用于检测犬四种病毒的多重PCR检测引物、检测方法及应用与流程

本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种用于检测犬四种病毒的多重pcr检测引物、检测方法及应用。

背景技术：

犬冠状病毒(caninecoronavirus，ccv)、犬副流感病毒(canineparainfluenzavirus，cpiv)、犬传染性肝炎病毒(canineinfectioushepatitisvirus，ichv)和犬传染性喉气管炎病毒(canineinfectiouslaryngotracheitisvirus，iclv)是引起犬类疾病的主要病原体。ccv可能造成病犬，特别是发病幼犬的死亡；犬副流感属于犬类的常见疾病之一，犬感染cpiv后，常引起一系列的继发感染，严重时可以导致犬死亡；犬传染性肝炎是一种高度接触性、急性、败血性传染病，病原为犬腺病毒i型(canineadenovirustype-1，cav-1)。该病一旦发病，年龄在1岁以下的幼犬死亡率较高，且临床上往往会与犬瘟热发生混合感染，危害巨大；犬传染性喉气管炎是由犬腺病毒ii型(canineadenovirustype-2，cav-2)引起的，是一种犬易感的慢性呼吸道传染病，常引起喉炎、气管、支气管炎等症状。

犬副流感病毒和犬传染性喉气管炎病毒所引起的疾病属于犬的呼吸道疾病，是一类常见的疾病，这类疾病在一年四季均有发生，但整体上夏季发病较少，而在其余季节和换季的时候发病率和死亡率较高。引起犬呼吸道疾病的因素众多，病毒、细菌、真菌、寄生虫等因素皆可引起此类疾病，除此之外，花粉、药物引起的过敏和异物吸入等物理因素也可引起犬呼吸道疾病。犬呼吸道疾病在临床上的常见症状相似，主要为：体温升高、咳嗽、喷嚏，流鼻涕等,该病通常会在短时间内自我治愈，除非涉及其他因素，如混合感染，否则该病是不致命的。因此仅从视诊方面难以确诊，需借助x光机、血常规等方法进行进一步的检测，而犬呼吸道疾病经常两种或两种以上混合感染，这使得疾病的诊断变得更加困难。因这类疾病经常为两种或多种混合感染，临床症状相似，治疗周期较长等，众多因素使得确诊难度较高，因此在临床治疗方面，如何判断正确的病因，受到了养犬行业和兽医师等相关人员的高度重视。

犬传染性肝炎病毒和犬传染性喉气管炎病毒的分别是由犬腺病毒i型和ii感染而来，而犬腺病毒是目前已知的哺乳动物腺病毒属中致病性最强的一种病毒，其基因组中含有4个早期转录区分别为e1,e2,e3和e4，犬传染性肝炎病毒和犬传染性喉气管炎病毒在基因序列的主要差别在e3区，在e3区cav-2比cav-1多500bp左右。犬传染性肝炎病毒和犬传染性喉气管炎病毒的致病性强，但犬传染性肝炎病毒因其特别容易感染1岁以下的幼犬，而且致死率高，临床上经常与犬瘟热发生混合感染，再加上即使痊愈后也会长期带毒，使得其虽发现的病例较少，但对我国养犬的各行各业的危害巨大。cav-2是一种慢性的呼吸道传染病。cav-2免疫能够有效的针对cav-1，而且在我国cav的感染相当普遍，任何年龄、性别和品种的犬都易感，因此cav-2的研究意义重大。

犬冠状病毒与犬瘟热病毒、犬细小病毒都属于犬常见的烈性传染病，但相对于前两者，在日常中人们对犬冠状病毒的重视明显不够，该病主要的表现为肠胃炎，临床症状为呕吐和腹泻，本病在临床症状，病理解剖，流行病学等方面皆没有特征性的指标，因此该病的检测比较困难，通常需要电镜观察等实验室检测手段进行检测，而且临床上经常消失后在一段时间后复发，无论是对环境还是对犬的健康都有着严重的危害。

犬冠状病毒、犬传染性肝炎病毒、犬传染性喉气管炎病毒以及犬副流感病毒是犬易感染的四种病毒，对我国养犬行业带来了严重经济利益损失，在饲养过程中需要定期监测。近年来对各病毒均建立了多种诊断方法，但未形成标准化。常见的血清学诊断方法在病毒含量低时容易形成漏检，胶体金方法检测灵敏度高，却容易出现假阳性结果。另外，由于四种病毒常出现混合感染的现象，因此建立一种对四种病毒的混合感染进行同时检测的方法，为犬的健康监测建立标准化的检测方法极为重要。

技术实现要素：

本发明的目的是提供用于检测犬四种病毒的多重pcr引物、检测方法及应用，设计了三对多重pcr检测引物，以该引物建立的pcr检测方法能够同时检测ccv、cpiv、cav-1和cav-2四种病毒的混合感染，相比现有技术，具有检测灵敏度高、特异性好等优点，并且还能减少假阳性的出现，可实现快速、准确、敏感、早期发现病原体目标，为建立犬的健康监测建立标准化的检测方法提供了技术支持，可大大节省时间和成本。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种用于检测犬四种病毒的多重pcr引物，包括：

用于检测犬冠状病毒的引物ccv-f和ccv-r，分别如seqidno：1和seqidno：2所示；

用于检测犬副流感病毒的引物cpiv-f和cpiv-r，分别如seqidno：3和seqidno：4所示；以及

用于检测犬腺病毒i型和犬腺病毒ii型的引物cav-f和cav-r，分别如seqidno：5和seqidno：6所示。

本发明还提供利用所述的引物检测犬四种病毒的多重pcr方法，包括：50μl多重pcr反应体系：2×easytaqsupermix25μl、ccv-f和ccv-r各0.5μl、犬腺病毒i型和犬腺病毒ii型cav-f和cav-r各0.5μl、cav-f和cav-r各0.5μl、犬冠状病毒模板1.2μl、犬副流感病毒模板1.2μl、犬腺病毒i型和犬腺病毒ii型模板1.2μl和ddh2o16.2μl；

优选的是，还包括：多重pcr反应程序：94℃，5min；94℃，30s；55℃，30s；72℃，90s，30个循环；72℃，10min；4℃保存。

本发明还提供一种所述的引物在用于检测犬四种病毒的多重pcr检测试剂盒中的应用。

本发明还提供一种所述的引物在制备检测犬四种病毒单一感染或混合感染试剂中的应用。

本发明还提供一种所述的多重pcr方法在用于检测犬四种病毒的多重pcr检测试剂盒中的应用。

优选的是，应用于制备检测犬四种病毒单一感染或混合感染试剂中。

本发明公开了以下技术效果：

本发明针对ccv、cpiv、cav-1和cav-2病毒的全基因组序列，分别对各病毒基因组序列进行同源性分析，并以ccv的s基因上的序列，cpiv的np基因上的片段以及cav-1和cav-2的e3基因的片段分别设计引物，组成检测犬四种常见病毒多重pcr检测引物。三对引物采用等浓度等比例混合的方式用于临床上疑似四种病毒病料的pcr检测，发现该引物不仅仅对于单一感染病料可进行检测，而对于四种病毒的混合感染也能进行检测，并且具有灵敏度高、特异性好的优点，可减少出现假阳性的概率，实现快速、准确、敏感、早期鉴定病原体的目标，为犬的健康监测建立标准化的检测方法提供技术支持，大大节省时间和成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明ccv、cpiv、cav-1和cav-2病毒单重pcr扩增结果；a：m，marker；第一泳道，ccv病毒；b：m，marker；第一泳道，cpiv病毒；c：m，marker；第一泳道，cav-i病毒；d：m，marker；第一泳道，cav-ii病毒；

图2为本发明ccv、cpiv、cav-1和cav-2病毒的多重pcr扩增结果；m，marker；第一泳道，四种病毒混合；

图3为本发明ccv、cpiv、cav-1和cav-2病毒多重pcr敏感性测试结果；m：dl2000dnamarker；第一泳道：模板浓度为400ng/μl；第一泳道2：模板浓度为200ng/μl；第三泳道：模板浓度为100ng/μl；第四泳道：模板浓度为50ng/μl。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

用于检测犬四种病毒的多重pcr引物的设计

1、实验材料

病毒株ccv株和cav-2株来源于青岛农业大学动物医学院微生物与免疫实验室保存，cpiv株和cav-1株由北纳创联代购于atcc。

2、实验方法

从genbank数据库中检索ccv、cpiv、cav-1和cav-2病毒的全基因组序列，分别对各病毒基因组序列进行同源性分析，同时查阅文献，确定四种病毒各自的保守区序列，用primer5.0等引物设计软件以ccv的s基因上的序列，cpiv的np基因上的片段以及cav-1和cav-2的e3基因的片段设计引物(如表1所示)。

表1多重pcr引物序列

3、rna和dna的提取

采用购自天根生化科技有限公司的病毒基因组dna/rna提取试剂盒，提取犬传染性肝炎病毒和犬传染性喉气管炎病毒的阳性毒株的dna作为模板，提取犬冠状病毒和犬副流感病毒阳性毒株的的rna后，用购自宝日医生物技术有限公司的反转录试剂盒进行反转录，得到的cdna作为模板，将四种病毒的模板调整浓度后混合，分别用四种病毒的引物，进行单一的pcr扩增，之后对四种病毒的引物进行四重pcr的扩增。

4、多重pcr检测方法的建立

pcr扩增条件，如表2所示。

表2多重pcr体系

pcr反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸90s，30个循环；72℃终延伸10min；4℃保存。

5、电泳检测

pcr结束后，对所获得的pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。称取0.2g琼脂糖置于锥形瓶中，加入20ml的1×tae，用锡箔纸封口置于微波炉中多次煮沸，至溶液澄清，待溶液温度降至50℃-60℃时，滴加3μl的核酸染料，轻摇混匀，倒入模具中，等待15-20min，待胶凝成型后，放入电泳槽中，向电泳槽中加入1×tae至刚好没过凝胶，向点样孔中分别加入10μldl2000dnamarker和10μl的pcr扩增产物，加样后立即通电，设定电压为120v，运行20-30min。结束后，将电泳结果放到凝胶成像仪下，打开紫外，观察扩增长度和亮度。

6、结果

在多重pcr方法建立的时候，对其退火温度进行了优化，退火温度在57℃的pcr扩增条带已经变的模糊，有拖带现象，当退火温度在55℃时，pcr扩增的电泳条带明亮且清晰，效果相差较为明显，可以看出最佳的退火温度是55℃时，将此退火温度用于多重pcr中。

ccv、cpiv、cav-1和cav-2引物扩增得到的片段长度分别为445bp、577bp、501bp、1023bp，与实际相符，如图1和图2所示，图1为每种病毒单重pcr，图2为多重pcr结果。

实施例2

多重pcr的特异性试验

在临床上收集犬的粪便肛门拭子和鼻拭子，以此为模板，用病毒基因组dna/rna提取试剂盒对临床采集的样品进行dna/rna的提取，rna反转录为cdna后，进行pcr扩增，选取扩增得到的犬冠状病毒和犬副流感病毒阳性病料的的cdna，犬传染性肝炎病毒和犬传染性喉气管炎病毒的阳性病料的dna，一只健康犬的肛门拭子和鼻拭子提取的cdna和dna，犬细小病毒的阳性病料作为模板，进行多重pcr在临床特异性试验。在ccv模板中加入cpiv和cav的引物；在cpiv的模板中加入ccv和cav的引物；在cav-1和cav-2的模板中都加入ccv和cpiv的引物；向健康犬的提取的模板和犬细小病毒的模板加入ccv、cpiv和cav三种的引物，用实施例1中的多重pcr的反应条件进行pcr的扩增，通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

结果显示：将健康犬的肛门拭子和鼻拭子提取的dna作为模板，提取到的rna，反转录为cdna后作为模板，还有犬细小病毒的阳性病料用试剂盒提取并反转录的cdna作为模板，分别进行多重pcr扩增，在琼脂糖凝胶电泳之后，用凝胶成像仪观看，发现并未产生扩增条带。

实施例3

多重pcr敏感性测试

使用犬冠状病毒和犬副流感病毒阳性毒株的cdna、犬传染性肝炎病毒和犬传染性喉气管炎病毒的阳性毒株的dna为模板，使用分光光度计将cdna和dna调整浓度，使最终浓度为400ng/μl，然后进行4次2倍比稀释，分成4个梯度，分别为400ng/μl、200ng/μl、100ng/μl、50ng/μl，用实施例1中的多重pcr的反应条件进行pcr的扩增，通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

结果显示：如图3所示，4个梯度浓度经电泳后，在凝胶成像仪上都能观察到清晰的条带，但模板浓度在低于100ng/μl之后清晰度开始降低，pcr扩增结果相对于更高浓度的效果较差。

实施例4

多重pcr的临床验证

对在南昌警犬基地随机收集鼻拭子和肛门拭子各250份，从南昌警犬基地收集的8份ccv阳性病料，1份cpiv和1份cav-2的阳性病料，和从其它各个狗场共采集有呼吸道症状，腹泻症状的犬的鼻拭子和肛门拭子共32份进行阳性检测。多重pcr检测方法如实施例1。

如表3所示结果显示：用多重pcr方法发现ccv有15份，cpiv3份，cav-2有5份，未检测到cav-1，分析其原因认为可能是采集大量病料的时间在于夏季这个时间段，犬类传染病较少，再加上cav-1一般感染1岁以下的小犬，发病死亡率高，造成活着的带毒的犬较少。用胶体金检测发现ccv有17份，cpiv3份，cav-2有5份，未检测到cav-1。结果符合预期。

表3临床验证结果

实施例5

多重pcr重复性检测

对实施例4中检测的每种病毒选取2份阳性病料，进行10次重复检测，发现多次pcr扩增的电泳结果，无明显差异，因此可以得出，该多重pcr的方法，可重复使用，稳定性较高。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110>青岛农业大学

<120>用于检测犬四种病毒的多重pcr检测引物、检测方法及应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ctataatggcacggctct18

<210>2

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tgttgaggctatgggtt17

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tcgctaccatcagccaca18

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

agaagcctcccattccac18

<210>5

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

cgcgctgatcaatactaccttgtc24

<210>6

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

tcttcgtgtccgcttcat18