一株粘质沙雷氏菌工程菌及其在生产灵菌红素中的应用的制作方法

本发明涉及一株粘质沙雷氏菌工程菌及其在生产灵菌红素中的应用，属于生物技术领域。

背景技术：

灵菌红素是一类含三吡咯骨架结构的天然红色素，主要由一些微生物产生，具有抗癌、免疫抑制、抗虫等多种生物活性，可作为免疫抑制剂和抗癌药物开发，受到研究者的广泛关注。

目前，生产灵菌红素的方法主要有化学合成法和微生物发酵法。其中，化学合成法主要是通过串联共轭加成及高温脱氢的方法获得灵菌红素。但是，由于途径复杂且困难、产率低下，化学合成法难以实现大规模工业化生产。微生物发酵法则主要是通过微生物发酵获得灵菌红素。与化学合成法相比，微生物发酵法具有工艺相对简单、环境友好、条件温和和成本低等的优势。

然而，现有的生物法也仍存在一定的缺陷，其中，产量不高是阻碍微生物发酵法工业化进程最主要的缺陷。例如，kim等人通过将hahellachejuensiskctc2396接种至海生菌肉汤2216培养基中进行发酵以生产灵菌红素，但是，使用此方法发酵40h，仅可使发酵液中灵菌红素的产量达28mg/l(具体可见参考文献：kimsj,leehk,leeyk,etal.mutantselectionofhahellachejuensiskctc2396andstatisticaloptimizationofmediumcomponentsforprodigiosinyield-up[j].journalofmicrobiology,2008,46(2):183-188.)；marthaingridgutiérrez-román等人通过将serratiamarcescenscffsur-b4接种至花生基培养基中进行发酵以生产灵菌红素，但是，使用此方法发酵24h，仅可使发酵液中灵菌红素的产量达40.6μg/ml(具体可见参考文献：marthaingridgutiérrez-román,franciscoholguín-meléndez,bello-mendozar,etal.productionofprodigiosinandchitinasesbytropicalserratiamarcescensstrainswithpotentialtocontrolplantpathogens[j].worldjournalofmicrobiologyandbiotechnology,2012,28(1):p.145-153.)。

因此，急需找到一株可高产灵菌红素的微生物以克服上述缺陷。

技术实现要素：

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一株可高产灵菌红素的粘质沙雷氏菌工程菌。

[技术方案]

为解决上述技术问题，本发明提供了一株粘质沙雷氏菌工程菌，所述粘质沙雷氏菌工程菌以粘质沙雷氏菌(serratiamarcescens)为宿主敲除编码响应调节蛋白cpxr的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述响应调节蛋白cpxr的氨基酸序列如seqidno.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述编码响应调节蛋白cpxr的基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述粘质沙雷氏菌为粘质沙雷氏菌jnb5-1。

本发明还提供了一种生产灵菌红素的方法，所述方法为将上述粘质沙雷氏菌工程菌接种至发酵培养基中进行发酵，获得含有灵菌红素的发酵液；将含有灵菌红素的发酵液进行分离，获得灵菌红素。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的温度为28～30℃、转速为180～200rpm。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的温度为30℃、转速为180rpm。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含蔗糖、牛肉膏、cacl2、脯氨酸、mgso4·7h2o和feso4·7h2o。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含15～25g/l蔗糖、10～20g/l牛肉膏、5～15g/lcacl2、5～10g/l脯氨酸、0.1～0.3g/lmgso4·7h2o和0.04～0.08g/lfeso4·7h2o。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含20g/l蔗糖、15g/l牛肉膏、10g/lcacl2、7.5g/l脯氨酸、0.2g/lmgso4·7h2o和0.06g/lfeso4·7h2o。

本发明还提供了上述粘质沙雷氏菌工程菌或上述方法在生产灵菌红素中的应用。

[有益效果]

本发明提供了一株可高产灵菌红素的粘质沙雷氏菌工程菌jnb5-1δcpxr，此粘质沙雷氏菌工程菌jnb5-1δcpxr是通过敲除粘质沙雷氏菌jnb5-1中编码响应调节蛋白cpxr的基因获得的，将此粘质沙雷氏菌工程菌jnb5-1δcpxr接种至发酵培养基中发酵96h，即可使发酵液中灵菌红素的产量高达5.83g/l，较野生型粘质沙雷氏菌jnb5-1提高了41.9％。

附图说明

图1：重组质粒pet-28a-cpxr的酶切验证结果；其中，1为重组质粒pet-28a-cpxr，2为经酶切的重组质粒pet-28a-cpxr，m为dl10000dnamarker。

图2：纯化后的响应调节蛋白cpxr的sds-page分析结果。

图3：响应调节蛋白cpxr结合粘质沙雷氏菌jnb5-1灵菌红素合成基因簇启动子pig的emsa验证结果。

图4：敲除质粒put-km-δcpxr-apm的酶切验证结果；其中，1和3为敲除质粒put-km-δcpxr-apm，2和4为经酶切的敲除质粒put-km-δcpxr-apm，m为dl10000dnamarker。

图5：粘质沙雷氏菌jnb5-1和粘质沙雷氏菌工程菌jnb5-1δcpxr发酵生产灵菌红素的产量。

具体实施方式

下述实施例中涉及的大肠杆菌(escherichiacoli)bl21和大肠杆菌(escherichiacoli)s17-1λpir购自invitrogen公司；下述实施例中涉及的pet-28a质粒和put-km质粒购自nevogen公司；下述实施例中涉及的t-vectorpmd19(simple)质粒购自takara公司；下述实施例中涉及的粘质沙雷氏菌(serratiamarcescens)jnb5-1记载于文献“徐虹,徐美娟,杨套伟,等.温度对粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的影响[j].微生物学报,2014,54(5):517-524.”中，并且，申请人保证从申请日起二十年内向公众发放此菌株。

下述实施例中涉及的培养基和试剂如下：

lb液体培养基：蛋白胨10g/l、酵母膏5g/l、nacl10g/l。

lb固体培养基：蛋白胨10g/l、酵母膏5g/l、nacl10g/l、琼脂15g/l。

发酵培养基：蔗糖20g/l、牛肉膏15g/l、cacl210g/l、脯氨酸7.5g/l、mgso4·7h2o0.2g/l、feso4·7h2o0.06g/l。

2x结合缓冲液：40mmtris-hcl(ph7.5)、4mmmgcl2、100mmnacl、10％(v/v)甘油、2mmdtt、0.2mg/mlbsa、0.02mg/ml聚(di-dc)、1mmedta。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

灵菌红素含量的测定：以酸性乙醇为空白对照，取发酵液溶解到酸性乙醇(ph3.0)中，得到样品；将样品做适度的稀释(50、250、1000倍)，得到稀释样品；将稀释样品密封放置8h(充分溶解灵菌红素)后3000r·min^-1离心10min，取上清；测定上清的a535的值，根据标准曲线y＝1.1936x-0.001计算得到发酵液中灵菌红素的含量；标准曲线y＝1.1936x-0.001中，y代表a535值，x代表灵菌红素产量，单位mg/100ml。

实施例1：粘质沙雷氏菌工程菌jnb5-1δcpxr的构建

具体步骤如下：

(1)响应调节蛋白cpxr的功能鉴定

以粘质沙雷氏菌jnb5-1的基因组为模板，通过pcr扩增编码响应调节蛋白cpxr的基因cpxr(响应调节蛋白cpxr的氨基酸序列如seqidno.1所示、编码响应调节蛋白cpxr的基因cpxr的核苷酸序列如seqidno.2所示)；将获得的编码响应调节蛋白cpxr的基因cpxr与pet-28a质粒经bamhi/saci双酶切后连接，得到连接产物；将连接产物转化大肠杆菌bl21，得到转化产物；将转化产物涂布在lb固体培养基(含有50μg·ml^-1卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至lb液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证(验证结果见图1)以及测序验证，验证正确即获得大肠杆菌工程菌bl21/pet-28a-cpxr；将大肠杆菌工程菌bl21/pet-28a-cpxr划线于lb固体培养基上，于37℃的条件下培养8～12h，得到单菌落；挑取单菌落接种于lb液体培养基中，于37℃的条件下培养8～12h，得到种子液；将种子液以1％(v/v)的接种量接种至lb液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下培养至od＝0.6～0.8后，在lb液体培养基中添加终浓度为0.5mm的iptg，于37℃、180rpm的条件下继续培养10～12h，获得发酵液；将发酵液离心取菌体；将菌体超声波细胞破碎后镍柱亲和层析，获得响应调节蛋白cpxr。

利用sds-page分析响应调节蛋白cpxr的纯化情况(分析结果见图2)，结果表明：纯化效果较好。

对响应调节蛋白cpxr进行凝胶阻滞实验(emsa)以了解响应调节蛋白cpxr对粘质沙雷氏菌jnb5-1灵菌红素合成基因簇启动子的调控机制(实验结果见图3)，结果表明：响应调节蛋白cpxr与粘质沙雷氏菌jnb5-1灵菌红素合成基因簇启动子的结合亲和力随着响应调节蛋白cpxr蛋白量的增加而增加，可见，响应调节蛋白cpxr可与粘质沙雷氏菌jnb5-1的灵菌红素合成基因簇启动子结合。即使添加的粘质沙雷氏菌jnb5-1灵菌红素合成基因簇启动子量保持在0.25μm，响应调节蛋白cpxr的结合亲和力也有一个倾斜的向上梯度。

通过regulondb在线分析预测响应调节蛋白cpxr的基序以及其与粘质沙雷氏菌jnb5-1灵菌红素合成基因簇启动子的结合位点，结果表明：响应调节蛋白cpxr的基序为“tttacnnnnntttacn”(seqidno:3)，其与粘质沙雷氏菌jnb5-1灵菌红素合成基因簇启动子的结合位点位于粘质沙雷氏菌jnb5-1的灵菌红素合成基因簇启动子“tttatttacatttacc”(seqidno:4)区域；

pcr所用引物如下：

cpxrf：cagcaaatgggtcgcggatccatgaacaagattctgttagttgacgac(seqidno:5)；

cpxrr：gcaagcttgtcgacggagctctcatgttgcagataccatcaaataac(seqidno:6)；

凝胶阻滞实验(emsa)如下：

以粘质沙雷氏菌jnb5-1的基因组为模板，通过pcr扩增待测试启动子(灵菌红素合成基因簇启动子pig)；将待测试启动子克隆到t-vectorpmd19(simple)质粒中，得到重组质粒pmd19-ppig；使用荧光标记的引物m13-47-cy3和rv-m-cy3通过pcr扩增重组质粒pmd19-ppig的上的启动子片段(ppig)，得到cy3标记的pcr产物；将纯化的his标记的响应调节蛋白cpxr与cy3标记的pcr产物在2x结合缓冲液中于25℃处理30分钟，得到混合物；将混合物在5％非变性page上进行电泳。

(2)粘质沙雷氏菌工程菌jnb5-1δcpxr的构建

以粘质沙雷氏菌jnb5-1的基因组为模板，通过pcr扩增分别获得编码响应调节蛋白cpxr的基因cpxr的上游片段cpxru(seqidno:7)和下游片段cpxrd(seqidno:8)；化学合成安普霉素抗性基因片段apm(cpxr)(seqidno:9)；通过重叠延伸pcr依次将上游片段cpxru、安普霉素抗性基因片段apm(cpxr)和下游片段cpxrd连接，获得cpxr基因缺失片段；将获得的cpxr基因缺失片段与put-km质粒经kpni/saci双酶切后连接，得到连接产物；将连接产物转化大肠杆菌s17-1λpir，得到转化产物1；将转化产物1涂布在lb固体培养基(含有50μg·ml^-1卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子1；挑取转化子1接种至lb液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证(验证结果见图4)以及测序验证，验证正确即获得大肠杆菌工程菌s17-1λpir/put-km-δcpxr-apm和敲除质粒put-km-δcpxr-apm；将大肠杆菌工程菌s17-1λpir/put-km-δcpxr-apm和粘质沙雷氏菌jnb5-1分别接种至lb液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下培养16h，得到培养液；将培养液离心取菌体；将大肠杆菌工程菌s17-1λpir/put-km-δcpxr-apm和粘质沙雷氏菌jnb5-1共同接种至lb固体培养基上进行共培养，通过接合转移的方式将大肠杆菌工程菌s17-1λpir/put-km-δcpxr-apm中的敲除质粒put-km-δcpxr-apm转化至粘质沙雷氏菌jnb5-1中，得到转化产物2；将转化产物2涂布在lb固体培养基(含有50μg·ml^-1安普霉素和50μg·ml^-1克林霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养12～24h，得到转化子2；挑取转化子2接种至lb液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下摇瓶培养8～12h稳定遗传三代，得到培养液；用接种环蘸取培养液在lb固体培养基(含有50μg·ml^-1安普霉素和50μg·ml^-1克林霉素)上划线，于37℃恒温培养箱中倒置培养12～24h，得到单菌落；通过pcr扩增单菌落中编码响应调节蛋白cpxr的基因cpxr，扩增失败即获得粘质沙雷氏菌工程菌jnb5-1δcpxr；

pcr所用引物如下：

cpxruf：acagccggatccccgggtacctcacttctgggcagaagcttg(seqidno:10)；

cpxrur：ggttccgcgcttgttcattatgatttacctccagac(seqidno:11)；

cpxrdf：cgattggctgagcaacatgatcaacagtttgacg(seqidno:12)；

cpxrdr：gcctaggccgaattcgagctccgctgcgctttacatttgg(seqidno:13)；

δcpxrf：atgaacaagattctgttagttgacgac(seqidno:14)；

δcpxrr：tcatgttgcagataccatcaaataac(seqidno:15)。

实施例2：灵菌红素的生产

具体步骤如下：

以粘质沙雷氏菌jnb5-1为对照，挑取实施例1获得的粘质沙雷氏菌工程菌jnb5-1δcpxr的单菌落接种至lb液体培养基(含有50μg·ml^-1安普霉素和50μg·ml^-1克林霉素)中，于37℃、180rpm的条件下振荡培养12h，得到种子液；将种子液以6％(v/v)接种量接种至发酵培养基中，于30℃、180rpm的条件下发酵96h，获得发酵液。

发酵过程中，间隔12h检测发酵液中灵菌红素的含量(检测结果见图5)，结果表明：发酵96h时，粘质沙雷氏菌jnb5-1发酵获得的发酵液中灵菌红素的产量为4.14g/l，粘质沙雷氏菌工程菌jnb5-1δcpxr发酵获得的发酵液中灵菌红素的产量为5.83g/l，较野生型粘质沙雷氏菌jnb5-1提高了41.9％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110>江南大学

<120>一株粘质沙雷氏菌工程菌及其在生产灵菌红素中的应用

<160>15

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>232

<212>prt

<213>粘质沙雷氏菌jnb5-1

<400>1

metasnlysileleuleuvalaspaspasparggluleuthrserleu

151015

leulysgluleuleuglumetgluglypheasnilevalvalalahis

202530

aspglygluglnalaleuserleuleuaspserservalaspleuleu

354045

leuleuaspilemetmetprolyslysasnglyileaspthrleulys

505560

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65707580

glysergluleuaspargvalleuglyleugluleuglyalaaspasp

859095

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100105110

alaileleuargargserasntrpsergluglnglnglnglnvalasp

115120125

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165170175

serarggluleuleuserglngluvalleuglylysargleuthrpro

180185190

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195200205

proasparglysaspglyhisprotrpphelysthrleuargglyarg

210215220

glytyrleumetvalseralathr

225230

<210>2

<211>699

<212>dna

<213>粘质沙雷氏菌jnb5-1

<400>2

atgaacaagattctgttagttgacgacgaccgcgagttgacctcgctgttaaaagaactg60

cttgaaatggaaggttttaatatcgtcgtcgcgcacgatggcgagcaggcgttgtcgctg120

ctggacagctccgtcgatctgctgctgctcgacatcatgatgccgaagaaaaacggcatc180

gatacgttgaaagaactgcgccaacatcaccaaacgccggtcatcatgctgaccgcgcgc240

ggcagcgaactggaccgcgtgttgggcctggagctgggcgccgatgattacctgccgaaa300

cccttcaacgatcgcgaactggtcgcgcgcattcgcgccattctgcgccgttccaactgg360

agcgaacagcagcagcaggtcgacagcggcgccccgacgctggatgtcgatggcctgcag420

ctgaaccccggccgccaggaggccagcttcgacggccaggtgctggatctgaccggcacc480

gagttcaccctcctttacctgctggcgcagcacctcggccaggtggtgtcacgcgaactg540

ctgagccaggaagtgctgggcaaacgcctgaccccgttcgatcgcgccatcgacatgcat600

atctccaacctgcggcgtaagctgccggatcgcaaagacgggcatccgtggttcaaaacc660

ctgcgcgggcgtggttatttgatggtatctgcaacatga699

<210>3

<211>16

<212>dna

<213>粘质沙雷氏菌jnb5-1

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(10)

<223>nisa,c,g,toru

<220>

<221>misc_feature

<222>(16)..(16)

<223>nisa,c,g,toru

<400>3

tttacnnnnntttacn16

<210>4

<211>16

<212>dna

<213>粘质沙雷氏菌jnb5-1

<400>4

tttatttacatttacc16

<210>5

<211>48

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

cagcaaatgggtcgcggatccatgaacaagattctgttagttgacgac48

<210>6

<211>47

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

gcaagcttgtcgacggagctctcatgttgcagataccatcaaataac47

<210>7

<211>637

<212>dna

<213>粘质沙雷氏菌jnb5-1

<400>7

tcacttctgggcagaagcttgctgcaaaccagaaatttgctgctccatctgctgcatgcg60

ctgctgatgtttctggtctaaaacacttttttgctctggcgtcagcaggttatacatttg120

gttgcgcacccgggccatttcgacctggcgcttgacctgctgttgggccatcttttccgc180

ctgggcatacacggcggcttcgtcaaatttctctgcggtcaccagtttatgcatggcttc240

catttcagctacattgacaccaggcagatcgtgccgggcctggcgcatcaaatcgcgcat300

ttgctggcgctgctgttcgctgaggctgacaccgtcgaacatatggtgctggccgggtac360

tcgggtcatcgcgtcgttgccgggaggttgagctgtgtccggtatagtgtcggcagcgaa420

ggcagcggtcgaaccaattgccagcagtgatgccataactaatgcggtcaccttacgcat480

ttcaactcctcaagctttctcactttgcgaatcaacgaggagcagtgtaccgccacacct540

gaaaacctgcgtcagtgcatgtaaaactacgtaaagtcatggaatggcaacagttgatga600

cgtattttgcgtctggaggtaaatcataatgaacaag637

<210>8

<211>1000

<212>dna

<213>粘质沙雷氏菌jnb5-1

<400>8

gcaacatgatcaacagtttgacggcacgcatcttcgccattttctggttcacgttagcct60

tggtgctaatgctggtgctgatggtgcccaagctcgactcccgccagatgacctcattgc120

tcgacagcgagcagcggcaggggttgatgctggaacagcacgtcgaggccgagttgcaaa180

acgatccggccaacgatctgatgtggtggcgccgcctgttccgcgccatcgacaaatggg240

cgccgccgggccagcgcctgctgctggtcaccagcgaaggccgggtgatcggcgcgcagc300

gcaacgaaatgcagatcgtccgcaacttcatcggccaatccgacaactcggatcatccca360

agaagaaaaagtacggccgcgtcgagctggtcgggccgttcgcggtgcgcgacggcgaag420

acaactaccagctgtacctgatccgtcccgccaacagcccgcaatccgatttcatcaacc480

tgatgttcgaccggccgctgctgctgctgatcgtcaccatgctgatcagcgccccgctgc540

tgctgtggctggcctggagtctggcgaaaccggcgcggaacccctatttgtttatttttc600

taaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataa660

tattgaaaaaggaagagtatgtcatcagcggtggagtgcaatgtcgtgcaatacgaatgg720

cgaaaagccgagctcatcggtcagcttctcaaccttggggttacccccggcggtgtgctg780

ctggtccacagctccttccgtagcgtccggcccctcgaagatgggccacttggactgatc840

gaggccctgcgtgctgcgctgggtccgggagggacgctcgtcatgccctcgtggtcaggt900

ctggacgacgagccgttcgatcctgccacgtcgcccgttacaccggaccttggagttgtc960

tctgacacattctggcgcctgccaaatgtaaagcgcagcg1000

<210>9

<211>909

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

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caataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgtcatcagcggtg120

gagtgcaatgtcgtgcaatacgaatggcgaaaagccgagctcatcggtcagcttctcaac180

cttggggttacccccggcggtgtgctgctggtccacagctccttccgtagcgtccggccc240

ctcgaagatgggccacttggactgatcgaggccctgcgtgctgcgctgggtccgggaggg300

acgctcgtcatgccctcgtggtcaggtctggacgacgagccgttcgatcctgccacgtcg360

cccgttacaccggaccttggagttgtctctgacacattctggcgcctgccaaatgtaaag420

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gatgggcaggtacttctcctcggcgtgggacacgatgccaacacgacgctgcatcttgcc600

gagttgatggcaaaggttccctatggggtgccgagacactgcaccattcttcaggatggc660

aagttggtacgcgtcgattatctcgagaatgaccactgctgtgagcgctttgccttggcg720

gacaggtggctcaaggagaagagccttcagaaggaaggtccagtcggtcatgcctttgct780

cggttgatccgctcccgcgacattgtggcgacagccctgggtcaactgggccgagatccg840

ttgatcttcctgcatccgccagaggcgggatgcgaagaatgcgatgccgctcgccagtcg900

attggctga909

<210>10

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<212>dna

<213>人工序列

<400>10

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<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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cgattggctgagcaacatgatcaacagtttgacg34

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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atgaacaagattctgttagttgacgac27

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<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>15

tcatgttgcagataccatcaaataac26