一株高效净化污水的金黄微杆菌菌株及其应用的制作方法

本发明属于功能微生物技术领域，具体涉及一株高效净化污水的金黄微杆菌菌株及其应用。

背景技术：

黑臭水体的治理是我国环境管理领域的热点话题之一。据北京市水务局公布的信息，北京市也有不少黑臭水体有待治理(北京市水务局网站)。细菌微生物在黑臭水体的净化和修复中发挥着重要作用(张宗阳，2010；黄菲菲，2012；程士兵，2012)。有学者从黑臭水体中分离出细菌等微生物，并且验证了分离出的菌株在黑臭水体或污水净化中具有良好作用。如高丹英等(2010)从武汉市某黑臭水体中筛选出10种光合细菌且发现其对水质净化有较好作用。叶姜瑜等(2012)从四川省某黑臭水体中筛选出12株细菌且发现其对水质净化有较好作用。因此，来源于黑臭水体的细菌等微生物能够在水质净化中发挥重要作用是共识。但目前尚未见从北京市黑臭水体中分离出金黄微杆菌用于黑臭水体治理的报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一株高效净化污水的金黄微杆菌菌株及其应用，实现污染水体治理。

本发明提供了一株高效净化污水的金黄微杆菌(chryseomicrobiumimtechense)菌株yg-01，所述菌株的保藏编号为cgmccno.19535。

优选的，所述菌株yg-01的生长ph值为7～10。

优选的，所述菌株yg-01的生长盐度为0.5‰～10‰。

本发明提供了所述菌株yg-01在污水净化中的应用。

优选的，所述污水的ph值为7～10。

优选的，所述污水的盐度为0.5‰～3‰。

优选的，所述污水处理的温度为28～32℃。

优选的，经所述菌株yg-01处理后，污水的cod去除率为53％～80％。

本发明提供了一种利用金黄微杆菌菌株yg-01净化污水的方法，包括以下步骤：

将金黄微杆菌菌株yg-01的菌液接种至污水中，28～32℃条件下处理48～108h；所述菌株yg-01的保藏编号为cgmccno.19535。

优选的，所述菌液的接种量为3％～8％；所述菌液的活菌浓度为1×10⁹cfu/ml～9×10⁹cfu/ml。

本发明提供的高效净化污水的金黄微杆菌(chryseomicrobiumimtechense)菌株yg-01，所述菌株的保藏编号为cgmccno.19535。所述菌株yg-01经形态学和16srdna分子鉴定，结果表明该细菌为金黄微杆菌(chryseomicrobiumimtechense)。经过生长特性的研究，该菌株适宜生长ph值为7～10，适宜生长盐度为0.5‰～10‰，适宜生长温度为35～38℃。由此可见，所述菌株yg-01对强碱和高盐条件不敏感，为后续污水净化方面的利用奠定了基础。

本发明提供了所述菌株yg-01在污水净化中的应用。实验证明，污水的ph值为7～10时，所述菌株yg-01处理污水96h后，污水的cod去除率达到50％～80％；污水的盐度为0.5‰～3‰时，所述菌株yg-01处理污水96h后，污水的cod去除率达到70％～80％。由此可见，利用所述菌株yg-01对污水经净化处理，能够实现高效去除cod的作用，为工业净化污水提供新手段。

生物材料保藏信息

金黄微杆菌(chryseomicrobiumimtechense)，本发明所述的金黄微杆菌菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2020年3月30日。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，生物保藏编号为cgmccno.19535，菌株编号为yg-01。

附图说明

图1为金黄微杆菌菌株yg-01革兰氏染色结果，其中观察条件为油镜，倍数×1000倍；

图2为不同温度下的金黄微杆菌菌株yg-01生长曲线；

图3为不同ph条件下的金黄微杆菌菌株yg-01生长曲线；

图4为不同盐度条件下的金黄微杆菌菌株yg-01生长曲线，其中正常是指lb液体培养基的自然盐度，没有额外添加氯化钠；高盐是在lb液体培养基的基础上额外添加了10‰氯化钠；低盐是在lb液体培养基基础上额外添加了1‰氯化钠；

图5为不同盐度条件下反应体系中合成污水cod变化情况；

图6为不同ph值条件下反应体系中合成污水cod变化情况。

具体实施方式

本发明提供了一株高效净化污水的金黄微杆菌(chryseomicrobiumimtechense)菌株yg-01，所述菌株的保藏编号为cgmccno.19535。

在本发明中，所述菌株yg-01从北京市昌平区温榆河黑臭河段底泥中分离纯化得到。所述菌株yg-01的菌体形态为短杆状，革兰氏染色结果为蓝色，为革兰氏阳性菌。经16srdna测序、比对，结果表明，所述菌株yg-01为金黄微杆菌(chryseomicrobiumimtechense)。

在本发明中，所述菌株yg-01的适宜生长ph值优选为7～10，而酸性条件(例如ph值为6)对所述菌株yg-01有抑制作用，不利于其生长。所述菌株yg-01的适宜生长盐度优选为0.5‰～10‰，所述菌株yg-01对高盐条件不敏感。所述菌株yg-01的适宜生长温度为35～38℃，低温(20℃)在短期内不适应所述菌株yg-01的生长，例如在开始阶段，20℃的较低温度明显抑制了细菌的生长，但12h后，20℃条件下的金黄微杆菌生长逐渐体现出优势；而37℃条件下所述菌株yg-01在较短时间内展示出典型的“调整期、对数期、稳定期和衰亡期”细菌生长的四个阶段。因此，菌株扩大培养时选择在37℃条件下开展。

本发明提供了所述菌株yg-01在污水净化中的应用。所述污水的ph值优选为7～10，更优选为8～9。所述污水的盐度优选为0.5‰～3‰，更优选为1‰。所述污水处理的温度优选为35～38℃，更优选为37℃。经所述菌株yg-01处理后，污水的cod去除率优选为53％～80％。

本发明提供了一种利用金黄微杆菌菌株yg-01净化污水的方法，包括以下步骤：将金黄微杆菌菌株yg-01的菌液接种至污水中，28～32℃条件下处理48～108h；所述菌株yg-01的保藏编号为cgmccno.19535。

在本发明中，所述菌液的接种量优选为3％～8％，更优选为5％；所述菌液的活菌浓度优选为1×10⁹cfu/ml～9×10⁹cfu/ml，更优选为5×10⁹cfu/ml。所述处理的温度优选为30℃。

在本发明中，所述菌株的培养基优选为lb液体培养基。所述菌株的培养温度为35～38℃，更优选为37℃。所述菌株优选在振荡条件下进行培养，所述振荡的转速优选为150～200rpm。

在本发明中，所述菌株yg-01处理污水后，优选对污水进行测定cod值，以处理后的污水cod值与处理前污水cod值之商(100％)作为评价菌株yg-01处理污水性能的标准。

下面结合实施例对本发明提供的一株高效净化污水的金黄微杆菌菌株及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1材料与方法

1)底泥样品采集

在北京市昌平区温榆河黑臭河段(东经116.221176，北纬40.168619)，选取2处代表性位点，取表层底泥混合后约20g，带回实验室4℃保存。

1)细菌分离与鉴定

(1)底泥梯度稀释液制备

称取10g底泥与90ml无菌生理盐水充分混合制成土壤悬液；吸取1ml土壤悬液(100梯度)加入9ml无菌生理盐水中，混合均匀得到10^-1稀释液；依此类推，共制成100到10^-7共8个梯度稀释液。

(2)细菌分离与鉴定

制备lb培养基平板，分别吸取各梯度稀释液200μl加到平板上，均匀涂布，每个梯度做2个重复，同时设无菌对照，37℃倒置过夜培养。选择菌落清晰的平板挑取菌落划线，并将划线平板37℃倒置过夜培养，连续划线培养2次。将纯化的菌落菌株yg-01委托背景美集桑格生物公司测序鉴定。

测序报告结果表明，菌株yg-01经16srdna测序、比对，结果表明，菌株yg-01为金黄微杆菌(chryseomicrobiumimtechense)。

3)细菌形态观察

对目标菌株yg-01进行革兰氏染色，实验方法参照文献(余展旺主编，微生物分离和鉴别.机械工业出版社,2014年.)。经涂片、固定、染色、媒染、脱色、水洗和复染等步骤后，进行油镜观察并拍照记录。

菌株yg-01经油镜观察，结果如图1所示，细菌短杆状，革兰氏染色结果为蓝色，为革兰氏阳性菌。

将菌株yg-01保藏至生物材料保藏机构进行保藏，保藏编号为cgmccno.19535。

实施例2

金黄微杆菌的生长曲线探究

金黄微杆菌生长曲线探究方法参照文献(王兰主编。环境微生物学实验方法与技术。北京：化学工业出版社，2009年)。

(1)不同温度条件下金黄微杆菌生长曲线探究

取14只细菌培养管，每管装lb液体培养基5ml，灭菌，然后加入2％金黄微杆菌液，分别置20℃和37℃振荡培养。分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h取样4℃保存，测菌液吸光值od600。

不同温度下的金黄微杆菌生长曲线如图2所示。由图2可知，在开始阶段，20℃的较低温度明显抑制了细菌的生长，但12h后，20℃条件下的金黄微杆菌生长才逐渐恢复。所述菌株yg-01在37℃条件，比20℃更适合细菌生长，细菌在较短时间内展示出典型的“调整期—对数期—稳定期—衰亡期”细菌生长的四个阶段。因此后面净化污水的试验都是选择的在37℃条件下开展。

(2)不同ph值条件下金黄微杆菌生长曲线探究

分别调节液体培养基ph值至6.0和9.0。取14只培养管，酸性组和碱性组各7只。培养基分装、灭菌、取样检测等同步骤(1)。

不同ph条件下(酸性为6.0，碱性为9.0)的金黄微杆菌菌株yg-01生长曲线见图3。在ph值6.0条件下，金黄微杆菌生长受到很大抑制。但在ph值9.0条件下，金黄微杆菌生长没有受到明显影响，甚至在12h时的生长状况要优于正常条件。

(3)不同盐度条件下金黄微杆菌生长特性探究

取14只培养管，高盐度组(10‰)和低盐度组(1‰)各7只。培养基分装、灭菌、取样检测等同步骤(1)。

不同盐度条件下的金黄微杆菌菌株yg-01生长曲线见图4。图4表明，高盐度和低盐度对于金黄微杆菌的生长没有造成明显影响。

实施例3

净化合成污水能力探究

实验参照文献(杨小龙.复合菌剂的研制及其对水产养殖污水的净化作用.南昌大学硕士论文,2012年.)，具体步骤如下：

(1)配制合成污水并测定cod，具体为人工合成污水配方：a.先配制储存液：葡萄糖11.5g/l、乙酸钠15.4g/l、酵母菌提取物5.75g/l、氯化铵5.42g/l、磷酸氢二钾1.32g/l、磷酸氢二钾0.43g/l、痕量元素混合液100毫升，其中痕量元素混合液的配方为：na2-edta3.73g/l、h3bo31.24g/l、mncl20.4g/l、ki0.166g/l、na2moo40.036g/l、cuso4·6h2o0.005g/l、cocl2·2h2o0.005g/l；合成污水的原始ph值约为7.0，原始盐度根据文献不到1‰；b.取100毫升储备液稀释至10l，得到溶液的理论cod值为267mg/l；

(2)扩大培养金黄微杆菌(温度为37℃，培养基为lb液体培养基，转速为180rpm)；

(3)离心富集细菌(离心转速为8000rpm，离心时间为10min，离心温度为4℃)；

(4)用无菌生理盐水清洗富集的细菌2次；

(5)将合成污水的ph分为如下几组：酸性组(ph＝6.0)、中性组(ph＝7.0)、碱性组(ph＝8.0、ph＝9.0、ph＝10.0)；每组设12个试管，每试管分装10ml污水；

(6)将合成污水的盐度分为如下几组：低盐度组(1‰)，高盐度组(10‰)，每组设12个试管，每试管分装10ml污水；

(7)将清洗后的细菌按照5％接种量分别接种于4组合成污水中，30℃恒温培养；

(8)分别于0h、12h、24h、48h、72h和96h取样，将样品离心取上清液，检测溶液cod。

金黄微杆菌在不同盐度条件下净化合成污水的结果如图5所示。低盐度组(1‰)的cod值从170mg/l降低到43mg/l，降低了74.7％，净化作用非常显著；而高盐度组(10‰)的cod值在前72h内基本保持不变，在第96h降低到135mg/l，降低了25％，体现出一定的净化作用。

金黄微杆菌在不同ph值条件下净化合成污水的结果如图6所示。酸性组(ph值6.0)的cod值在96h内基本没有变化，表明加入的金黄微杆菌在此期间对合成污水没有明显净化作用；ph值9.0组，96小时处理后污水的cod值从190mg/l降低到79mg/l，降低了58.4％；ph8.0组，处理96小时cod降解率64.3％，ph10.0组，96小时处理后污水的cod降解率53.7％净化作用明显；而中性组(ph值为7.0)的cod值从190mg/l降低到79mg/l，降低了76.7％，净化作用最为明显。

由上述实施例可知，本发明保护的金黄微杆菌(chryseomicrobiumimtechense)菌株yg-01具有在高盐和强碱条件下生长的生物学特性，所述菌株yg-01在中性和强碱性以及低盐条件下能高效净化污水，污水的cod去除率最高达到80％，与现有技术中净化污水的细菌相比具有明显优势。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。