一种生物还原马索亚油制备天然丁位癸内酯及丁位十二内酯的方法与流程

本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种生物还原马索亚油制备天然丁位癸内酯及丁位十二内酯的方法。

背景技术：

丁位癸内酯与丁位十二内酯具有椰子香气，在低浓度时呈奶油香气，存在于椰子和树莓等水果中，是调制牛奶、奶油、椰子、草莓、桃等香精的重要原料，市场需求量大。

目前市场上的丁位癸内酯及丁位十二内酯主要为化学合成的产品。随着社会的进步与发展，人类回归大自然的意愿越来越强烈，促使天然香料在食品行业的应用越来越广泛。相比于化学合成的产品，以天然的底物为原料，通过生物转化得到的天然香料具有更高的市场接受度和附加值。

现有技术中，天然的丁位癸内酯及丁位十二内酯的生产，主要依赖微生物发酵还原马索亚油中的5-羟基-2-癸烯酸δ-内酯与5-羟基-2-十二烯酸δ-内酯，时空产率及产物浓度低，不具有工业应用的价值。如us6187741公开的技术方案中使用saccharomycescerevisiae发酵还原5-羟基-2-癸烯酸δ-内酯65h仅能产7.37g/l丁位癸内酯，发酵还原5-羟基-2-十二烯酸δ-内酯60h仅能产4g/l丁位十二内酯。us6025170公开的技术方案中使用clostridiumtyrobutyricumi-776静息细胞40h仅能产7g/l丁位癸内酯，44h仅能产9.6g/l丁位十二内酯。us5763233公开的技术方案中使用pseudomonasputidaatcc33015发酵还原5-羟基-2-癸烯酸δ-内酯48h仅能得到10.9g/l丁位癸内酯。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种生物还原马索亚油制备天然丁位癸内酯及丁位十二内酯的方法。

本发明的另一目的在于提供一种用于上述方法的巴氏酵母saccharomycespastorianusomk-70。

本发明的技术方案如下：

一种生物还原马索亚油制备天然丁位癸内酯及丁位十二内酯的方法，包括如下步骤：

(1)将巴氏酵母saccharomycespastorianusomk-70依次经固体斜面培养基和种子培养基培养后，获得种子培养液；巴氏酵母saccharomycespastorianusomk-70于2019年12月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为：cctccno：m20191123：

(2)将该种子培养液接种于发酵培养基中培养，至菌体生长至对数早期后分批加入马索亚油，并不断流加葡萄糖继续发酵；

(3)在步骤(2)所得的培养液中加入乙酸丁酯，充分搅拌反应，静置分层后取上层油相；

(4)回收上述上层油相中的乙酸丁酯后，将所得锅底进行精馏，控制精馏温度，收集不同温度的馏分，即得天然丁位癸内酯及丁位十二内酯。

在本发明的一个优选实施方案中，包括如下步骤：

(1)菌种活化：从低温保藏的甘油管中划线巴氏酵母saccharomycespastorianusomk-70于固体斜面培养基上，于28℃-30℃静置培养48-72h后得到活化菌种；

(2)制备种子培养液：将步骤(1)所得的活化菌种接种于种子培养基中，于28℃-30℃且200-250rpm条件下震荡培养至对数早期，即得种子培养液；

(3)发酵及转化：将步骤(2)所得的种子培养液按5-10％的体积比接种于发酵培养基中，于ph4.8-6.4，28℃-30℃，搅拌转速100-600rpm，通气量1∶0.5的条件下发酵6-12h，至菌体生长至对数早期后分批加入马索亚油，并不断流加葡萄糖继续发酵48-72h；

(4)萃取：在步骤(3)所得的物料中按0.8-1.2∶0.8-1.2的体积比加入乙酸丁酯，于30℃-40℃，200-300rpm搅拌1-2h，静置分层后取上层油相；

(5)回收溶剂：将步骤(4)所得的上层油相转移至蒸馏瓶常压回收乙酸丁酯；

(6)精馏：将步骤(5)所得锅底转移至精馏塔进行精馏，控制精馏温度，收集不同温度的馏分，即得天然丁位癸内酯及丁位十二内酯。

在本发明的一个优选实施方案中，所述固体斜面培养基的配方按质量百分比包括：蛋白胨0.5-5％，酵母提取物0.1-3％，葡萄糖1-5％，琼脂0.5-5％，溶剂为水。

进一步优选的，所述固体斜面培养基的配方按质量百分比为：蛋白胨2.5％，酵母提取物1.5％，葡萄糖2.5％，琼脂1.5％，余量为水。

在本发明的一个优选实施方案中，所述种子培养基的配方按质量百分比包括：蛋白胨0.5-5％，酵母提取物0.1-3％，葡萄糖1-5％，溶剂为水。

进一步优选的，所述种子培养基的配方按质量百分比为：蛋白胨2.5％，酵母提取物1.5％，葡萄糖2.5％，余量为水。

在本发明的一个优选实施方案中，所述发酵培养基的配方按质量百分比包括：葡萄糖2.0-5.0％，磷酸二氢铵0.5-1.0％，磷酸二氢钾0.1-0.5％，硫酸镁0.05-0.2％，硫酸钙0.05-0.1％，酵母浸粉0.1-1.0％，溶剂为水。

进一步优选的，所述发酵培养基的配方按质量百分比为：葡萄糖2％，磷酸二氢铵1％，磷酸二氢钾0.5％，硫酸镁0.2％，硫酸钙0.1％，酵母浸粉0.5％，余量为水。

本发明的另一技术方案如下：

一种巴氏酵母saccharomycespastorianusomk-70，于2019年12月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为：cctccno：m20191123。

上述巴氏酵母saccharomycespastorianusomk-70在生物还原马索亚油制备天然丁位癸内酯及丁位十二内酯中的应用。

本发明的有益效果是：使用本发明的巴氏酵母saccharomycespastorianusomk-70发酵还原马索亚油中的5-羟基-2-癸烯酸δ-内酯与5-羟基-2-十二烯酸δ-内酯，，丁位癸内酯的时空产率可达1.1g/(l*h)，产物浓度可达52.1g/l，远高于现有的生产工艺，生产成本大幅降低，具有良好的工业应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例2中的巴氏酵母saccharomycespastorianusomk-70发酵还原马索亚油的gc图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1天然丁位癸内酯及丁位十二内酯的生产(三角摇瓶发酵)

(1)菌种获取

从海洋泥床中分离出一株可以催化5-羟基-2-癸烯酸δ-内酯还原生成丁位癸内酯的菌株，经18srdna与its测序鉴定为巴氏酵母，命名为巴氏酵母saccharomycespastorianusomk-70。该菌株于2019年12月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为：cctccno：m20191123。

(2)菌种活化：从-80℃甘油管中划saccharomycespastorianusomk-70涂布于固体斜面培养基上，于30℃静置培养60h后得到活化菌种。

固体斜面培养基的配方按质量百分比具体如下：蛋白胨2.5％；酵母提取物1.5％；葡萄糖2.5％，琼脂1.5％，余量为水。

(3)制备种子培养液：将所得的活化菌种接种于装有30ml种子培养基的500ml三角摇瓶中，于29℃，250rpm培养4-6h，即得种子培养液。

种子培养基的配方按质量百分比具体如下：蛋白胨2.5％，酵母提取物1.5％，葡萄糖2.5％，溶剂为水，初始ph7.5，115℃灭菌30min。

(4)发酵及转化：将5ml种子培养液接种于装有50ml发酵培养基的500ml三角摇瓶中，于29℃，250rpm发酵培养8h。待菌体进入对数生长期后加入20g/l的马索亚油(含有65％的5-羟基-2-癸烯酸δ-内酯，17％的5-羟基-2-十二烯酸δ-内酯)，于29℃，250rpm继续发酵72h，期间每隔12h补加10g/l葡萄糖。

(5)萃取：发酵结束，升温60℃灭活，使用等体积乙酸丁酯对所得发酵液中的天然丁位癸内酯及丁位十二内酯进行萃取：于30℃-40℃，200-300rpm搅拌1-2h，静置分层后取上层油相，使用gc测定含量，其中丁位癸内酯的浓度为12.6g/l，转化率为96.9％，丁位十二内酯的浓度为2.9g/l，转化率为85.3％。

发酵培养基的配方按质量百分比具体如下：葡萄糖2％、磷酸二氢铵1％、磷酸二氢钾0.5％、硫酸镁0.2％、硫酸钙0.1％、酵母浸粉0.5％，溶剂为水，初始ph7.5，115℃灭菌30min。

实施例2天然丁位癸内酯及丁位十二内酯的生产(发酵罐发酵)

步骤(1)至(2)同实施例1；

(3)制备种子培养液：将所得的活化菌种接种于装有50ml种子培养基的500ml三角摇瓶中，于30℃，250rpm培养10-12h，得到一级种子液；将一级种子液50ml全部接入装有6l种子培养基的10l种子罐中，于30℃，搅拌转速250rpm，通气量1∶0.5的条件下培养6-8h，得到二级种子液；

种子培养基的配方同实施例1。

(4)发酵及转化：30l发酵罐装16.2l发酵培养基，于115℃灭菌30min，按接种量10％将培养好的二级种子液接入30l发酵罐进行培养，培养条件：温度30℃，搅拌转速400rpm，通气比1∶0.5，发酵培养8h后加入20g/l马索亚油继续发酵，并按20g/h的流速流加70％葡萄糖溶液，后续分别于发酵16、26和40h各补加20g/l马索亚油一次，总周期55h。

(5)萃取：发酵结束，升温60℃灭活，使用等体积乙酸丁酯对所得发酵液中的天然丁位癸内酯及丁位十二内酯进行萃取：于30℃-40℃，200-300rpm搅拌1-2h，静置分层后取上层油相，使用gc测定含量，其中丁位癸内酯的浓度为52.1g/l，转化率为100.0％，丁位十二内酯的浓度为11.8g/l，转化率为86.9％。(其gc图如图1所示)。

(6)回收溶剂、精馏：取该上层油相转移至蒸馏瓶常压回收乙酸丁酯，完成后，将锅底移至精馏塔，控制精馏温度，收集不同温度的馏分，即得天然丁位癸内酯821.3g，收率为87.7％，纯度97％，ee值92.1％(r)；天然丁位十二内酯186.5g，收率为76.2％，纯度98％，ee值91.8％(r)。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。