本发明属于细菌培养技术领域，特别是指一种幽门螺杆菌体外培养的方法。
背景技术：
幽门螺杆菌(hp)是一种微需氧微生物，目前的研究认为hp感染与胃粘膜疾病包括胃癌的发生关系密切，在临床上有需求对hp感染者进行检测，尤其对hp根除失败者应进行hp体外培养，以获得hp药敏结果，从而选择有效的抗生素进行hp根治。
hp需要o2、co2及n2三种气体才能培养成功，并且通常情况下，三种气体的体积比为5％的o2,10％的co2,85％的n2，需要专门的三通气罐。
但三通气罐专业性强，对除hp外的其他微生物培养应用价值不大，对很多非专门研究hp的机构而言，购买三通气罐无疑增加成本、占用空间，造成一定程度的资源浪费。且所需的气体管道需要对普通的实验室进行重新装修，更增加了实施难度，造成目前hp体外分离受培养条件的限制，很多医院无法进行hp体外分离培养，影响了对hp的临床检测和根除治疗有效率。且若想对hp进行进一步体外扩大培养用于实验等，则需使用hp液体培养摇床震荡，在无三通气罐、无特殊气体管道供应气体的情况下，采用什么样的hp培养方法才能达到既能保证温度、震荡速度，又能保证特殊、稳定的气体环境，相关医学研究者和技术人员常常对此较为困惑。
为了实现幽门螺杆菌的简单快速培养，现有技术提出，使用特定的产气袋置于培养幽门螺杆菌的空间内，由产气袋提供幽门螺杆菌所需要的气体环境。这样的技术的使用简化了幽门螺杆菌的培养条件，避免了需要设定特定的实验室，从而降低了培养成本。但是，使用专门的产气袋存在以下缺陷，因为任何一种产气袋，其在整个培养过程中，其产气量并不稳定，在产气的初期，气体产量高，此时，幽门螺杆菌的生长速度较慢，所需气体量不高，导致培养装置中的气体压力较高，而影响幽门螺杆菌的生长速度，当培养后期，此时幽门螺杆菌快速生长，所需要的气体量增加，此时产气袋的产气量在减少，与幽门螺杆菌的快速生长所需要的气体量不附，导致装置内的气体量被快速消耗，而导致幽门螺杆菌的培养周期是处于一个不稳定的环境中，而影响幽门螺杆菌的培养。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种幽门螺杆菌体外培养的方法，以解决现技术的幽门螺杆菌的培养条件要求较苛刻，很多医院因不具备hp培养的气体条件而无法进行体外分离培养，及采用产气袋培养不能保证培养环境稳定的问题。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种幽门螺杆菌体外培养的方法，包括以下步骤：
s1、准备密封盒及hp产气装置；
s2、准备接种hp用的固体培养板或培养液；
s3、将设定要求的hp接种到所述固体培养板上或培养液中；
s4、将hp产气装置置于密封盒内，将步骤s3中接种有hp的固体培养板或培养液的培养瓶放入到密封盒内，并将密封盒密封，在整个培养周期内，所述hp产气装置内的气体压力均大于密封盒内的气体压力；
s5、将放置有固体培养板的密封盒置于37℃恒温孵化箱中培养设定时间；或者将放置有培养瓶的密封盒置于37℃恒温摇床中进行震荡中震荡培养设定时间。
所述hp产气装置为hp专用产气袋和充气袋组成，或仅由充气袋组成，在所述充气袋内充有氧气、二氧化碳及氮气的混合气体。
所述hp专用产气袋和充气袋并列置于所述密封盒内，或者所述hp专用产气袋置于所述充气袋内，再在hp专用产气袋与所述充气袋之间充入氧气、二氧化碳及氮气的混合气体。
所述密封盒包括但不限于塑料密封盒或金属密封盒。
用于恒温摇床上的密封盒包括但不限于圆柱体结构。
所述培养瓶包括但不限于三角瓶或摇菌管。
所述hp专用产气袋能够产生氧气、二氧化碳及氮气的混合气体。
在所述混合气体中，按体积百分比计，所述氧气、二氧化碳及氮气分别为5％：10％：85％。
本发明的有益效果是：
本技术方案将现技术的三通气罐使用密封盒+hp产气装置替换，避免气罐、管道等造成的空间占用及冗余的成本支出，使大多数相关科室或实验室的现有实验条件非常容易的就能满足hp体外分离培养、扩大培养的需求，具有简便、易行及可操作的特点。
并且，本申请方案的hp产气装置内的气体压力始终大于密封盒内的气体压力，保证向密封盒内供应的气体的量保持基本的稳定，使得幽门螺杆菌在一个相对稳定的气体环境中进行培养，提高了培养效果。
具体实施方式
以下通过实施例来详细说明本发明的技术方案，以下的实施例仅是示例性的，仅能用来解释和说明本发明的技术方案，而不能解释为是对本发明技术方案的限制。
本技术方案提供一种幽门螺杆菌体外培养的方法，本技术方案也适用于有特殊气体环境需要的微生物培养，区别是将本申请的hp专用产气袋替换为与微生物培养匹配的能够制造特殊环境的装置。使用密封盒及hp产气装置，其中密封盒为能够用于密封的塑料密封盒或金属密封盒均可。hp产气装置为能够提供氧气、二氧化碳及氮气的混合气体的装置，在本申请的技术方案中，根据幽门螺杆菌的特性，混合气体中，氧气占混合气体的体积百分比为5％，二氧化碳占混合气体的体积百分比为10％，氮气占混合气体的体积百分比为85％。
在本申请中，hp产气装置由hp专用产气袋和充气袋组成，即将hp专用产气袋和充气袋均放置于密封盒内，在充气袋内充入氧气、二氧化碳及氮气分别为5％：10％：85％的混合气体，且充气袋内的混合气体压力大于密闭盒内的压力，从而保证在整个培养周期内，密封盒内的混合气体的量相对稳定，具体为，因为将hp专用产气袋和充气袋同时置于密封盒内，此时，专用产气袋内产生混合气体释放到密封盒内，同时，充气袋内的混合气体也缓慢释放到密封盒内，当密封盒内的气体量达到一定程度时，会对hp专用产气袋的产气量及充气袋的释放速度均产生一定的影响，从而延长了hp专用产气袋的产气时间。在培养初期，因为需要的混合气体量较少，对密封盒内气体的量影响不大，当幽门螺杆菌进入快速的对数繁殖期后，其对混合气体的需要量快速增加，此时，密封盒内的气体量在快速减少，若使用现有技术仅为hp专用产气袋，此时，产气量跟不上消耗速度，而影响到幽门螺杆菌的生长。本技术方案，通过充气袋的使用，在一定程度上抑制了hp专用产气袋的产气反应速度，再与充气袋共同保证了密封盒内气体量的稳定。
在本申请的其它实施例中，hp产气装置也是由hp专用产气袋与充气袋组成，不同之处为，将hp专用产气袋置于充气袋内，再在充气袋内充入氧气、二氧化碳及氮气分别为5％：10％：85％的混合气体，再将hp产气装置置于密封盒内。此装置的优点是，混合气体统一由充气袋溢出到密封盒内，充气袋内的气体压力大于或等于密封盒内的气体压力，此时，因为在hp专用产气袋外部的混合气体的影响，该产气袋内气体的产生速度减慢，随着培养时间的增加，幽门螺杆菌进入对数繁殖期时，混合气体被快速消耗，若是依据现有技术，因为充气袋内气体压力的降低，期释放到密封盒内的气体量减少，而影响到幽门螺杆菌的生长，此时，因为充气袋内气体量的减少，对hp专用产气袋的压力降低，产生混合气体的材料的反应速度增加，并释放到充气袋内，从而维持了充气袋内压力的稳定，进而释放到密封盒内的混合气体量也相对恒定，保证了在整个培养周期内气体环境的稳定。
在本申请的其它实施例中，hp产气装置也可以为充气袋，并且能够缓慢从袋体中溢出的储气袋，在充气袋内充入足量的混合气体，以满足幽门螺杆菌培养的需要，充气袋内混合气体的压力大于或等于密封盒内的气体压力，从而能够保证密封盒内气体环境的稳定，但是优选充气袋内的气体压力大于密封盒内气体压力的1.2倍或以上。在本申请的其它实施例中，氧气、二氧化碳及氮气占混合气体的体积百分比会有不同，只要适合幽门螺杆菌的生长的气体即可。
用于接种hp的可以为固体培养板也可以为培养液，培养板与培养液的制备方法均为现有技术，并不是本申请的重要保护范围，在此以培养液为例，可以为布氏肉汤、布氏肉汤+β-环状糊精、布氏肉汤+胎牛血清、mhb、mhb+β-环状糊精、mhb+胎牛血清、脑心浸液、脑心浸液+胎牛血清、脑心浸液+β-环状糊精等等。
实施例1
将hp专用产气袋和充有混合气体的充气袋均置于塑料密封盒内，充气袋内充入的混合气体与hp专用产气袋产生的混合气体的各组成的含量基本相同，将hp接种到固体培养板上，并将固体培养板置于塑料密封盒内，hp专用产气袋能够产生氧气、二氧化碳及氮气的体积百分比为5％：10％：85％的混合气体，充气袋能够溢出混合气体，符合幽门螺杆菌的培养环境，将塑料密封盒密封后，再放入37℃恒温孵化箱中培养3天。
实施例2
将hp专用产气袋和充有混合气体的充气袋均置于塑料密封盒内，充气袋内充入的混合气体与hp专用产气袋产生的混合气体的各组成的含量基本相同，将hp接种到固体培养板上，并将固体培养板置于塑料密封盒内，hp专用产气袋能够产生氧气、二氧化碳及氮气的体积百分比为5％：10％：85％的混合气体，充气袋能够溢出混合气体，符合幽门螺杆菌的培养环境，将塑料密封盒密封后，再放入37℃恒温孵化箱中培养5天。
实施例3
将hp专用产气袋和充有混合气体的充气袋均置于圆柱体塑料密封盒内，hp专用产气袋能够产生氧气、二氧化碳及氮气的体积百分比为5％：10％：85％的混合气体，将hp接种到装有培养液的三角瓶中，并将三角瓶放入到塑料密封盒内密封，将塑料密封盒置于37℃恒温摇床中进行震荡，培养3天。选用圆柱体塑料密封盒以更适于弹簧的尺寸，更好的嵌入摇床的弹簧中。
实施例4
将hp专用产气袋置于充气袋内，再将充气袋内充入氧气、二氧化碳及氮气的体积百分比为5％：10％：85％的混合气体，再将充气袋均置于塑料密封盒内，将hp接种到固体培养板上，并将固体培养板置于塑料密封盒内，hp专用产气袋能够产生氧气、二氧化碳及氮气的体积百分比为5％：10％：85％的混合气体，充气袋能够溢出混合气体，符合幽门螺杆菌的培养环境，将塑料密封盒密封后，再放入37℃恒温孵化箱中培养3天。
实施例5
将hp专用产气袋置于充气袋内，再将充气袋内充入氧气、二氧化碳及氮气的体积百分比为5％：10％：85％的混合气体，将充气袋置于圆柱体塑料密封盒内，hp专用产气袋能够产生氧气、二氧化碳及氮气的体积百分比为5％：10％：85％的混合气体，将hp接种到装有培养液的三角瓶中，并将三角瓶放入到塑料密封盒内密封，将塑料密封盒置于37℃恒温摇床中进行震荡，培养3天。选用圆柱体塑料密封盒以更适于弹簧的尺寸，更好的嵌入摇床的弹簧中。
实施例6
将充有混合气体的充气袋置于塑料密封盒内，将hp接种到固体培养板上，并将固体培养板置于塑料密封盒内，充气袋内混合气体为氧气、二氧化碳及氮气的体积百分比为5％：10％：85％的混合气体，充气袋能够溢出混合气体，符合幽门螺杆菌的培养环境，将塑料密封盒密封后，再放入37℃恒温孵化箱中培养3-5天，具体天数根据需要而确定。
实施例7
将充有混合气体的充气袋均置于圆柱体塑料密封盒内，混合气体为氧气、二氧化碳及氮气的体积百分比为5％：10％：85％的混合气体，将hp接种到装有培养液的三角瓶中，并将三角瓶放入到塑料密封盒内密封，将塑料密封盒置于37℃恒温摇床中进行震荡，培养3天。选用圆柱体塑料密封盒以更适于弹簧的尺寸，更好的嵌入摇床的弹簧中。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变形，本发明的范围由所附权利要求极其等同限定。