co2占空气体积的3-5％)的过滤气体流量200ml/min)，待15天后，通过上游三口三角烧瓶流入的藻液和新鲜营养液的补充，三口圆底烧瓶中藻液达到额定体积15l，此时三口圆底烧瓶中微拟球藻生物量可培养至7×10⁸～1.3×10⁹cell/ml。此后调整反应器营养液供应管路上的控制阀参数，每天向三口圆底烧瓶中加入新鲜灭菌营养液1.5l进行补充，同时上游三口三角瓶中继续补充500ml新鲜灭菌营养液并经过三口三角瓶由液位差流入三口圆底烧瓶，进行持续培养。

当三口圆底烧瓶达到微拟球藻额定培养体积后，持续加入的1.5l新鲜灭菌营养液以及三口三角瓶中流来的500ml藻液可使三口圆底烧瓶每天为200l三口封闭式长方体玻璃平板提供2l微拟球藻高密度纯培养藻液。在三口封闭式长方体玻璃板内接种后，营养液供应系统对200l三口封闭式玻璃平板每天流加新鲜灭菌营养液20l，培养条件同三口圆底烧瓶，经过10天三口封闭式玻璃平板达到额定体积后完成一个周期得微拟球藻扩种培养，后将培养得到得200l微拟球藻藻液接种入5t开放式跑道池进行半连续培养，此时反应器中完成一个周期的微拟球藻，而在反应器中实现连续培养。

步骤四，工业化培养：将三口封闭式玻璃平板中的藻液接种入5t开放式跑道池中，进行培养，培养条件为室温，ph6-8、光照为自然光，培养基配方：nano30.3-0.35g/l，kh2po40.15-0.2g/l、cacl20.05-0.1g/l、edta-na24-7mg/l，培养周期为10-12天。

步骤五，藻液收集和再培养：待5t开放式跑道池完成10-12天的工业化培养后，藻液生物量密度达到5×10⁸-8×10⁸cell/ml时，抽取2.5t体积的藻液进行碟式离心收集，收集后补充2.3t灭菌新鲜培养液和封闭式连续化微拟球藻培养生物反应器扩培得200l微拟球藻藻液，进行下一批次培养，培养期10-12天，此后进行周期循环，从而达到微拟球藻的半连续工业化培养。

采用此种方法经过封闭式连续化微拟球藻生物反应器进行前期高效连续微拟球藻扩培，此扩配方法具有节省人工、高效、可持续、可靠性高等优点，较传统的一次性逐级扩培此种方法经过一次扩培养能够实现藻种的连续式多次扩培，后期的开放式跑道池半连续工业化养殖较传统的开放式跑道池微拟球藻培养具有培养效率高、节省培养成本的优点。此发明为微拟球藻的工业化培养提供了一套简便高效的培养方法。