基于羊毛硫氨酸合成酶C样2的治疗剂的制作方法
本申请是申请号为201580070262.8，申请日为2015年3月19日，发明名称为“基于羊毛硫氨酸合成酶c样2的治疗剂”的分案申请。
相关申请的交叉参考
本申请依据35usc§119(e)要求2014年10月24日提交的美国临时专利申请62/068,322和2015年1月8日提交的美国临时专利申请62/101,164的优先权，其中的每一个的全部都以引入的方式并入本文中。
关于联邦赞助的研究的声明
本发明是在美国国家卫生研究院(nationalinstitutesofhealth)授予biotherapeuticsinc.的sbir拨款号1r43dk097940-01a1和sttr拨款号1r41dk099027-01a1下部分地由美国政府支持进行的。美国政府具有本发明中的某些权利。
本发明涉及对疾病和病症进行医学治疗的领域。更具体来说，本发明涉及治疗和预防尤其以下疾病的生物活性化合物类别：发炎性和免疫介导疾病，如发炎性肠病、类风湿性关节炎、牛皮癣、多发性硬化症和1型糖尿病，以及慢性发炎性疾病和病症，如胰岛素抵抗、葡萄糖耐量异常、前驱糖尿病、2型糖尿病和肥胖相关炎症。
背景技术：
羊毛硫氨酸c样蛋白质2(lancl2)(也称为“羊毛硫氨酸合成酶c样蛋白质2”或“羊毛硫氨酸合成酶组分c样蛋白质2”是所表达免疫细胞、胃肠道、神经元、睾丸和胰脏的信号传导路径蛋白质[1]。使lancl2路径活化增加胰岛素敏感性并且减少与各种自身免疫、发炎性和代谢病状相关联的炎症。小鼠中体内和体外测试的结果展示，与对照组相比，使用靶向此路径的化合物在葡萄糖耐量测试中降低葡萄糖水平2倍并且提供与处方
在自身免疫相关炎症的类别内，目前存在自身免疫性病症全球大流行，如发炎性肠病(ibd)、全身性狼疮、类风湿性关节炎、1型糖尿病、牛皮癣、多发性硬化症。还存在慢性代谢发炎性疾病大流行，包括代谢综合征、肥胖、前驱糖尿病、心血管疾病和2型糖尿病。目前的治疗是适度有效的，但昂贵并且具有严重副作用。对自身免疫性疾病最有效的治疗(如抗tnf抗体)的投药途径是经由iv或皮下注射，因而要求访问诊所/手术和频繁监测。lancl2的独特作用模式提供与抗tnf抗体同样有效但不具有副作用和高成本的口服投与的治疗剂。鉴于发炎性和自身免疫性疾病整体的流行性，lancl2路径具有显著影响数百万患者的潜能。
脱落酸(“aba”)是在原始筛选过程中发现的结合于lancl2的一种天然化合物。
在合成有机化学领域中描述大量化合物。各种化合物由以下参考文献提供：diana等人的wo1997/036866、sun等人的wo2006/053109、kim等人的wo2006/080821、nunes等人的wo2007/019417、singh等人的wo2009/067600和wo2009/067621、adams等人的wo2008/079277、urasoe等人的jp2008/056615、stoessel等人的wo2011/066898、bassaganya-riera等人的us2013/0142825以及bassaganya-riera等人的美国专利7,741,367。已知描述于这些参考文献中的化合物中的一些使lancl2路径活化，而另一些不使之活化。
需要研发lancl2路径的新颖配位体以允许治疗针对个别疾病进行特异性定制并潜在地使其功效达到最大。
本申请因此描述一系列化合物类别，其已经通过新颖医药化学方法研发，并使用计算机模拟、体外和体内技术筛选以使其结合于lancl2蛋白质的能力达到最大并且因此在各种疾病病状中实现有益反应，所述疾病病状包括(但不限于)自身免疫、慢性发炎性、代谢和传染性疾病。
技术实现要素：
本发明提供包含式z-y-q-y'-z'的化合物或其药学上可接受的盐或酯，
其中：
z是：
y是：
q是哌嗪-1,4-二基；2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚烷-2,5-二基；2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-2,5-二基；1,4-二氮杂环庚烷-1,4-二基；苯-1,4-二胺-n1,n4-二基；乙烷-1,2-二胺-n1,n2-二基；n1,n2-二烷基乙烷-1,2-二胺-n1,n2-二基；丙烷-1,3-二胺-n1,n3-二基；n1,n3-二烷基丙烷-1,3-二胺-n1,n3-二基；1,4-二氨基蒽-9,10-二酮-1,4-二基；c6芳烃-1,4-二胺-n1,n4-二基，其中所述芳烃在2、3、5或6位被一个到四个取代基取代，并且其中所述取代基独立地选自由以下组成的群组：-c(o)o(c1到c6)烷基、oh、o(c1到c6)烷基、(c1到c6)烷基、cf3、f、cl和br；或被取代的哌嗪-1,4-二基，其中所述哌嗪在2、3、5或6位被一个到八个取代基取代，并且其中所述取代基独立地选自由以下组成的群组：(c1到c6)烷基、芳基、芳基(c1到c6)烷基、c(o)oh和c(o)o(c1到c6)烷基；
y'是：
z'是：
其中：
仅在z'是r5时，y'是单键；
a1和a1'各自独立地是n、n(c1到c6)烷基、o、s或cr6；
a2和a2'各自独立地是n或cr7；
a3和a3'各自独立地是nr8、o或s；
a4和a4'各自独立地是n或cr9；
a5和a5'各自独立地是n或cr10；
a6和a6'各自独立地是n或cr11；
r1、r1'、r2、r2'、r3、r3'、r4、r4'、r5、r6、r7、r8、r9、r10和r11各自独立地选自由以下组成的群组：氢；烷基；卤基；三氟甲基；二烷基氨基，其中每一烷基独立地加以选择；-nh2；烷基氨基；芳基烷基；杂芳基烷基；杂环烷基；被取代的杂环烷基，其被1到2个独立地选自由以下组成的群组的取代基取代：-c(o)oh、-c(o)o(c1到c6)烷基、(c1到c6)烷基、-cf3、f、cl和br；以及被取代的杂芳基烷基；
其中所述被取代的杂芳基烷基被1到3个独立地选自由以下组成的群组的取代基取代：-nh2；-nh(c1到c6)烷基；-n((c1到c6)烷基)2，其中每一烷基独立地加以选择；烷基；卤基；芳基；被取代的芳基，其被1到3个独立地选自由以下组成的群组的取代基取代：-so2r12、-or13、-卤基、-cn、-cf3、氨基烷基-、-s(o)r14和烷基；杂环烷基；杂芳基；被取代的芳基，其被1到3个独立地选自由以下组成的群组的取代基取代：烷基、-cf3、f、cl和br；烷基氨基-；杂环烷基-烷基-氨基-；烷基氨基烷基氨基-；-nhc(o)or15；-nhc(o)nr16r17；-c(o)nr16r17；以及被取代的杂芳基，其被1到3个选自由以下组成的群组的取代基取代：烷基、卤基、cn、nh2、-nh(c1-c6烷基)、-n(c1-c6烷基)2(其中每一烷基独立地加以选择)、-cf3和被取代的芳基(被1到3个独立地选自由-s(o)2r15和-cn组成的群组的取代基取代)；
其中r12、r13、r14、r15、r16和r17各自独立地选自由以下组成的群组：c1-c6烷基、包含独立选择发c1-c6烷基的二烷基氨基、-nh2、烷基氨基、杂环烷基和被取代的杂环烷基(被一个到两个独立地选自由-c(o)o(c1-c6烷基)和c1-c6烷基组成的群组的取代基取代)。
在一些化合物中，a3和a3'中的至少一个是o或s。在一些化合物中，a1和a1'中的一个或两个是n。在一些化合物中，a2和a2'中的一个或两个是ch，a3是nh，a4是n，a5是ch，并且a6是ch。在一些化合物中，a2和a2'中的一个或两个是ch，a3和a3'中的一个或两个是nh，a4和a4'中的一个或两个是n，a5和a5'中的一个或两个是ch，并且a6和a6'中的一个或两个是ch。在一些化合物中，q是哌嗪-1,4-二基；2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚烷-2,5-二基；2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-2,5-二基；1,4-二氮杂环庚烷-1,4-二基；n1,n2-二烷基乙烷-1,2-二胺-n1,n2-二基；n1,n3-二烷基丙烷-1,3-二胺-n1,n3-二基；1,4-二氨基蒽-9,10-二酮-1,4-二基；c6芳烃-1,4-二胺-n1,n4-二基，其中所述芳烃在2、3、5或6位被一个到四个取代基取代，并且每一取代基独立地选自由以下组成的群组：-c(o)o(c1到c6)烷基、oh、o(c1到c6)烷基、(c1到c6)烷基、cf3、f、cl和br；或被取代的哌嗪-1,4-二基，其中所述哌嗪在2、3、5或6位被一个到八个取代基取代，并且每一取代基独立地选自由以下组成的群组：(c1到c6)烷基、芳基、芳基(c1到c6)烷基、c(o)oh和c(o)o(c1到c6)烷基。
在一些化合物中，式z-y-q-y'-z'是：
其盐。在一些化合物中，选自由以下组成的群组的一对或多对的成员相同：a1和a1'、a2和a2'、a3和a3'、a4和a4'、a5和a5'、a6和a6'、r1和r1'、r2和r2'、r3和r3'以及r4和r4'。在一些化合物中，选自由以下组成的群组的一对或多对的成员不同：a1和a1'、a2和a2'、a3和a3'、a4和a4'、a5和a5'、a6和a6'、r1和r1'、r2和r2'、r3和r3'以及r4和r4'。在一些化合物中，选自由以下组成的群组的每一对的成员相同：a1和a1'、a2和a2'、a3和a3'、a4和a4'、a5和a5'、a6和a6'、r1和r1'、r2和r2'、r3和r3'以及r4和r4'。在一些化合物中，选自由以下组成的群组的每一对的成员不同：a1和a1'、a2和a2'、a3和a3'、a4和a4'、a5和a5'、a6和a6'、r1和r1'、r2和r2'、r3和r3'以及r4和r4'。
在一些化合物中，式z-y-q-y'-z'是：
其盐。
本发明的一些化合物具有以下结构：
其盐。
本发明还提供包含式a-b-c的化合物或其药学上可接受的盐或酯，
其中：
a是：
b是：
c是：
其中：
a7、a8、a9、a10、a11、a12、a13和a14各自独立地选自ch、cr18和n；
a15、a16、a17、a18、a19和a20各自独立地选自ch、cr19、n、nr20、o和s，其限制条件为a15、a16和a17中的仅一个可以是n、nr20、o或s，并且a18、a19和a20中的仅一个可以是n、nr20、o或s；
r18和r19各自独立地选自c1-c6烷基；c1-c6二烷基氨基，其中每一c1-c6烷基独立地加以选择；-nh2；烷基氨基；杂环烷基；以及被取代的杂环烷基，其中所述被取代的杂环烷基被一个到两个独立地选自由-c(o)o(c1-c6烷基)和c1-c6烷基组成的群组的取代基取代；其中在具有超过一个cr18的化合物中，每一r18独立地加以选择，并且在具有超过一个cr19的化合物中，每一r19独立地加以选择；并且
r20是c1-c6烷基。
在一些化合物中，b是：
一些化合物具有以下结构：
本发明还提供用本文所描述化合物中的任何一种或多种治疗动物中的病状的方法。所述方法包含向动物投与有效量的本文所描述化合物中的一种或多种。所述病状可以选自由以下组成的群组：传染性疾病、自身免疫性疾病、糖尿病以及慢性发炎性疾病。在一些方法中，传染性疾病包含病毒性疾病，如流感感染。在一些方法中，自身免疫性疾病包含自身免疫性发炎性疾病，如发炎性肠病，包括溃疡性结肠炎和/或克罗恩氏病(crohn'sdisease)。在一些方法中，糖尿病选自由1型糖尿病和2型糖尿病组成的群组。在一些方法中，慢性发炎性疾病包含代谢综合征。在一些方法中，所述方法包含投与一定量的有效增加lancl2活性、减少炎症和/或增加抗炎作用的化合物。
本发明还提供用于用本文所描述化合物中的任何一种或多种治疗动物中的病状的化合物。用于此类用途的化合物包括本文所描述的任何化合物。使用可以包含向动物投与有效量的本文所描述化合物中的一种或多种，其中病状选自由以下组成的群组：传染性疾病、自身免疫性疾病、糖尿病以及慢性发炎性疾病。在一些型式中，传染性疾病包含病毒性疾病，如流感感染。在一些型式中，自身免疫性疾病包含自身免疫性发炎性疾病，如发炎性肠病，包括溃疡性结肠炎和/或克罗恩氏病。在一些型式中，糖尿病选自由1型糖尿病和2型糖尿病组成的群组。在一些型式中，慢性发炎性疾病包含代谢综合征。在一些型式中，化合物有效增加lancl2活性、减少炎症和/或增加抗炎作用。
本发明的目标和优点将由以下结合附图进行的本发明优选实施例详细描述而表现得更完全。
附图说明
图1a和1b.化合物与lancl2的结合的计算性预测和使用spr的生化实验验证。
图2.nsc6160前五个集群的群集直方图(clusteringhistogram)。使用autodocktools用与lancl2对接的nsc6160执行一百次对接操作。rmsd集群容限是
图3.aba前五个集群的群集直方图。使用autodocktools用与lancl2对接的aba执行一百次对接操作。rmsd集群容限是
图4.bt-11前五个集群的群集直方图处理。使用autodocktools用与lancl2对接的bt-11执行一百次对接操作。rmsd集群容限是
图5.bt-6前五个集群的群集直方图。使用autodocktools用与lancl2对接的bt-6执行一百次对接操作。rmsd集群容限是
图6.bt-15前五个集群的群集直方图。使用autodocktools用与lancl2对接的bt-15执行一百次对接操作。rmsd集群容限是
图7.bt-aba-5a前五个集群的群集直方图。使用autodocktools用与lancl2对接的bt-aba-5a执行一百次对接操作。rmsd集群容限是
图8.羊毛硫氨酸合成酶c样蛋白质2(lancl2)与bt-11和bt-15的结合动力学。图a和c展示对变化浓度的bt-11(a)和bt-15(c)与固定化lancl2的结合的表面等离子共振(spr)传感图。图b和d展示最大共振单位(ru)对比bt-11(b)和bt-15(d)浓度的曲线图。指示利用1:1结合模型的稳态解离常数(kd)。
图9a和9b.羊毛硫氨酸合成酶c样蛋白质2(lancl2)与bt-6(图9a)和bt-aba-5a(图9b)的结合动力学。展示对变化浓度的bt-6和bt-aba-5a与固定化lancl2的结合的表面等离子共振(spr)传感图。
图10.口服投药对患有葡聚糖硫酸钠(dss)结肠炎的小鼠的疾病活动性和总病理学的作用。图a展示在仅用bt-11或媒剂处理的小鼠中的疾病活动性指数评分。图b-c展示来自在用媒剂或bt-11处理的小鼠中(b)脾脏、(c)肠系膜淋巴结(mln)和(d)结肠的总病理学评分。用星号指示统计学上显著的差异(p<0.05)(n＝10)。
图11.口服bt-11投药对患有dss结肠炎的小鼠中的结肠发炎性病变的作用。展示(a，d)对照组(b，e)dss和(c，f)经过bt-11处理的dss小鼠的代表性显微图。基于(g)白细胞浸润、(h)上皮细胞侵蚀和(i)粘膜增厚来评估组织病理学病变。用星号指示统计学上显著的差异(p<0.05)(n＝10)。
图12.口服bt-11投药对患有dss结肠炎的小鼠中的结肠发炎性病变的剂量反应作用。基于(a)白细胞浸润、(b)粘膜增厚和(c)上皮细胞侵蚀来评估组织病理学病变。用星号指示统计学上显著的差异(p<0.05)(n＝10)。
图13.tnfα、白介素10(il-10)和lancl2的结肠基因表达分析。展示结肠基因表达以评定(a)促炎性tnfα、(b)il-10和(c)lancl2的水平。用星号指示统计学上显著的差异(p<0.05)(n＝10)。
图14.经口投与bt-11对患有dss结肠炎的小鼠中的结肠促炎性和抗炎性免疫细胞子组的剂量反应作用。流式细胞测量术分析用于测量结肠粘膜中的(a)tnfa+细胞、(b)il-10+cd4+t细胞和(c)foxp3+cd4+t细胞。
图15.口服bt-11投药对患有dss结肠炎的野生型和lancl2-/-小鼠中的组织总病理学病变的作用。图a展示仅用bt-11或媒剂处理的野生型对比lancl2-/-小鼠中的疾病活动性指数评分。图b-d展示来自在用媒剂或bt-11处理的野生型和lancl2-/-小鼠中的(b)结肠、(c)肠系膜淋巴结(mln)和(d)脾脏的总病理学评分。用星号指示统计学上显著的差异(p<0.05)(n＝10)。
图16.口服bt-11投药对患有dss结肠炎的野生型和lancl2-/-小鼠中的结肠发炎性病变的作用。基于(a)白细胞浸润、(b)粘膜增厚和(c)上皮细胞侵蚀来评估组织病理学病变。用星号指示群组之间的统计学上显著的差异(p<0.05)。
图17.口服bt-11投药对浸润患有慢性结肠炎的野生型和lancl2-/-小鼠中结肠固有层、脾脏和肠系膜淋巴结(mln)的免疫细胞子组的作用。流式细胞测量术用于分析在用bt-11处理之后的(a)结肠mcp1+cd45+细胞、(b)mln中mcp1+cd45+细胞、(c)结肠tnfa+cd45+细胞、(d)结肠mhc-ii+cd11c+粒细胞、(e)结肠il-10+cd45+细胞和(f)il-10+cd45+脾细胞的水平。用星号指示群组之间的统计学上显著的差异(p<0.05)。
图18.口服bt-11投药对患有慢性结肠炎的il-10-/-小鼠中疾病活动性指数(dai)评分的作用。对发展出自发性结肠炎并且每日单独用媒剂或用每千克体重20、40和80mgbt-11处理的il-10剔除式小鼠的dai评分(n＝10)。用星号指示群组之间的统计学上显著的差异(p<0.05)。
图19.口服bt-11投药对在用bt-11处理之后的结肠炎慢性模型中宏观组织评分的作用。在用媒剂或用三种不同浓度(20、40和80mg/kg)的bt-11处理的小鼠的(a)脾脏、(b)肠系膜淋巴结(mln)和(c)结肠中的宏观评分。用星号指示群组之间的统计学上显著的差异(p<0.05)。
图20.口服bt-11投药对在ibd慢性il-10-/-模型中结肠组织病理学病变的作用。基于(a)白细胞浸润、(b)上皮细胞侵蚀和(c)粘膜增厚来评估组织病理学病变。用星号指示群组之间的统计学上显著的差异(p<0.05)。
图21.口服bt-11投药对浸润患有慢性结肠炎的il-10-/-中结肠固有层的免疫细胞子组的作用。流式细胞测量术用于分析在用bt-11处理之后的结肠lp中(a)f4/80+巨噬细胞、(b)mhc-ii+cd11c+树突状细胞(dc)、(c)cd4+foxp3+调节性t细胞和(d)t辅助1(th1)细胞的水平。用星号指示群组之间的统计学上显著的差异(p<0.05)。
图22.口服bt-11投药对浸润患有慢性结肠炎的il-10-/-中脾脏和肠系膜淋巴结的免疫细胞子组的作用。流式细胞测量术用于分析在用bt-11处理之后的(a)cd4+rorgt+t细胞、(b)cd4+foxp3+t细胞、(c)cd4+cd45+foxp3+调节性t细胞和(d)t辅助1(th1)细胞的水平。用星号指示群组之间的统计学上显著的差异(p<0.05)。
图23.用bt-11口服治疗对lancl2和tnfα结肠表达的作用。结肠基因表达用于评定(a)lancl2和(b)tnfα的水平。用星号指示群组之间的统计学上显著的差异(p<0.05)。
图24.口服bt-11投药对慢性结肠炎过继转移模型中媒剂对比经过处理的小鼠中疾病活动性指数评分的作用。在腹膜内转移400,000个未经处理的cd4+t细胞后，用媒剂或bt-11处理rag2-/-小鼠。用星号指示群组之间的统计学上显著的差异(p<0.05)。
图25.口服bt-11投药对慢性结肠炎过继转移模型中媒剂对比经过处理的野生型对比lancl2-/-转移小鼠中疾病活动性指数评分的作用。在由野生型或lancl2-/-供体腹膜内转移400,000个未经处理的cd4+t细胞后，用媒剂或bt-11处理rag2-/-小鼠。用星号指示群组之间的统计学上显著的差异(p<0.05)。
图26.口服bt-11投药对cd4+诱导结肠炎的慢性ibd模型中重量损失的作用。对小鼠进行称重并计算重量损失百分比。用星号指示群组之间的统计学上显著的差异(p<0.05)。
图27.口服bt-11投药对在用bt-11处理之后的cd4+t细胞诱导结肠炎慢性模型中宏观组织评分的作用。展示在用媒剂或80mg/kgbt-11处理的小鼠的(a)脾脏、(b)mln、(c)结肠和(d)回肠中的宏观评分。用星号指示群组之间的统计学上显著的差异(p<0.05)。
图28.口服bt-11投药对在用bt-11处理之后的使用野生型和lancl2-/-小鼠的cd4+t细胞诱导结肠炎慢性模型中宏观组织评分的作用。展示在用媒剂或80mg/kgbt-11处理的野生型和lancl2-/-小鼠的(a)脾脏、(b)mln和(c)结肠中的宏观评分。用星号指示群组之间的统计学上显著的差异(p<0.05)。
图29.口服bt-11投药对慢性结肠炎过继转移模型中媒剂对比经过处理的小鼠中结肠和回肠组织病理学的作用。基于(a，b)白细胞浸润、(c，d)上皮细胞侵蚀和(e，f)粘膜增厚来评估结肠(a，c，e)和回肠(b，d，f)中的组织病理学病变。用星号指示群组之间的统计学上显著的差异(p<0.05)。
图30.口服bt-11投药对慢性结肠炎过继转移模型中媒剂对比经过处理的用野生型或lancl2-/-cd4+t细胞转移的小鼠中结肠组织病理学的作用。基于(a)白细胞浸润、(b)粘膜增厚和(c)上皮细胞侵蚀来评估组织病理学病变。用星号指示群组之间的统计学上显著的差异(p<0.05)。
图31.口服bt-11投药对慢性结肠炎过继转移模型中媒剂对比经过处理的小鼠中疾病活动性指数评分的作用。流式细胞测量术用于分析在用bt-11处理之后的(a)f4/80+cd11b+巨噬细胞、(b)cd45+ifng+细胞、(c)cd4+foxp3+调节性t细胞和(d)cd4+il-10+抗炎性细胞的水平。用星号指示群组之间的统计学上显著的差异(p<0.05)。
图32.口服bt-11投药对慢性结肠炎过继转移模型中媒剂对比经过处理的小鼠中疾病活动性指数评分的作用。流式细胞测量术用于分析在用bt-11处理之后的mln中(a)cd4+foxp3+t细胞、(b)cd4+il-10+t细胞、(c)cd45+ifng+细胞和脾脏中(d)cd4+foxp3+t细胞、(e)cd4+il-10+t细胞、(f)cd45+ifng+细胞的水平。用星号指示群组之间的统计学上显著的差异(p<0.05)。
图33.口服bt-11投药对慢性结肠炎过继转移模型中媒剂对比经过处理的野生型对比pparγ-/-转移小鼠中疾病活动性指数评分的作用。在由野生型或pparγ-/-供体腹膜内转移400,000个未经处理的cd4+t细胞后，用媒剂或bt-11处理rag2-/-小鼠。(a)展示疾病活动性指数评分对比转移后时间。基于(b)白细胞浸润、(c)粘膜增厚和(d)上皮细胞侵蚀来评估结肠中的组织病理学病变。用星号指示群组之间的统计学上显著的差异(p<0.05)。
图34.口服bt-11投药对患有糖尿病的nod小鼠中空腹血液葡萄糖和胰岛素水平的作用。(a)在用媒剂或bt-11(80mg/kg/d)处理第0、1、3、4、5、10和11周时评定空腹葡萄糖水平。(b)在用媒剂或bt-11(80mg/kg/d)处理第5周时评定空腹血清胰岛素水平。用星号指示统计学上显著的差异(p<0.05)(n＝10)。
图35.口服bt-11投药在1型糖尿病小鼠胰脏中病变形成中的作用。基于白细胞浸润、病变形成和组织侵蚀来评估组织病理学病变。用星号指示群组之间的统计学上显著的差异(p<0.05)。
图36.口服bt-11投药对(a)空腹血液葡萄糖水平和(b)葡萄糖耐量测试的作用。(a)在实验设置之后第2和12周，使小鼠禁食12h并且评定血液葡萄糖水平。(b)还用ip葡萄糖注射(2g/kg)攻击小鼠，并且测量葡萄糖。用星号指示统计学上显著的差异(p<0.05)。
图37.口服bt-11投药对促炎性群体向白色脂肪组织(wat)中的浸润的作用。切除wat并加以消化，并且通过流式细胞测量术来评定免疫表型结果。展示(a)浸润性巨噬细胞和(b)ly6c高gr1+浸润性细胞的水平。用星号指示统计学上显著的差异(p<0.05)。
图38.口服bt-11投药对糖尿病db/db模型中葡萄糖稳态的作用。(a)展示在实验设置之后第1和3周时，来自用bt-11或媒剂处理的瘦素受体缺陷型(db/db)小鼠的空腹血液葡萄糖(fbg)浓度。(b)展示在腹膜内葡萄糖攻击(每千克体重1g)之后的血浆葡萄糖水平。在葡萄糖负荷之前(0)，接着在葡萄糖负荷之后15、30、60、90、120、180、220和265分钟时收集血液。用星号指示群组之间的统计学上显著的差异(p<0.05)。
图39.口服bt-11投药对来自患有膳食诱导肥胖的小鼠的白色脂肪组织(wat)中lancl2、tnfα和mcp-1表达的作用。与未处理的小鼠相比，评估lancl2、tnfα和mcp-1的基因表达分析。零处线表示仅接受媒剂的小鼠的基线。
图40.口服bt-11投药对感染有流感病毒的小鼠的临床评分和发病率的作用。小鼠感染有流感病毒，并且在整个实验中进行临床评分。对(a)活动性和(b)身体外观标注临床评分。(c)绘制损失超过15％体重的小鼠的百分比以展示发病率变化。用星号指示群组之间的统计学上显著的差异(p<0.05)。
具体实施方式
一般定义
除非另外陈述，否则在本申请通篇中使用以下定义：
方差分析(anova)：用于将资料集整体变化基于变化来源而分割成特定分量的算术方法。其已经用于确定处理组之间的数值差异是否是统计学上显著的。
脂肪生成：产生新脂肪细胞或脂肪存储细胞的过程。
等位基因：相同基因中多个可行dna编码中的一个。
共轭二烯：含有由一个单键分隔的两个双键的分子。
db/db小鼠：用于定义小鼠类型的术语，所述小鼠缺乏瘦素受体长同功异型物的全部两个等位基因。此不足引起发展出2型糖尿病的高倾向性。对db/db小鼠的进一步讨论参见下文实例。
对映异构体：光学异构体；分子基于其顺时针(+)或逆时针(-)旋转偏光平面的能力的化学分类。
血糖：血液中葡萄糖的浓度。
高血糖症：血液中葡萄糖的浓度增加超出正常范围。
高胰岛素血症：血液中胰岛素的浓度增加超出正常范围。
血胰岛素：血液中胰岛素的浓度。
胰岛素抵抗：组织不能对胰岛素有反应和吸收来自血液的葡萄糖。
基本上纯：纯度为至少90重量％，优选地至少95重量％，如至少98重量％、99重量％或约100重量％。
2型糖尿病或非胰岛素依赖型糖尿病：指代由于细胞对胰岛素作用无反应而造成的常见糖尿病类型的术语。如果细胞对胰岛素无反应，则其不能吸收来自血液的葡萄糖，其引起血糖毒性(glucotoxicity)。另外，细胞缺乏来源于葡萄糖氧化的能量。
ibd：发炎性肠病(ibd)涉及你消化道的全部或部分中的慢性炎症。ibd主要包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病。两者通常都涉及严重腹泻、疼痛、疲乏和重量损失。ibd可能引起衰弱，并且有时导致危及生命的并发症。
溃疡性结肠炎(uc)：uc是在你大肠(结肠)和直肠中的最内衬层中引起持久炎症和疮(溃疡)的ibd。
克罗恩氏病：克罗恩氏病是引起你消化道衬层的炎症的ibd。在克罗恩氏病中，炎症常常扩散到受影响组织中的深处。炎症可能涉及消化道的不同区域，大肠、小肠或两者。
il-10：白介素-10(il-10)(也称为人类细胞因子合成抑制因子(csif))其是抗炎性细胞因子。在人类中，il-10由il10基因编码。
foxp3：foxp3(叉头框p3)(也称为scurfin)是参与免疫系统反应的蛋白质。fox蛋白质家族的成员，foxp3似乎在调节性t细胞的发育和功能中充当母调节子(转录因子)。
tnf-α：肿瘤坏死因子(tnf，恶病质(cachexin)或恶病质素(cachectin)，并且以前称为肿瘤坏死因子α或tnfα)是参与全身性炎症的细胞因子，并且是刺激急性期反应得细胞因子群组的成员。
mcp1：单核细胞趋化蛋白-1。cc细胞因子的早期术语，其对动脉粥样硬化病变发展是关键的，见于进行冠状动脉旁路程序的患者的内皮细胞、巨噬细胞和血管平滑肌细胞中。官方优选的术语现在是趋化因子(chemokine)(c-c基元)配位体2。
干扰素γ：干扰素γ是促炎性二聚可溶性细胞因子，其是ii型类别干扰素仅有的成员。
1型糖尿病：1型糖尿病(曾称为幼年期糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病)是其中胰脏产生极少或不产生胰岛素的慢性病状，所述胰岛素是允许糖(葡萄糖)进入细胞以产生能量所需的激素。
白细胞浸润：白细胞浸润是指使白细胞移动或浸润到受伤组织中以开始修复过程的过程。
化学定义
除非另外陈述，否则术语“烷基”单独或作为另一取代基的一部分意味着具有所指定碳原子数目的完全饱和的直链、分支链或环状烃基或其组合(例如，c1-c10意味着一个到十个碳原子，包括端点)，并且可以包括二价和多价基团。烷基的实例包括(但不限于)甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)乙基、环丙基甲基以及其同系物和异构体，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等。除非另外指出，否则术语“烷基”还包括下文更详细定义为“杂烷基”和“环烷基”的那些烷基衍生物。
术语“烯基”意味着除了其含有一个或多个双键之外如上文所定义的烷基。烯基的实例包括乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)等，以及高碳数同系物和异构体。
术语“炔基”意味着除了其含有一个或多个三键之外如上文所定义的烷基或烯基。炔基的实例包括乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基等，包括高碳数同系物和异构体。
术语“亚烷基”、“亚烯基”和“亚炔基”单独或作为另一取代基的一部分意味着分别衍生自烷基、烯基或炔基的二价基团，如由-ch2ch2ch2ch2-所例示。
通常，烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基和亚炔基将具有1到24个碳原子。具有10个或更少碳原子的那些基团在本发明中是优选的。术语“低碳数”当应用于这些基团中的任一个时，如在“低碳数烷基”或“低碳数亚烷基”中，标示具有10个或更少碳原子的基团。
“被取代”是指如本文所描述的化学基团进一步包括一个或多个取代基，如低碳数烷基、芳基、酰基、卤素(例如，烷基卤基，如cf3)、羟基、氨基、烷氧基、烷基氨基、酰胺基、硫基酰胺基、酰氧基、芳氧基、芳氧基烷基、巯基、硫杂、氮杂、氧代、饱和和不饱和环状烃、杂环等。这些基团可以附接到烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基和亚炔基部分的任何碳或取代基上。另外，这些基团可以侧接自或整合到碳链自身。
术语“芳基”在本文中用于指芳香族取代基，其可以是单个芳香族环或稠合在一起、共价连接或连接于共同基团(如重氮基、亚甲基或亚乙基部分)的多个芳香族环。共同连接基团还可以是羰基，如在二苯甲酮中。芳香族环可以尤其包括例如苯基、萘基、联二苯、二苯甲基和二苯甲酮。术语“芳基”涵盖“芳基烷基”和“被取代的芳基”。对于苯基，芳基环可以是单、二、三、四或五取代的。更大环可以是未被取代的或带有一个或多个取代基。
“被取代的芳基”是指包括一个或多个官能团的如刚才所描述的芳基，所述官能团如低碳数烷基、酰基、卤素、烷基卤基(例如cf3)、羟基、氨基、烷氧基、烷基氨基、酰胺基、酰氧基、苯氧基、巯基以及稠合于芳香族环、共价连接或连接于共同基团(如重氮基、亚甲基或亚乙基部分)的饱和和不饱和环状烃。连接基团还可以是羰基，如在环己基苯基酮中。术语“被取代的芳基”涵盖“被取代的芳基烷基”。
术语“卤素”或“卤基”在本文中用于指氟、溴、氯和碘原子。
术语“羟基”在本文中用于指基团-oh。
术语“氨基”用于指代nrr'，其中r和r'独立地是h、烷基、烯基、炔基、芳基或其被取代的类似物。“氨基”涵盖标示仲胺和叔胺的“烷基氨基”以及描述基团rc(o)nr'的“酰胺基”。
投药
在本发明方法的历程中，可以多种方式向动物(包括哺乳动物和人类)投与治疗有效量的本发明化合物。虽然在优选实施例中，经口或非经肠投与本发明化合物，但也涵盖其它投药形式，如经由医学化合物或气雾剂。
对于口服投药，可以例如固体、半固体、液体或气体状态投与有效量的化合物。具体实例包括片剂、胶囊、粉末、颗粒、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂药剂。然而，化合物不限于这些形式。
为了将本发明化合物调配成片剂、胶囊、粉末、颗粒、溶液或悬浮液，优选地将所述化合物与粘合剂、崩解剂和/或润滑剂混合。视需要，可以使用已知方法将所得组合物与稀释剂、缓冲剂、浸润剂、防腐剂和/或调味剂混合。粘合剂的实例包括结晶纤维素、纤维素衍生物、玉米淀粉、环糊精和明胶。崩解剂的实例包括玉米淀粉、马铃薯淀粉和羧甲基纤维素钠。润滑剂的实例包括滑石和硬脂酸镁。此外，也可以使用已经常规使用的添加剂，如乳糖和甘露糖醇。
对于非经肠投药，可以经直肠或通过注射投与本发明化合物。对于经直肠投药，可以使用栓剂。栓剂可以通过将本发明化合物与药学上合适的赋形剂混合来制备，所述赋形剂在体温下熔融但在室温下保持固体。实例包括(但不限于)可可油、碳蜡和聚乙二醇。可以使用领域中已知的方法将所得组合物模制成任何所需形式。
对于通过注射投药，可以皮下、皮内、静脉内或肌肉内注射本发明化合物。用于此类注射的医用药物可以通过用已知方法使本发明化合物溶解、悬浮或乳化于水性或非水性溶剂(如植物油、合成树脂酸甘油酯、高级脂肪酸酯或丙二醇)中来制备。必要时，还可以添加已经常规使用的添加剂，如增溶剂、渗透压调节剂、乳化剂、稳定剂或防腐剂。虽然不要求，但优选的是组合物为无菌的或经过灭菌。
为了将本发明化合物调配成悬浮液、糖浆或酏剂，可以使用药学上合适的溶剂。在这些溶剂当中包括非限制性实例水。
本发明化合物还可以与具有其它药学上合适活性的其它化合物一起用以制备医用药物。含有本发明化合物作为单独化合物或作为组合物一部分的药物可以用于治疗有需要的个体。
本发明化合物还可以气雾剂或吸入剂形式投与，所述气雾剂或吸入剂通过将呈液体或精细粉末形式的化合物与气态或液体喷雾剂和(视需要)已知助剂(如膨胀剂)一起装入非加压容器(如气雾剂容器或雾化器)中来制备。例如二氯氟甲烷、丙烷或氮气的加压气体可以用作喷雾剂。
本发明化合物可以药学组合物(如片剂、胶囊、溶液或乳液)形式向有需要的动物(包括哺乳动物和人类)投与。本发明还涵盖以单剂量或多剂量投与本发明中所描述化合物的其它形式，包括(但不限于)其酯、其药学上合适的盐、其代谢物、其结构上相关化合物、其类似物以及其组合。
本发明化合物还可以营养添加剂(食品或营养药剂补充剂)的形式向有需要的动物投与。
本文所用的术语“预防”、“治疗”或“改善”和类似术语包括预防和完全或部分治疗。所述术语还可以包括减少症状、改善症状、降低症状严重性、减少疾病发生率或改善治疗结果的任何其它患者病状变化。
本发明中所描述的化合物优选地以组合物形式加以使用和/或投与。合适的组合物优选地是药学组合物、食物或食品补充剂。这些组合物提供递送化合物的便利形式。本发明的组合物可以有效增加化合物关于氧化的稳定性或可溶性的量包含抗氧化剂。
在本发明方法中投与或用于在本发明使用中投与的化合物的量是任何合适的量。其优选地是每天约0.0001g到约20g(更优选地0.01g到1g，如0.05g到0.5g)化合物。可以相应地调配合适的组合物。生物活性药剂给药领域的技术人员将能够基于已知和充分理解的参数研发出用于各种个体的特定给药方案。
根据本发明的优选组合物是药学组合物，如呈片剂、丸剂、胶囊、囊片、多颗粒物(包括颗粒、珠粒、球粒和微囊封粒子)、粉末、酏剂、糖浆、悬浮液和溶液形式。药学组合物将通常包含药学上可接受的稀释剂或载剂。药学组合物优选地适宜于非经肠或经口投与。可口服的组合物可以呈固体或液体形式，并且可以尤其采取片剂、粉末、悬浮液和糖浆的形式。任选地，组合物包含一种或多种调味剂和/或着色剂。一般来说，治疗和营养组合物可以包含不显著干扰化合物对个体作用的任何物质。
适合用于此类组合物中的药学上可接受的载剂是药学领域中众所周知的。本发明的组合物可以含有0.01-99重量％的本发明化合物。本发明的组合物一般以单位剂型制备。优选地，本发明中所描述化合物的单位剂量是1mg到1000mg(更优选地50mg到500mg)。在制备这些组合物中所用的赋形剂是本领域中已知的赋形剂。
用于组合物的产物形式的其它实例是食品补充品，如呈包含囊封材料的软凝胶或硬胶囊形式，所述囊封材料选自由以下组成的群组：明胶、淀粉、改性淀粉、淀粉衍生物，如葡萄糖、蔗糖、乳糖和果糖。囊封材料可以任选地含有交联剂或聚合剂、稳定剂、抗氧化剂、用于保护光敏填充物的光吸收剂、防腐剂等。优选地，食品补充品中化合物的单位剂量是1mg到1000mg(更优选地50mg到500mg)。
一般来说，术语载剂可以在本申请通篇中用于表示可以与所描述的化合物混合的组合物，不论其是药物载剂、食物、营养补充剂或膳食辅剂。出于本发明的目的，上文所描述的材料可以视为载剂。在本发明的某些实施例中，载剂对本发明化合物具有极少到不具有生物活性。
剂量：本发明的方法可以包含向有需要的动物投与治疗有效量的化合物。化合物的有效量取决于所投与化合物的形式、投药时长、投药途径(例如经口或非经肠)、动物年龄以及动物条件，所述动物包括哺乳动物和人类。
举例来说，在动物中有效治疗或预防2型糖尿病、前驱糖尿病、1型糖尿病、葡萄糖耐量异常、胰岛素抵抗、溃疡性结肠炎或克罗恩氏病或本文所描述的任何其它病状的化合物量可以在每天0.1-10,000mg/kg范围内变化。化合物的优选有效量是每天1到5,000mg/kg，并且更优选的剂量为每天2到100mg/kg。由于如我们的毒理学数据所展现，化合物相对无毒性，故待投与的有效量的上限并非关键的。当向动物投与持续介于约7到100天范围内的时段(并且优选的时段为15到50天，并且最优选的时段为30到42天)时，有效量的化合物在治疗或预防动物溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、2型糖尿病、1型糖尿病、前驱糖尿病、代谢综合征、葡萄糖耐量异常和胰岛素抵抗中最有效。
在预防免疫系统过度活化中最有效的化合物量可以在每天0.1到500mg/kg范围内变化，并且优选的剂量为每天1到150mg/kg。
当以营养、治疗、医学或兽医学组合物形式投与有效量的本发明化合物时，优选的剂量在相对于食品或营养药剂产品约0.01％到2.0％wt/wt范围内变化。
在某些其它实施例中，本发明提供lancl2结合性化合物以及结构上相关化合物的用途，所述结构上相关化合物如选自其酯、其药学上合适的盐、其代谢物、其结构上相关化合物或其组合组成的群组的化合物，所述化合物用于治疗和预防ibd和胃肠道炎症。
另外，一般来说，本发明涉及抑制胃肠道中的炎症，其中相关组件包括胃、小肠、大肠和直肠。由使化合物暴露于身体中诱导生物学效应的各种细胞类型来产生作用。细胞可以包括来自胃肠道组织的那些细胞、免疫细胞(即巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞)或上皮细胞。在某些实施例中，本发明提供用本发明化合物(例如以膳食补充剂形式)治疗个体以减少或预防与发炎性肠病(克罗恩氏病或溃疡性结肠炎)相关的炎症。本发明还涵盖向胃肠道投与本发明化合物以便抑制肠道中细胞粘附分子的表达。
当实践时，本发明的方法可以借助于如上文所描述经由任何可接受投药途径使用任何可接受形式向个体投与化合物，并且允许个体身体经由自然过程将所述化合物分配到目标细胞。如上文所描述，投与可以同样通过直接注射到含有目标细胞(即，待治疗的细胞)的位点(例如器官、组织)来进行。
此外，投与可以遵循任何数目的方案。因此，其可以包含单剂量或单次给药实验化合物，或历经一定时间段多剂量或多次给药。因此，治疗可以包含重复投与步骤一次或多次，直到实现所结果为止。在某些实施例中，治疗可以持续很长一段时间，如数周、数月或数年。本领域的技术人员完全能够容易地基于本领域中已知的参数研发出用于个体的合适给药方案。本发明化合物的剂量可以用于本发明这些实施例的方法中。对于治疗ibd、胃肠道炎症或遏制肠道中细胞粘附分子的表达，优选的是化合物以约1毫克/天到9,000毫克/天的量投与。
待投与的量将取决于个体、疾病或病症分期、个体年龄、个体一般健康状况以及医学领域的技术人员已知并常规考虑的各种其它参数而变化。作为一般情况，将投与足够量的化合物以便产生胃肠道炎症量的可检测变化，所述炎症量在ibd的情况下常常与个体所经历的疼痛量相关。在患者目前未经历ibd症状得情况下，可以寻找的变化可以涉及免疫细胞参数，如免疫细胞上的tnfα表达或血液中调节性t细胞的百分比。本文公开合适的量，并且其它合适的量可以由本领域的技术人员基于本文所公开的量在无不当或过量实验的情况下鉴别。
在一个方面中，本发明提供一种治疗或预防罹患ibd的个体或在其它方面健康但可能具有克罗恩氏病或溃疡性结肠炎遗传倾向性的个体发展出ibd的方法。所述方法还可以涉及治疗患有缓解形式ibd的那些个体。根据本发明，术语“罹患ibd的个体”用于意味着患有展示一种或多种ibd典型临床征象的疾病或病症的个体(例如动物、人类)。一般来说，根据本发明此方面治疗或预防的方法包含向个体投与有效治疗或预防一种或多种ibd症状或临床表现或有效预防此类症状或表现发展的量的化合物疗法。
因此，根据本发明的方法，本发明可以提供治疗ibd、与肠感染相关联的炎症和与自身免疫性疾病相关联的炎症的方法。治疗方法可以预防方法。在某些实施例中，所述方法是治疗ibd、与肠感染相关联的炎症和与自身免疫性疾病相关联的炎症的方法。在其它实施例中，所述方法是预防ibd的方法。在实施例中，所述方法是预防缓解形式的ibd变得活化的方法。在再其它实施例中，所述方法是改善罹患ibd、与肠感染相关联的炎症和与自身免疫性疾病相关联的炎症的个体健康状况的方法。造成胃肠感染的生物体包括(但不限于)：大肠杆菌(escherichiacoli)、志贺杆菌属(shigella)、沙门氏菌属(salmonella)、病原性弧菌属(vibrios)、空肠弯曲杆菌(campylobacterjejuni)、小肠结肠炎耶尔森菌(enterocoliticayersina)、刚地弓形虫(toxoplasmagondii)、溶组织内阿米巴(entamoebahistolytica)和蓝氏贾第鞭毛虫(giardialamblia)。因此，在某些实施例中，本发明提供一种保护罹患ibd、与肠感染相关联的炎症和与自身免疫性疾病相关联的炎症或具有发展出ibd、与肠感染相关联的炎症和与自身免疫性疾病相关联的炎症的个体的健康状况、器官和/或组织的方法。
在本发明的一个实施例中，治疗ibd的方法包含在不造成可辨别副作用的情况下治疗ibd，所述副作用如目前可获得的ibd治疗(即皮质类固醇、肿瘤坏死因子α抑制剂)常见的显著重量增加、全身性免疫抑制、类库欣氏症(cushingoid)外观、骨质减少/骨质疏松或胰脏炎。也就是说，已经发现与不接受所述治疗的其它类似个体相比，根据本发明治疗的方法(其至少部分地通过影响lancl2在一些细胞中的表达和/或活化来提供治疗作用)提供有益作用而不在所治疗的个体中造成显著重量增加(例如通过液体潴留)。
因而，本发明的方法可以提供减少炎症的方法。所述方法可以全身性地(即，在整个个体身体中)或局部地(例如，在投药位点或发炎性细胞位点处，包括(但不限于)t细胞和巨噬细胞处)减少炎症。在根据本发明的方法治疗或预防炎症中，可以发现的一种作用是浸润肠的血液单核细胞或巨噬细胞和淋巴细胞的数目减少。另一种作用可以是调节性免疫细胞群体(如cd4+cd25+foxp3+调节性t细胞)增加，或淋巴细胞或巨噬细胞的调节特性增加(例如增加的白介素4(il-4)或il-10或减少的tnf-α和il-6)。另一种作用可以是减少发炎性基因和/或粘附分子的存在。因此，所述方法还可以被视为影响或改变化合物疗法所投与个体的免疫反应的方法。个体可能患有发炎性肠病或其中t细胞的免疫调节或细胞粘附分子的下调为所需结果的另一种病状。
本发明还提供用本文所描述的化合物治疗传染性疾病的方法。此类传染性疾病的非限制性实例包括病毒感染、细菌感染和真菌感染。
病毒感染的非限制性实例包括由尤其以下病毒感染：腺病毒科(adenoviridae)病毒，如腺病毒；疱疹病毒科(herpesviridae)病毒，如1型单纯性疱疹、2型单纯性疱疹、水痘-带状疱疹病毒、艾伯斯坦-巴尔病毒(epstein-barrvirus)、人类巨细胞病毒、人类疱疹病毒和8型；乳头状瘤病毒科(papillomaviridae)病毒，如人类乳突状瘤病毒；多瘤病毒科(polyomaviridae)病毒，如bk病毒和jc病毒；痘病毒科(poxviridae)病毒，如天花；嗜肝dna病毒科(hepadnaviridae)病毒，如b型肝炎病毒；细小病毒科(parvoviridae)病毒，如人类博卡病毒和细小病毒b19；星状病毒科(astroviridae)病毒，如人类星状病毒；杯状病毒科(caliciviridae)病毒，如诺沃克病毒(norwalkvirus)；小rna病毒科(picornaviridae)病毒，如柯萨奇病毒(coxsackievirus)、a型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒和鼻病毒；冠状病毒科(coronaviridae)病毒，如急性呼吸道综合征病毒；黄病毒科(flaviviridae)病毒，如c型肝炎病毒、黄热病病毒、登革热病毒和西尼罗病毒；披膜病毒科(togaviridae)病毒，如风疹病毒；肝炎病毒科(hepeviridae)病毒，如肝炎e病毒；逆转录病毒科(retroviridae)病毒，如人类免疫缺陷病毒(hiv)；正粘病毒科(orthomyxoviridae)病毒，如流感病毒；沙粒病毒科(arenaviridae)病毒，如瓜纳里托病毒(guanaritovirus)、胡宁病毒(juninvirus)、拉沙热病毒(lassavirus)、马丘波病毒(machupovirus)和萨比亚病毒(sabiávirus)；布尼亚病毒科(bunyaviridae)病毒，如克里米亚-刚果出血热病毒(crimean-congohemorrhagicfevervirus)；丝状病毒科(filoviridae)病毒，如埃博拉病毒(ebolavirus)和马堡病毒(marburgvirus)；副粘病毒科(paramyxoviridae)病毒，如麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞体病毒、人类间质性肺炎病毒、亨德拉病毒(hendravirus)和尼帕病毒(nipahvirus)；弹状病毒科(rhabdoviridae)病毒，如狂犬病病毒；未分配的病毒，如d型肝炎病毒；以及呼肠孤病毒科(reoviridae)病毒，如轮状病毒、环状病毒、科罗拉多蜱传热症病毒(coltivirus)和版纳病毒(bannavirus)。
细菌感染的非限制性实例包括由除以下细菌以外还由上文所描述的细菌感染：炭疽芽孢杆菌(bacillusanthracis)、蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)、百日咳博德特菌(bordetellapertussis)、伯氏疏螺旋体(borreliaburgdorferi)、牛布鲁氏菌(brucellaabortus)、犬布鲁氏菌(brucellacanis)、羊布鲁氏菌(brucellamelitensis)、猪布鲁氏菌(brucellasuis)、空肠弯曲杆菌(campylobacterjejuni)、肺炎衣原体(chlamydiapneumoniae)、沙眼衣原体(chlamydiatrachomatis)、鹦鹉热嗜衣体(chlamydophilapsittaci)、肉毒芽孢梭菌(clostridiumbotulinum)、艰难芽孢梭菌(clostridiumdifficile)、产气荚膜芽胞梭菌(clostridiumperfringens)、破伤风芽孢梭菌(clostridiumtetani)、白喉杆菌(corynebacteriumdiphtheriae)、粪肠球菌(enterococcusfaecalis)、屎肠球菌(enterococcusfaecium)、大肠杆菌、土拉弗朗西斯菌(francisellatularensis)、流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenzae)、幽门螺旋杆菌(helicobacterpylori)、嗜肺性军团杆菌(legionellapneumophila)、钩端螺旋体(leptospirainterrogans)、单核球增多性李斯特菌(listeriamonocytogenes)、麻风分枝杆菌(mycobacteriumleprae)、结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)、溃疡分枝杆菌(mycobacteriumulcerans)、肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae)、淋病奈瑟氏菌(neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(neisseriameningitidis)、绿脓假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)、立氏立克次体(rickettsiarickettsii)、伤寒沙门氏菌(salmonellatyphi)、伤寒沙门氏菌(salmonellatyphi)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)、索氏志贺杆菌(sonneishigella)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermidis)、腐生葡萄球菌(staphylococcussaprophyticus)、无乳链球菌(streptococcusagalactiae)、肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)、酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)、梅毒螺旋体(treponemapallidum)、霍乱弧菌(vibriocholerae)、鼠疫耶尔森菌(yersiniapestis)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(yersiniaenterocolitica)、假结核病耶尔森氏菌(yersiniapseudotuberculosis)以及来自上文所提及生物体的属的其它物种。
真菌感染的非限制性实例包括用以下真菌感染：曲霉属(aspergillus)真菌，如烟曲菌(aspergillusfumigatus)，其引起曲霉病；芽生菌属(blastomyces)真菌，如皮炎芽生菌(blastomycesdermatitidis)，其引起芽生菌病；念珠菌属(candida)真菌，如白色念珠菌(candidaalbicans)，其引起念珠菌病；球霉菌属(coccidioides)真菌，其引起球霉菌病(河谷热)；隐球菌属(cryptococcus)真菌，如新型隐球菌(cryptococcusneoformans)和加特隐球菌(cryptococcusgattii)，其引起隐球菌病；皮肤癣菌(dermatophytes)真菌，其引起癣；引起真菌性角膜炎的真菌，如镰孢菌(fusariumspecies)、曲霉(aspergillusspecies)和念珠菌(candidaspecies)；组织浆菌属(histoplasma)真菌，如荚膜组织浆菌(histoplasmacapsulatum)，其引起组织浆菌病；毛霉目(mucorales)真菌，其引起毛霉病；酵母菌属(saccharomyces)真菌，如酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)；肺囊虫属(pneumocystis)真菌，如耶氏肺囊虫(pneumocystisjirovecii)，其引起肺囊虫肺炎；以及孢子丝菌属(sporothrix)真菌，如申克孢子丝菌(sporothrixschenckii)，其引起孢子丝菌病。
本发明还提供用本文所描述的化合物治疗自身免疫性发炎性疾病的方法。自身免疫性发炎性疾病的非限制性实例尤其包括发炎性肠病(ibd)、全身性狼疮、类风湿性关节炎、1型糖尿病、牛皮癣和多发性硬化症。
本发明还提供用本文所描述的化合物治疗慢性发炎性疾病的方法。慢性发炎性疾病的非限制性实例尤其包括代谢综合征、肥胖、前驱糖尿病、心血管疾病和2型糖尿病。
本发明还提供用本文所描述的化合物治疗糖尿病的方法，所述糖尿病包括1型糖尿病、2型糖尿病和其它类型的糖尿病。术语“糖尿病(diabetes/diabetesmellitus)”用于涵盖个体具有高血糖(即，高血糖症)的代谢病症。高血糖病状具有各种致病源，如胰脏不产生足够胰岛素，或细胞对所产生的胰岛素无反应。存在若干种公认的糖尿病亚型。1型糖尿病的特征在于身体完全不能产生胰岛素或身体不能产生足够胰岛素。2型糖尿病一般由胰岛素抵抗产生，其为细胞不能正确使用胰岛素的病状。2型糖尿病有时与胰岛素不足共呈现。当先前未诊断有糖尿病的孕妇发展出高血糖症时，出现妊娠期糖尿病。更不常见的糖尿病形式包括先天性糖尿病(归因于与胰岛素分泌相关的遗传缺陷)、囊肿性纤维化相关糖尿病、由高剂量糖皮质激素诱导的类固醇糖尿病以及若干单基因性糖尿病形式(包括幼体的成熟期发作糖尿病)。单基因性糖尿病涵盖由单一常染色体显性基因中的突变造成的若干遗传性糖尿病形式(与导致高血糖症的更复杂的多基因性致病源对照)。
鉴于上文方法，应显而易见的是，本发明提供lancl2结合性化合物疗法以用于接触细胞，如处理个体细胞。上文的讨论集中于本发明化合物的用途，其作为组合物的一部分用于一般可被视为药学或医学环境的情况。
如上文更详细描述的，本发明中所描述的用于治疗ibd、胃肠道炎症和所描述其它病状的化合物可以调配为药学、营养组合物、功能性食品组合物或膳食辅剂。
不论是否明确描述，本文所描述的要素和方法步骤可以任何组合使用。
除非由进行所提及组合的上下文另外指定或明确暗示相反，否则如本文所用的所有方法步骤组合可以以任何次序执行。
如本文所用，除非内容另外明确指示，否则单数形式“一(a/an)”和“所述(the)”包括多个参考物。
不论是否具体公开，如本文所用的数值范围打算包括含于该范围内的每一数目和数目子集。此外，这些数值范围应解释成为对该范围中任何数目或数目子集的权利要求提供支持。举例来说，1到10的公开内容应解释为支持2到8、3到7、5到6、1到9、3.6到4.6、3.5到9.9等等的范围。
本文所引用的所有专利、专利公开和同行审查的公开(即，“参考文献”)通过引用明确地并入，其程度如同每一个别参考文献具体并个别地指示为通过引用并入一样。在本发明与所并入参考文献冲突情况下，以本发明为准。
应理解，本发明不限制于本文所展示和描述的各部分的特定构造和排列，但涵盖其落入权利要求范围内的此类修改形式。
分子模型化实例
实例1：lancl2配位体结合的分子模型化
介绍
确立的lancl2促效剂，如脱落酸(aba)和nsc61610在介于从ibd到糖尿病和流感范围内的广泛范围疾病模型中发挥抗炎活性。lancl2作为新颖治疗标靶的价值值得努力发现和研发用于治疗慢性代谢、免疫介导和传染性疾病的新类别口服活性药物。如在本实例中所讨论，经由反复地组合计算模型化与实验验证的合理药物设计来研发其它lancl2促效剂。本实例展示增加合理药物设计和医药化学工作以增加可溶性、增加与lancl2的结合、降低成本并理解lancl2蛋白质自身的方法。
方法
lancl2结构。lancl2的晶体结构不存在。因此，为了理解lancl2的结构和功能，使用lancl1晶体结构作为模板执行对人类lancl2的同源性模型化。评定模型品质，并且经由能量最小化程序来进行改进。同源性模型化经由相对于蛋白质家族中已经以实验方式解决结构的其它成员鉴别其同源蛋白质来预测蛋白质的3d结构[52]。当蛋白质具有大于35％序列一致性时，其很可能是同源的。lancl1与lancl2共用54％序列一致性[15]。
化合物产生和配位体结构。产生lancl2促效剂结构(图1a和1b)。使用nih线上smiles变换器和转换器(nih'sonlinesmilestranslatorandconverter)产生这些促效剂的smiles[53]。同时，产生并下载个别结构的.pdb文件。使用autodocktools将pdb文件转换成虚拟筛选必要的.pdbqt。
虚拟筛选。用autodocktools执行所产生衍生物文件的对接。界定搜索空间，包括栅格方块中心以及x、y和z维度。对接应用于全蛋白标靶，并且栅格覆盖全部蛋白质表面。栅格是普通立方体(
分析虚拟筛选结果。寻找使用autodockvina将每一化合物组装到lancl2中的最佳方式得到对接记录文件，其含有对接记录，包括所有化合物的每一预测结合模式的结合能。结合能表示总分子间能量、总内部能量和扭转自由能的总和减去未结合系统的能量。通过能量最大负值对化合物进行定级。第一集群中的最低结合能位姿被视为最有利对接位姿。较低结合自由能指示较稳定的蛋白质-配位体系统和在蛋白质与配位体之间的较高亲和力。通过使用人类疾病的小鼠模型进行体外测试和临床前研究来进一步验证示例性化合物。
结果
nsc61610对接概述。在图2中给出nsc61610中具有最低能量位置能量的前五个集群的直方图。nsc61610对‘中央裂隙(centralcleft)’具有极高亲和力。代表总操作7％的前两个集群各自针对此位点。归因于两埃(angstrom)容限，其它集群很可能针对此位点。接下来两个集群针对接近蓝色无规卷曲的‘变构位点(allostericsite)’。
aba对接概述。在图3中给出aba中具有最低能量位置能量的前五个集群的直方图。aba对淡绿色螺旋和淡绿色无规卷曲之间的‘变构’位点具有中度亲和力但极高特异性。29％的操作针对此最前集群。第二集群也针对此位点。归因于两埃容限，其它集群很可能针对此位点。第四集群似乎处于‘中央裂隙’中。这使aba真正治疗位点的问题仍需解答。
bt-11对接概述。在图4中给出bt-11中具有最低能量位置能量的前五个集群的直方图。bt-11的前两个集群针对‘中央裂隙’，但仅代表2％的操作。然而，归因于两埃容限，其它集群很可能针对此位点。bt-11对此位点的亲和力比nsc61610略小但大于aba。bt-11已经展现治疗效果(参见下文实例)。
bt-6对接概述。在图5中给出bt-6中具有最低能量位置能量的前五个集群的直方图。bt-6在所对接任何化合物中具有最高亲和力。前两个，可能前三个集群针对‘中央裂隙’。归因于两埃容限，其它集群很可能针对此位点。集群4针对沿着蓝色无规卷曲的‘变构’位点。
bt-15对接概述。在图6中给出bt-15中具有最低能量位置能量的前五个集群的直方图。bt-15不具有nsc61610或bt-11的结合亲和力。虽然其的确似乎针对‘中央裂隙’，但此作用似乎不如nsc61610或bt-11明显。
bt-aba-5a对接概述。在图7中给出bt-aba-5a中具有最低能量位置能量的前五个集群的直方图。bt-aba-5a的最高亲和力处于未见于任何先前检查的对接中的点处。然而，集群2和3代表绝大部分操作，为32％。集群2针对右后方的变构位点。集群3针对aba的‘变构’位点。集群4也针对此位点。归因于两埃容限，其它集群很可能针对此位点。
讨论
aba和nsc61610发挥lancl2依赖性免疫调节、抗炎和抗糖尿病作用，然而，计算预测表明其在lancl2不同位点处结合。正如预期的，合理设计的配位体主要针对aba和nsc61610的初级结合位点。bt-aba化合物尺寸较小并且具有-cooh官能团；这直观表明其将针对亲水性表面袋。bt化合物的疏水性大得多；因此，这直观表明其将针对α-螺旋围绕的更具疏水性的中央裂隙。
结合亲和力与spr数据具有中度相关性(图1a和1b；参见下文实例)。spr数据(与kd值)表明结合强度次序为nsc61610(2.3&6.3)、bt-11(6.3&7.7)、bt-15(11.4&21.4)、bt-6(18.2)。模型化数据(与最低be)表明结合强度次序为bt-6(-10.47)、nsc61610(-10.27)、bt-11(-9.39)、bt-15(-8.87)。除bt-6从最差翻转为第一之外，spr数据和模型化数据表明相同的结合强度次序。分子模型化数据与合理药物设计组合很可能得到对lancl2蛋白质的更好理解，其将允许进一步研发靶向lancl2路径并使之活化以利用其强效抗糖尿病和抗炎特性的类似物。
医药化学实例
实例2：bt-11和盐
如流程2-1中所示，使6-(1h-苯并咪唑-2-基)吡啶-2-甲酸(12g)于dmf(100ml)中的溶液冷却到0℃，并且接着依序添加edc·hcl(1.5当量)、hobt(1.5当量)和dipea(1.2eq，以具有推测密度的体积取用)。在0℃下搅拌混合物10分钟。添加哌嗪(0.5当量)，并且使反应混合物逐渐升温到室温并搅拌16小时。在反应完成(通过tlc监测，洗脱剂：含10％meoh的dcm)之后，将反应混合物倾入冰冷水(约300ml)中，过滤所沉淀的固体，用冰冷水洗涤，并且干燥，得到呈浅棕色固体状的bt-11(10g，75％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ13.0(s,1h),12.8(s,1h),8.38(dd,2h),8.13(dt,2h),7.73(dd,2h),7.67(d,2h),7.57(dd,2h),7.25(m,4h),3.90(bs,2h),3.80(bdd,2h),3.65(bdd,2h),3.56(bs,2h)。lcms-es529.44[m+h]+,265.46[(m+2h)/2]++。
流程2-1
如流程2-2中所示，使bt-11(1.0当量)于最少量meoh(5ml)中的悬浮液冷却到0℃，历经15-20分钟的时段逐滴添加4m甲醇盐酸(methanolichcl)(过量，15ml/1g)。使混合物逐渐升温到室温，持续3小时。在反应完成(通过tlc监测，洗脱剂：含10％meoh的ch2cl2)之后，在减压下蒸发挥发物。用含10％meoh的ch2cl2洗涤粗物质，并且冻干，得到灰白色固体(850mg，75％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ8.58(dd,2h),8.29(dt,2h),7.83(m,6h),7.44(bd,4h),3.91(bs,2h),3.81(bm,2h),3.64(bm,2h),3.55(bs,2h)。lcms-es529.56[m+h]+。
流程2-2
实例3：bt-12
如流程3-1中所示，在0℃下用edc·hcl(1.5当量)、hobt(1.5当量)和dipea(1.2当量，以具有推测密度的体积取用)和0.5当量哌嗪处理6-(苯并噁唑-2-基)吡啶-2-甲酸(4.05g)于含10％dmf的ch2cl2中的溶液。使混合物升温到室温，持续16小时。形成淡棕色固体，并且在烧结玻璃漏斗中过滤，用水洗涤，并且冻干，得到淡棕色固体(3.2g)。1hnmr(300mhz,cdcl3),δ8.45(dd,2h),8.05(m,2h),7.9(d,2h),7.8(dd,2h),7.6(dd,2h),7.4(m,2h),7.35(m,2h),4.0(bm,8h)。
流程3-1
实例4：bt-14和盐
如流程4-1中所示，在0℃下用edc·hcl(1.5当量)、hobt(1.5当量)、dipea(3当量)和哌嗪-1-甲酸叔丁酯(1.1当量)处理6-(苯并噁唑-2-基)吡啶-2-甲酸(500mg)于dmf(10ml)中的溶液。使混合物升温到室温，持续16小时。在蒸发溶剂之后，将残余物萃取到etoac中，并且用水洗涤。在真空下蒸发有机层，用戊烷洗涤的粗残余物得到淡棕色固体(120mg，48％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ8.4(d,1h),8.2(t,1h),7.9(t,2h),7.8(d,1h),7.5(dt,2h),3.7(bm,2h),3.5(bm,4h),3.4(bm,2h),1.4(s,9h)。lcms-es409.49[m+h]+,431.37[m+na]+,447.36[m+k]+。
流程4-1
如流程4-2中所示，在0℃下用甲醇盐酸(6ml)处理来自流程4-1的所得化合物(200mg)。使混合物升温到室温，持续3小时。蒸发溶剂并用戊烷和乙醚洗涤，得到淡棕色固体(160mg，定量的)。1hnmr(300mhz,dmso-d6),δ9.30(bs,2h),8.45(d,1h),8.25(t,1h),7.9(m,3h),7.5(五重峰,2h),3.7(bm,2h),3.5(bm,2h),3.3(bm,4h),1.4(s,9h)。lcms-es309.26[m+h]+。
流程4-2
如流程4-3中所示，用饱和nahco3水溶液中和来自流程4-2的所得盐(25mg)，后接在冻干器中干燥，手头得到20mg/96％bt-14。产率是90％。1hnmr(300mhz,dmso-d6),δ8.4(d,1h),8.2(t,1h),7.90(t,2h),7.75(d,1h),7.5(五重峰,2h),3.95(bm,2h),3.8(bm,2h),3.3(bm,2h),3.2(bm,2h)；309.37lcms-es[m+h]+。
流程4-3
实例5：bt-15
如流程5-1中所示，在0℃下用edc·hcl(1.5当量)、hobt(1.5当量)、dipea(3当量)和0.9当量bt-14盐酸盐处理含6-(1h-苯并咪唑-2-基)吡啶-2-甲酸(50mg)的dmf(5ml)。使混合物升温到室温，持续16小时。经烧结漏斗过滤，后接水洗涤，并且冻干以去除水分，得到20mgbt-15。1h-nmr(400mhz,dmso-d6),δ12.93(d,1h),8.44(dd,1h),8.36(t,1h)8.25(t,1h),8.17(m,2h),7.87(m,3h),7.72(m,2h),7.54(m,2h),7.31(m,3h),3.90(s,2h),3.82(bm,2h),3.67(bm,2h),3.58(bm,2h)。lcms-es530.48[m+h]+,265.94[(m+2h)/2]++。
流程5-1
bt-15已经展示lancl2结合(图1a)。其与lancl2的结合亲和力预测值是-9.9，并且由spr确认的亲和力的kd值为21.4。
实例6：bt-13盐
如流程6-1中所示，在0℃下用edc·hcl(1.5当量)、hobt(1.5当量)、dipea(3当量)和哌嗪-1-甲酸叔丁酯(1.1当量)处理含6-(1h-苯并咪唑-2-基)吡啶-2-甲酸(500mg)的dmf(10ml)。使混合物升温到室温，持续16小时。在将反应混合物倾入冰冷水中之后，过滤沉淀，并且干燥，得到浅棕色固体(600mg，70％)。tlc(100％乙酸乙酯)。hnmr&lcmscomplies.(yield:70％).1hnmr(300mhz,dmso-d6),δ12.90(s,1h),8.4(d,1h),8.15(t,1h),7.65(td,3h),7.25(五重峰,2h),3.7(bm,2h),3.5(bm,2h),3.3(bm,4h),1.4(s,9h)。lcms-es408.35[m+h]+。
流程6-1
如流程6-2中所示，在0℃下用甲醇盐酸(6ml)处理来自流程6-1的所得化合物(600mg)持续3小时。使混合物逐渐升温到室温，持续3小时。蒸发过量甲醇盐酸得到呈淡棕色固体状的bt-13盐酸盐(500mg)。
流程6-2
实例7：bt-4和盐
如流程7-1中所示，在0℃下用edc·hcl(1.5当量)、hobt(1.5当量)、dipea(1当量)和0.5当量哌嗪处理含3-(1h-苯并咪唑-2-基)苯甲酸(100mg)的dmf(6ml)。使混合物升温到室温，持续16小时。tlc(10％甲醇:dcm)展示形成非极性样点并且不存在起始材料。在处理和用乙醚洗涤之后，分离出30mg/95％bt-4。1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ13.0(s,2h),8.3(bm,4h),7.75(bm,4h),7.60(bm,4h),7.2(bm,4h),3.65(bm,8h)。lcms-es527.36[m+h]+,264.50[(m+2h)/2]++。
流程7-1
如流程7-2中所示，用含4mhcl的二噁烷处理30mg/95％bt-4，持续3小时。蒸发溶剂并且用乙醚洗涤，得到10mg/97％bt-4盐酸盐。1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ8.45(bm,4h),7.80(bm,8h),7.50(bm,4h),3.65(bm,8h)。lcms-es527.44[m+h]+,264.50[(m+2h)/2]++。
流程7-2
实例8：bt-6和盐
如流程8-1中所示，在0℃下用edc·hcl(1.5当量)、hobt(1.5当量)、dipea(1当量)和苯-1,4-二胺(0.5当量)处理含3-(1h-苯并咪唑-2-基)苯甲酸(100mg)的dmf(6ml)。使混合物升温到室温，持续16小时。tlc(10％甲醇:dcm)展示形成非极性样点并且不存在起始材料。在处理和用乙醚洗涤之后，分离出淡棕色固体(60mg)。1hnmr(300mhz,dmso-d6),δ13.1(s,2h),10.45(s,2h),8.75(s,2h),8.40(d,2h),8.05(d,2h),7.85(s,4h),7.70(t,4h),7.55(d,2h)7.25(五重峰,4h)。lcms-es549.0[m+h]+275.1[(m+2h)/2]++。
流程8-1
如流程8-2中所示，用含4mhcl的二噁烷处理60mg/98％bt-6，持续3小时。在蒸发溶剂和用乙醚洗涤之后，得到50mg/96％bt-6盐酸盐。1hnmr(300mhz,dmso-d6),δ10.60(s,2h),9.00(s,2h),8.55(d,2h),8.30(d,2h),7.90(s,4h),7.85m,6h),7.50(m,4h)。lcms-es549.3[m+h]+275.3[(m+2h)/2]++。
流程8-2
实例9：bt-16和盐
如流程9-1中所示，在0℃下用edc·hcl(1.5当量)、hobt(1.5当量)、dipea(3当量)和苯-1,4-二胺(0.5当量)处理含6-(1h-苯并咪唑-2-基)吡啶-2-甲酸(100mg)的dmf(10ml)。使混合物升温到室温，持续16小时。在将反应混合物倾入冰冷水中之后，过滤沉淀，并且干燥，得到浅棕色固体(60mg)。
流程9-1
如流程9-2中所示，在0℃下用含hcl的二噁烷(3ml)处理化合物bt-16(50mg)。使混合物升温到室温，持续4小时。蒸发过量二噁烷盐酸得到30mg棕色固体(30mg)。1hnmr(300mhz,dmso-d6),δ11.00(s,2h),8.6(bm,2h),8.35(bm,4h),8.05(s,4h),7.85(bm,4h),7.40(bm,4h)。lcms-es551.84[m+h]+。
流程9-2
实例10：bt-3和盐
如流程10-1中所示，在0℃下用edc·hcl(1.25当量)、hobt(1.25当量)、dipea(1当量)和哌嗪(1当量)处理含3-(2-苯并噁唑基)苯甲酸(50mg)的dmf(10ml)。使混合物升温到室温，持续16小时。在用冰冷水稀释反应混合物之后，扔掉所得固体，过滤，后接干燥，得到30mgbt-3。1hnmr(300mhz,dmso-d6),δ8.2(bm,4h),7.8(bm,4h),7.7(bm,4h),7.45(bm,4h),3.6(bm,8h)。lcms-es529.32[m+h]+。
流程9-1
如流程10-2中所示，在0℃下在甲醇盐酸(5ml)中处理bt-3(30mg)。使混合物升温到室温，持续4小时。在于真空下蒸发过量甲醇盐酸之后，形成棕色固体(15mg)。
流程10-2
实例11：bt-5和盐
如流程11-1中所示，在0℃下用edc·hcl(1.25当量)、hobt(1.25当量)、dipea(1当量)和苯-1,4-二胺(0.5当量)处理含3-(2-苯并噁唑基)苯甲酸(50mg)的dmf(10ml)。使混合物升温到室温，持续16小时。用冰冷水稀释反应混合物，扔掉固体，过滤，后接干燥，得到淡棕色固体(30mg)。1hnmr(300mhz,tfa),δ9.2(bs,2h),8.8(bm,2h),8.6(bm,2h),7.9(bm,14h)。
流程11-1
如流程11-2中所示，在0℃下在盐酸二噁烷(hcldioxane)(5ml)中处理35mgbt-5。使混合物升温到室温，持续4小时。在于真空下蒸发过量二噁烷之后，形成淡棕色固体(15mg)。1hnmr(300mhz,tfa),δ9.3(bs,2h),8.8(bm,2h),8.6(bm,2h),7.9(bm,14h)。
流程11-2
实例12：bt-17和盐
如流程12-1中所示，在0℃下用edc·hcl(1.5当量)、hobt(1.5当量)、dipea(1.2当量)和苯-1,4-二胺(0.5当量)处理含6-(苯并噁唑-2-基)吡啶-2-甲酸(100mg)发dmf(10ml)。使混合物升温到室温，持续16小时。用冰冷水稀释反应混合物，扔掉固体，过滤，后接干燥，得到淡棕色固体(70mg)。1hnmr(400mhz,tfa),δ8.85(dd,4h),8.55(t,2h),8.1(bm,4h),7.95(m,4h),7.85(s,4h).lcms-es553.28[m+h]+。
流程12-1
如流程12-2中所示，在0℃到室温下在二噁烷盐酸(10ml)中处理bt-17(60mg)持续4小时。在通过使用冻干器蒸发溶剂之后，形成淡棕色固体(45mg)。1hnmr(400mhz,tfa),δ8.90(bm,4h),8.6(bm,2h),8.0(bm,10h)。
流程12-2
实例13：bt-aba-25
在流程13-1中展示bt-aba-25的结构。bt-aba-25是lancl2的配位体(图1b)。其与lancl2的结合亲和力预测值是-7.5，并且由spr确认的亲和力的kd值为1.77e-04。
流程13-1
实例14：bt-aba-5a
如流程14-1中所示，用氩气使8-乙烯基-1,4-二氧杂螺[4.5]癸-8-醇(200mg，1当量)和5-溴呋喃-2-甲酸甲酯(1.5当量)于et3n(2ml)中的溶液脱气10分钟。接着，添加pd(oac)2(0.025当量)、dppf(0.05当量)，并且再次脱气10分钟。在100℃下加热所得反应混合物16小时。通过柱色谱法(etoax/己烷3:7)分离出淡棕色固体(130mg)。1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ7.30(d1h),6.60(d1h),6.45(dd,2h),4.75(s,1h),3.85(s,4h),3.80(s,3h),1.85(m,2h),1.65(m,2h),1.50(m,4h),lcms-es291.34[m+h]+。
流程14-1
如流程14-2中所示，向100mg流程14-1中所得化合物(化合物4)于thf:h2o:meoh(2:1:0.5ml)中的溶液中添加lioh(3当量)，并且在室温下搅拌混合物16小时。接着在减压下浓缩混合物，并且使粗物质溶解于最小量的水中，并且用2nhcl酸化直到ph4。用etoac萃取化合物，并且浓缩，得到淡棕色固体(54mg)，其不经进一步纯化即用于接下来的反应(流程14-3)。1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ7.50(d1h),6.60(d1h),6.45(dd,2h),4.75(s,1h),3.85(s,4h),3.80(s,3h),1.85(m,2h),1.65(m,2h),1.50(m,4h)。lcms-es277.26[m+h]+。
流程14-2
如流程14-3中所示，在0℃下在搅拌下向含化合物5(50mg)的thf中添加3nhcl(0.1ml)。使混合物升温到室温，持续6小时。tlc展示不存在sm和非极性样点。在减压下浓缩混合物，用水稀释，用etoac萃取，并且再浓缩，得到棕色固体(20mg)。1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ13.00(bs1h),7.20(d1h),6.95(d1h),6.60(d1h),6.45(d,1h),6.10(t,1h),3.05(m,2h),2.65(t,2h),2.5,(2h)。lcms-es233.21[m+h]+lcms-es231.27[m-h]-463.15[2m-h]-。
流程14-3
实例15：bt-aba-6
如流程15-1中所示，用氩气使8-乙烯基-1,4-二氧杂螺[4.5]癸-8-醇(500mg，1当量)、3-碘苯甲酸乙酯(0.8当量)和pph3(0.02当量)于et3n(8ml)中的溶液脱气10分钟。接着，添加pd(oac)2(0.02当量)，并且再次脱气10分钟。在95℃下加热所得反应混合物16小时。在处理之后，通过柱色谱法(etoac/己烷3:7)分离出浅棕色固体(500mg)。1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ7.95(s1h),7.80(d1h),7.71(d1h),7.47(t1h),6.65(d1h),6.49(d,1h),4.65(bs1h),4.32(q,2h),3.68(s,4h),1.99-1.68(m,4h),1.55-1.50(m,4h),1.33(t3h)。lcms-es315.38[m-17]+。
流程15-1
如流程15-2中所示，使化合物4(500mg)于thf/h2o/etoh(4:2:1，17.5ml)中的溶液冷却到0℃；添加lioh(2.5当量)，并且在历经16小时上升到室温的同时搅拌混合物。在减压下浓缩混合物，并且使粗物质溶解于最小量的水中，并且用1nhcl酸化直到ph3-4。通过柱色谱法(etoac/己烷1:1)纯化得到浅黄色固体(220mg)。1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ13.00(bs1h),7.95(s1h),7.78(d1h),7.67(d1h),7.44(t1h),6.64(d1h),6.48(d,1h),4.65(s1h),3.86(s,4h),1.87-1.61(m,4h),1.55-1.50(m,4h)。lcms-es287.34[m-17]+。
流程15-2
如流程15-3中所示，在0℃下在搅拌下向100mg化合物5(100mg)与thf中的混合物中添加2nhcl(1.5ml)。使混合物升温到室温，持续6小时。接着在减压下浓缩溶液，用水稀释，用etoac萃取，并且再浓缩，得到浅黄色固体(20mg)。1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ13.00(bs1h),8.00(s,1h),7.80(d1h),7.65(d1h),7.45(t1h),6.75(d1h),6.45(d,1h),6.10(t,1h),5.15(s1h),2.65(m,2h),2.15(m,2h),1.90(m,4h),lcms-es259.37[m-h]-519.48[2m-h]-。
流程15-3
实例16：bt-aba-13
如流程16-1中所示，在0℃下在搅拌下向化合物2(2.5g，1当量)于ch2cl2(50ml)中的溶液中添加二氢哌喃(1.3当量)和tsoh(0.1当量)。使所得溶液逐渐升温到室温，持续14小时。通过柱色谱法(etoac/己烷1:9)分离出浅黄色液体。所述化合物不经进一步纯化即用于下一步骤中。
流程16-1
如流程16-2中所示，向et3n中添加化合物3(2.5g，1.0当量)、4,4,5,5-四甲基-[1,3,2]二氧杂硼戊烷(1.2当量)和双(环戊二烯基)氢氯化锆(0.15当量)在60℃-70℃下加热所得反应混合物16小时。用己烷稀释反应混合物。通过经短硅胶垫过滤和用己烷洗涤来去除沉淀。在浓缩己烷溶液后，获得无色油状液体(1.3g)。1hnmr(400mhz,cdcl3),δ6.60(d1h),5.60(d1h),6.35(d,1h),4.75(s,1h),3.85(s,3h),2.80(m,2h),2.35(m,2h),2.05(m,4h)。
流程16-2
如流程16-3中所示，用氩气使化合物4(550mg，1.1当量)、6-溴吡啶甲酸甲酯(1.0当量)、k2co3(2.0当量)于dme/h2o9:1混合物(8ml)中的溶液脱气10分钟。接着，添加pd[(p(ph)3]4(0.04当量)。在100℃下加热所得反应混合物16小时。浓缩反应溶液，后接柱色谱法(etoac/己烷1:3)，得到浅黄色固体(230mg)。lcms-es404.39[m+h]+,302.26[m-101]+。
流程16-4
如流程16-5中所示，向化合物5(230mg，1.0当量)于丙酮/h2o1:1(6ml)中的溶液中添加tsoh(0.1当量)。在室温下搅拌所得反应混合物16小时。浓缩反应混合物，后接柱色谱法(etoac/己烷7:3)，得到浅黄色液体(110mg)。1hnmr(400mhz,cdcl3),δ8.00(d1h),7.80(t,1h),7.50(d,1h),6.90(m2h),4.00(s,3h),2.80(m,2h),2.35(m,2h),2.10(m,4h),lcms-es276.38[m+h]+。
流程16-5
如流程16-6中所示，在搅拌下向化合物6(75mg)于0℃thf/h2o3:1(3ml)中的溶液中添加lioh(2.5当量)。使混合物升温到室温，持续6小时。用柠檬酸使反应混合物酸化，并且用thf和etoac的混合物萃取。浓缩有机溶液得到灰白色固体(10mg)。1hnmr(300mhz,dmso-d6),δ13.05(bs,1h),7.90(m,2h),7.65(d,1h),7.05(d,1h),6.80(d,1h),5.20(s,1h),2.65(m,2h),2.20(bd2h),2.10-1.90(m,4h),lcms-es262.27[m+h]+。
流程16-6
实例17：bt-aba-16
如流程17-1中所示，用氩气使化合物4(437mg，1.2当量)、2-溴异烟碱酸甲酯(1.0当量)、k2co3(2.0当量)于dme/h2o9:1混合物(8ml)中的溶液脱气10分钟。接着，添加pd[(p(ph)3]4(0.04当量)。在90℃下加热所得反应混合物12小时。浓缩反应溶液，后接柱色谱法(etoac/己烷1:3)，得到浅黄色液体(300mg)。1hnmr(300mhz,cdcl3),δ8.70(d,1h),7.85(s,1h),7.65(d,1h),6.85(d,1h),6.65(d,1h),4.70(m,1h),3.95(m,4h),2.20-1.40(m,16h),lcms-es404.54[m+h]+,302.53[m-101]+。
流程17-1
如流程17-2中所示，向5(300mg，1.0当量)于丙酮/h2o1:1(6ml)中的溶液中添加tsoh(0.1当量)。在室温下搅拌所得反应混合物48小时。浓缩反应混合物，后接柱色谱法(etoac/己烷7:3)，得到灰白色固体(160mg)。1hnmr(300mhz,dmso-d6),δ8.70(d,1h),7.85(s,1h),7.65(d,1h),7.05(d,1h),6.85(d,1h),5.20(s,1h),3.90(s,3h),2.65(td,2h),2.15(bd,2h),2.00(m,2h),1.85(m,2h),lcms-es276.22[m+h]+。
流程17-2
如流程17-3中所示，在0℃下在搅拌下向化合物6(100mg)于thf/h2o3:1(3ml)中的溶液中添加lioh(2.5当量)。使混合物升温到室温，持续16小时。用柠檬酸使反应混合物酸化，并且用thf和etoac的混合物萃取。在减压下浓缩得到灰白色固体(20mg)。1hnmr(300mhz,dmso-d6),δ13.60(bs,1h),8.70(d,1h),7.85(s,1h),7.60(d,1h),7.00(d,1h),6.85(d,1h),5.20(s,1h),2.65(m,2h),2.20-1.80(m,6h),lcms-es262.28[m+h]+。
流程17-3
实例18：bt-aba-14
如流程18-1中所示，用氩气使化合物4(300mg，1.2当量)、4-溴吡啶甲酸甲酯(1.0当量)、k2co3(2.0当量)于dme/h2o9:1混合物(8ml)中的溶液脱气10分钟。接着，添加pd[(p(ph)3]4(0.04当量)。在90℃下加热所得反应混合物12小时。浓缩反应溶液，后接柱色谱法(etoac/己烷1:3)，得到浅黄色液体(200mg)。1hnmr(300mhz,cdcl3),δ8.50(d,1h),8.20(bs,1h),7.45(d,1h),6.70(d,1h),6.50(d,1h),4.60(m,1h),3.95(m,4h),2.20-1.40(m,16h),lcms-es390.35[m+h]+。
流程18-1
如流程18-2中所示，向5(200mg，1.0当量)于丙酮/h2o1:1(6ml)中的溶液中添加tsoh(0.1当量)。在室温下搅拌所得反应混合物48小时。用柠檬酸使反应混合物酸化，并且用thf和etoac的混合物萃取。浓缩溶液，得到灰白色固体(18mg)。1hnmr(300mhz,dmso-d6),δ8.60(d,1h),8.05(s,1h),7.60(d,1h),6.90(d,1h),6.70(d,1h),5.20(bs,1h),2.65(m,2h),2.15(bd,2h),2.05-1.80(m,4h),lcms-es262.27[m+h]+。
受体结合实例
实例19：lancl2结合实例
组合计算模型化研究和生化验证以引导对结合于lancl2的化合物的选择。表面等离子共振(spr)技术的最新迭代提供实时测定在无标记蛋白质与小分子(>25da)之间分子相互作用的体外、高处理量定量手段。biacoretmt200(新泽西州皮斯卡塔韦的通用电气医疗集团(gehealthcare,piscataway,nj))技术进一步提供gmp/glp顺应性以及在小于24小时时段中筛选或详细滴定的自发大规模数据采集的附加益处。所关注分子相互作用通过biacoretmt200spr技术常规地验证。
方法
经由lancl2-化合物相互作用分子模型化的高处理量筛选。auto-docvina[14]是能够进行高处理量并行计算以确定lancl2-植物化合物结合的目前先进技术软件套件。软件套件首先计算(i)与结合复合物相关联的自由能的力，并且随后计算(ii)可供用于在标靶与配位体之间复合物形成的构象空间。这些方法本质上是随机，因此需要重复独立筛选以详尽地搜索所有参数空间并提供预测可信度。目前，lancl2模型可经由lancl1的同源性模型化获得[15]。autodock和autogrid的图形前端autodocktools用于界定搜索空间，包括栅格方块中心以及x、y、z维度[16]。autodockvina对每一化合物产生五种结合构象。对接应用于全蛋白标靶，其中栅格覆盖全部蛋白质表面。产生对接记录文件，其由对所有化合物对所有表面的每一预测结合模式的结合能组成。
lancl2-小分子相互作用的动力学测定。biacoretmt200用于测定小分子bt-11、bt-aba-5a、bt-6和bt-15(被分析物)与lancl2(配位体)结合发动力学参数。以剂量依赖性(5-8个滴定点)方式一式三份地产生数据，并且加以分析以确定结合模型(朗格缪尔(langmuir)、构象偏移等)、实时缔合与解离常数以及平衡解离常数。spr技术允许验证特异性lancl2-植物化学成分相互作用以及增加对结合机制和速率的金标准深刻理解。实验通过由胺偶合共价附接lancl2在羧基甲基聚葡萄糖(cm5)传感器芯片上执行。以10μl/min用0.1mn-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和0.5m1-乙基-3-(-3-二甲氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(edc)的1:1混合物使传感器晶片的流动池1和2活化持续720秒。将储备液lancl2(0.41mg/ml)在10mm乙酸钠(ph5.0)中稀释到8.2μg/ml(1:50稀释度)，并且以10μl/min流动速率注射到活化流动池2表面上持续1000秒。在于流动池2上捕获lancl2(11000ru)之后，通过以10μl/min注射1m乙醇胺持续720秒来使流动池1和2的表面失活。操作缓冲液是含有0.05％t-20和0.15mnacl的25mmmops，ph6.5。动力学研究通过一式三份注射不同浓度的bt-11(25μm、12.5μm、6.25μm、3.13μm、1.56μm和0.76μm)、bt-aba-5a(40μm、20μm、10μm、5μm、2.5μm和1.25μm)以及bt-15/bt-6(20μm、10μm、5μm、2.5μm、1.25μm、0.625μm和0.313μm)来执行。每一样品注射60秒(接触时间)，后接流动速率为100μl/min的60秒解离时间。在下一次注射之前使用180秒稳定化时间。用biacoretmt200评估软件(版本1)分析数据以使用1:1结合模型确定亲和力结合常数(kd)。
结果
bt-11和bt-15两者强结合于lancl2。为了确认bt-11和bt-15与lancl2蛋白质的结合，我们在biacoretmt-200仪器中执行spr分析。用于检测分子相互作用的光学技术spr用于测量lancl2与其配位体(即，bt-11和bt-15)之间的结合亲和力。我们将经过纯化的重组lancl2蛋白质固定在biacoretm传感器芯片上，并且使用仪器微流体系统将小分子注射到蛋白质表面上。测量芯片表面上的总质量的变化，其对应于与蛋白质的小结合。通过注射一系列小分子浓度，我们能够计算bt-11结合于lancl2和bt-15结合于lancl2的稳态结合亲和力。结合传感图展示典型小分子蛋白质相互作用，其具有极快缔合速率和极快解离速率(图8，图a和c)。这些快速相互作用超出仪器的技术能力。因此，未确定可靠缔合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)。平衡解离常数(kd)常用以描述配位体与蛋白质之间的亲和力，如配位体结合于特定蛋白质的紧密程度。配位体-蛋白质亲和力受两个分子之间的非共价分子间相互作用影响，所述相互作用如氢键结、静电相互作用、疏水力和范德华力。通过针对化合物浓度绘制平衡结合水平，我们能够测量每一相互作用的稳态亲和力(kd)(图8，图b和d)。两个小分子都展示对lancl2的类似结合亲和力(bt-11：7.7um，bt-1511.4um)。
bt-aba-5a和bt-6强结合于lancl2。与上文所描述的结果类似并且为了确认bt-6和bt-aba-5a与lancl2的结合，我们在biacoretmt-200仪器中执行spr分析。在此情况下，我们也将经过纯化的重组lancl2蛋白质固定在biacoretm传感器芯片上，并且使用仪器微流体系统将小分子注射到蛋白质表面上。测量芯片表面上的总质量的变化，其对应于与蛋白质的小结合。更仔细查看结合传感图(图9a和9b)，与极快缔合并极快解离的bt-11/bt-15相比，我们的结果展示bt-6和bt-aba-5a如何极快结合但不以同样速率解离。值得注意的是，bt-aba-5a的占有时间展示最慢的解离速率，意味着bt-aba-5a在lancl2结合袋中保持时间最长。此更长结合可以通过触发更有效的抗炎和抗糖尿病和其它治疗反应来潜在地影响lancl2路径的活化。
已经由spr测试其它化合物，并且结果可理解地展示于图1a和1b中。
实验研究实例
实例20：bt-11对ibd急性模型的用途
介绍
发炎性肠病(ibd)是胃肠道的慢性复发疾病，其在美国困扰超过一百四十万人。ibd包含两种不同表现：溃疡性结肠炎和克罗恩氏病。目前针对ibd的疗法是适度成功的，并且对于长期控制所述疾病具有明显不利的副作用[17]。克罗恩氏病代表疾病的慢性期，而急性溃疡性结肠炎(uc)表现为影响结肠组织的早期病理学。uc是胃肠道的慢性特发性发炎性病症，其特征在于以连续方式近端延伸穿过结肠达到不同程度的直肠中的粘膜炎症。病症的特征在于不同严重性的复发和缓解历程。大多数患者呈现轻度到中度严重性的左侧或远端疾病。大部分在维持性药物治疗的情况下保持缓解持续长时段。然而，自然史研究表明，介于10％与40％之间的患者将在其疾病历程期间的某一点时经历结肠切除术。
类固醇难治性严重uc的药物治疗近年来已在某种程度上扩张，其中可获得环孢菌素(ciclosporin)和英利昔单抗(infliximab)作为急救剂；然而手术仍保持为仅有的“治愈性”选项。本发明提供一种用于治疗uc的新颖药品，所述治疗通过靶向称为lancl2的新颖受体来进行。我们的最优化合物bt-11经口投与并全身性分布，并且在uc中通过靶向肠道免疫细胞中的lancl2来发挥免疫调节作用。我们在小鼠中急性uc中的临床前功效研究展示用bt-11投药如何降低疾病活动性指数并且改善肠道炎症，所述降低和改善通过显著地减少肠道粘膜中的白细胞浸润以及减少粘膜增厚和上皮细胞侵蚀来进行。基因表达分析确认，在小鼠中的急性dss诱导溃疡性结肠炎模型中，经口投与bt-11上调il-10和lancl2表达，并且下调tnfαmrna表达。
方法
小鼠。c57bl/6购自jacksonlaboratory，并且在特定无病原体条件下收容于通风架中。lancl2-/-小鼠购自加利福尼亚大学戴维斯分校(universityofcaliforniadavis)的komp储存库。所有小鼠维持在动物设施中。所有实验方案都由机构动物照护与使用委员会(institutionalanimalcareandusecommittee)批准，并且符合或超出美国国家卫生研究院(nationalinstitutesofhealth)实验室动物福利和公共卫生服务办公室(officeoflaboratoryanimalwelfareandpublichealthservicepolicy)政策的指导原则。
dss诱导结肠炎。在c57bl/6j小鼠中通过投与向饮用水中添加的5％(w/v)葡聚糖硫酸钠(dss；分子量42kda；俄亥俄州奥罗拉(aurora,oh)的icnbiochemicals)来诱导结肠炎。在dss处理之后7天时评定结肠炎症。dss项目中的群组由以下组成：i.非dss并且媒剂处理的小鼠，ⅱ.非dss并且bt-11(80mg/kg)处理的小鼠，ⅲ.dss处理并且媒剂处理的小鼠，和iv.dss处理并且bt-11(80mg/kg)处理的小鼠。在每一群组中包括十二只小鼠。
组织病理学。将来自小鼠中ibd研究的结肠切片固定在10％缓冲中性福尔马林中，稍后嵌入于石蜡中，并且接着切片(5μm)并用h&e染色剂染色以用于组织学检查。用混合组织学评分对结肠进行分级，包括(1)白细胞浸润、(2)粘膜增厚和(3)上皮细胞侵蚀的程度。对先前类别中的每一个，用0-4的评分对切片进行分级，并且分析数据作为归一化的混合评分。
定量实时pcr。根据制造商说明书使用rneasyplus迷你试剂盒(加利福尼亚州巴伦西亚(valencia,ca)的qiagen)从小鼠结肠分离出总rna。总rna(1μg)用于使用iscripttmcdna合成试剂盒(加利福尼亚州埃库莱斯(hercules)的bio-rad)来产生cdna模板。总反应体积是20μl，其中在mjminitm热循环仪(bio-rad)中如下培育反应物：在25℃下5分钟，在52℃下30分钟，在85℃下5分钟，并且保持在4℃下。使用taqdna聚合酶(加利福尼亚州卡尔斯巴德(carlsbad)的lifetechnologies)对cdna执行pcr。用minelutepcr纯化试剂盒(qiagen)来纯化每一基因扩增子，并且在琼脂糖凝胶上通过使用dna质量序列梯(威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(promega,madison,wi))和使用纳米滴(nanodrop)来量化。这些经过纯化的扩增子用于在实时pcr分析中对实时pcr条件进行优化和产生标准曲线。使用oligo6软件设计引物。对于每一引物集合，使用系统梯度方案对引物浓度和粘接温度进行优化以用于icycleriqtm系统(bio-rad)在优化期间并且还在样品dna实时pcr期间，对每一引物集合维持pcr效率介于92％与105％之间并且相关系数>0.98。通过实时qpcr使用icycleriqtm系统和iqtm
统计分析。使用anova后接雪费多重比较法(scheffe'smultiplecomparisonmethod)来分析参数数据。通过使用曼-惠特尼u测试(mann-whitney'sutest)后接邓恩多重比较测试(dunn'smultiplecomparisonstest)来分析非参数数据。通过使用sas版本6.0.3(sasinstitute)的一般线性模型程序来执行anova。以p≤0.05评定统计显著性。
结果
bt-11改善结肠炎dss模型中的疾病和组织病理学。本研究的目标是调查投与bt-11是否在ibd的情形下使lancl2活化并发挥抗炎特性。为了评定我们的示例性化合物bt-11在ibd急性模型中的功效，我们在7天攻击中用5％dss处理c57bl/6j小鼠。在整个攻击时段中，用bt-11处理显著地改善疾病活动性评分(图10，图a)。此外，在通过在攻击后第7天使用bt-11使lancl2路径活化后，脾脏(图10，图b)、mln(图10，图c)和结肠(图10，图d)中的宏观病变也显著地减少。
bt-11在患有急性发炎性结肠炎的小鼠中以剂量反应方式改善结肠组织病理学。我们接下来检查bt-11对组织病理学结肠发炎性病变的作用。与我们对疾病活动性和总病变的观察一致的是，基于对白细胞浸润(图11，图g)、上皮细胞侵蚀(图11，图h)，粘膜增厚(图11，图i)的评定，组织病理学分析确认用bt-11处理使肠道粘膜中的炎症显著地减少5倍。代表性结肠显微图展示在小鼠中dss诱导结肠炎期间用bt-11处理如何显著地改善肠道粘膜状态以及若干免疫子组的浸润，所述改善通过改善上皮细胞完整性和减少肠道架构的破坏来进行(图11，图a-f)。我们用bt-11执行剂量反应研究，并且我们有趣地观察到随着bt-11的剂量从10增加到80mg/kg，结肠炎症的三个标志(白细胞浸润、粘膜增厚和上皮细胞侵蚀)如何在患有结肠炎的小鼠中减少(图12，图a-c)。
用bt-11口服处理减少tnfα表达并上调lancl2和il-10。为了更仔细调查bt-11对免疫系统调节的作用，我们评定il-10、lancl2和tnfα的遗传表达。结果展示用bt-11处理如何下调肿瘤坏死因子α(tnfα)的表达(图13，图a)以及上调白介素10(il-10)(图13，图b)和lancl2受体(图13，图c)的水平，因此产生促进抗炎性作用并且下调由tnfα驱动的发炎性反应的正反馈回路(positivefeedbackloop)通过执行剂量反应研究，我们可以假设，当通过流式细胞测量术评定的结肠il-10表达在用bt-11的剂量反应动力学之后进行时，我们的配位体bt-11和lancl2路径的后续活化直接增加结肠il-10的产生(图14，图b)。我们观察到，结肠tnfα表达性细胞的减少在40与80mg/kgbt-11两种情况下明显不同，但在较低剂量(如10或20mg/kg)情况下并非如此(图14，图a)我们还观察到mln中的foxp3表达如何具有剂量依赖性(图14，图c)。
bt-11在急性结肠炎期间的作用依赖于lancl2。为了展现在小鼠中急性结肠炎期间如何发挥用bt-11投药的有益作用，我们执行比较野生型和lancl2基因剔除(lancl2-/-)小鼠中此类作用的研究。我们的结果展现，由于lancl2损失阻止小鼠从急性dss诱导结肠炎恢复，故lancl2对于bt-11发挥其抗炎益处是必要的(图15，图a)。同样，当比较野生型和lancl2-/-同窝幼畜时，lancl2的损失消除结肠(图15，图b)、mln(图15，图c)和脾脏(图15，图d)中的宏观评分降低。此外，由于我们评定用媒剂或bt-11处理的lancl2-/-小鼠中的组织病理学分析，并且我们观察到lancl2损失如何完全消除bt-11作用，故bt-11在结肠粘膜中病变形成中的作用也具有lancl2依赖性(图16)。
为了进一步表征在用bt-11处理后的细胞反应，我们执行进一步lancl2基因剔除研究以确定促炎性蛋白质的减少和抗炎性因子的增加是否得到削弱。我们的流式细胞测量术结果展现，促炎性因子mcp1的减少在结肠(图17，图a)和mln(图17，图b)中具有lancl2依赖性，这是因为lancl2基因的损失消除bt-11作用。我们还发现结肠中的tnfα分泌具有lancl2依赖性(图17，图c)，以及mhc-ii+cd11c+粒细胞群体的上调具有lancl2依赖性(图17，图d)。与这些结果一致的是，我们发现il-10分泌在bt-11处理之后的上调在lancl2基因剔除小鼠中结肠(图17，图e)和脾脏(图17，图f)中完全消除，再次展示我们的最优化合物与我们所关注的标靶的依赖性。
讨论
lancl2已经作为用于发炎和免疫介导疾病的新颖治疗标靶出现[18]。我们的体内结果首次展现，用lancl2配位体bt-11口服治疗通过遏制炎症改善ibd小鼠模型中的肠道免疫病理学。lancl2作为潜在治疗标靶最近已收到一些关注，这归因于其与aba结合和信号传导相关的功能[19]和最近发现的基于替代性膜的pparγ活化机制[8]。此外，我们测定一系列小鼠组织中的lancl2表达，其展示除大脑和睾丸之外，lancl2也在其它组织中表达，如胸腺、脾脏、结肠和派伊尔集合淋巴结(peyer'spatches)，其指示lancl2与免疫反应之间的可能关联并且表明lancl2作为治疗标靶的更广潜能。
先前，我们已经报告aba在体外使pparγ转活化(transactivate)，并且与其它pparγ促效剂类似遏制全身性炎症。因为aba和nsc61610都靶向lancl2，所以nsc61610也可以经由pparγ活化起作用。实验结果展示，nsc61610处理使原始巨噬细胞中的pparγ活化，由此提供lancl2与pparγ之间潜在信号传导关联的证据并且指示nsc61610可能体外靶向lancl2-pparγ轴。为了调查lancl2在nsc61610介导的pparγ活化中的重要性，我们测定通过使用sirna剔除原始巨噬细胞中的lancl2是否削弱或消除nsc61610对pparγ报告子活性的作用。我们的发现指示剔除lancl2显著地减弱nsc61610对pparγ活性的作用[12]。在此实例中，我们展现投与bt-11如何发挥抗炎特性，所述发挥通过不仅降低疾病活动性指数评分以及脾脏、mln和结肠中的宏观评分(图10)而且还显著地减少组织病理学病变(图11)来进行。我们展现此两种具体作用如何依赖于lancl2(图15和图16)。我们还展现bt-11降低tnfa水平并且上调lancl2和il-10(图13)。我们还展现，由于我们未在lancl2-/-小鼠中观察到这些趋势，故此处效果具有lancl2依赖性(图17)。这些结果确认，lancl2是用于发炎性疾病的新颖治疗标靶，并且bt-11是靶向其的化合物。
实例21：bt-11对克罗恩氏病慢性模型的用途
介绍
如上文所陈述，发炎性肠病(ibd)与其两种临床表现溃疡性结肠炎和克罗恩氏病是免疫介导的疾病，其特征在于胃肠道的广泛炎症和免疫细胞浸润。ibd病源学是多因素的，并且引起遗传倾向性、环境因素和肠道微生物丛当中的相互作用。
本实例将集中于慢性ibd表现：克罗恩氏病。溃疡性结肠炎中炎症的特征在于涉及表层粘膜和粘膜下层但限于结肠的连续模式，而在克罗恩氏病中，此炎症是具有透壁性并且不连续的，并且超出最受影响的回肠，肠道的任何区都可能受影响。克罗恩氏病致病机制是复杂的，并且受到遗传和环境因素以及由粘膜免疫系统长期活化引起的对肠道粘膜的免疫介导损伤影响。
目标为下调免疫和发炎性反应的治疗，如皮质类固醇泼尼松(prednisone)或抗肿瘤坏死因子-α抗体
本发明提供一种用于治疗克罗恩氏病的新颖药品，所述治疗通过靶向称为lancl2的新颖受体来进行。示例性化合物bt-11经口投与并全身性分布，并且不仅在uc中而且还在克罗恩氏病中通过靶向肠道免疫细胞中的lancl2来发挥免疫调节作用。我们在小鼠中克罗恩氏病慢性模型中的临床前功效研究展示用bt-11投药如何降低疾病活动性指数并且改善肠道炎症，所述降低和改善通过显著地减少肠道粘膜中的白细胞浸润以及减少粘膜增厚和上皮细胞侵蚀来进行。基因表达分析确认，在小鼠中的ibd慢性模型中，经口投与bt-11上调lancl2表达，并且下调tnfαmrna表达。此外，投与bt-11减少进入结肠固有层中的促炎性巨噬细胞和树突状细胞浸润，以及在结肠中上调foxp3-表达性cd4+t细胞并下调效应th1细胞的数目。我们还执行基因剔除研究以确认这些效果具有lancl2依赖性。最后，在诱导位点中，bt-11能够下调th17细胞的产生以及经由上调foxp3表达来上调调节性cd4+t细胞隔室。
方法
小鼠。c57bl/6和il-10基因剔除小鼠购自jacksonlaboratory，并且在特定无病原体条件下收容于通风架中。lancl2-/-小鼠购自加利福尼亚大学戴维斯分校的komp储存库。所有小鼠维持在动物设施中。所有实验方案都由机构动物照护与使用委员会批准，并且符合或超出美国国家卫生研究院实验室动物福利和公共卫生服务办公室政策的指导原则。
cd4+t细胞富集和分选。使用i-mag细胞分离系统(bdpharmingen)通过磁性负分选使获自c57bl/6j(野生型)小鼠的脾细胞富含cd4+t细胞。将细胞与生物素标记的ab混合物一起培育，后接与抗生蛋白链菌素粒子一起二次培育，并且暴露于磁铁以去除不合需要的细胞。富含cd4+的细胞悬浮液的纯度在93％与96％之间。富含cd4+的细胞用于过继转移，或通过facs进一步纯化。对于facs分选，用cd45rb、cd4和cd25标记细胞，并且在facsariatm细胞分选仪(加利福尼亚州圣何塞(sanjose)的bdbiosciences)中将其分离成cd4+cd45rbhighcd25-细胞(即，效应t细胞)。facs分选的cd4+子组的纯度≥98％。
过继转移。向六周龄scid和rag2-/-小鼠腹膜内(i.p.)投与4×105个来自c57bl/6j(野生型)或lancl2-/-小鼠的cd4+cd45rbhighcd25-。每周对小鼠进行称重，并且每日记录疾病临床征象，持续14周。杀死发展出严重消耗病迹象的小鼠。否则，在转移之后90天时杀死小鼠。用于过继转移研究的群组如下：i.非转移并且媒剂处理，ⅱ.非转移并且bt-11(80mg/kg)处理，ⅲ.转移并且媒剂处理，iv.转移并且bt-11(80mg/kg)处理。在每一群组中使用12只小鼠。
组织病理学。将来自小鼠中ibd研究的结肠切片固定在10％缓冲中性福尔马林中，稍后嵌入于石蜡中，并且接着切片(5μm)并用h&e染色剂染色以用于组织学检查。用混合组织学评分对结肠进行分级，包括(1)白细胞浸润、(2)粘膜增厚和(3)上皮细胞侵蚀的程度。对先前类别中的每一个，用0-4的评分对切片进行分级，并且分析数据作为归一化的混合评分。
细胞分离。切除脾脏和肠系膜淋巴结(mln)，并且使用两个无菌显微镜载玻片的磨砂末端在1×pbs/5％fbs中压碎。使单一细胞悬浮液以300×g离心10分钟，并且用1×pbs洗涤一次。在洗涤步骤之前通过渗透溶解来去除红细胞。将所有细胞小球再悬浮于facs缓冲液(补充有5％fbs和0.09％叠氮化钠的1×pbs)中，并且对其进行流式细胞测量分析。并行地，切除结肠，并且分离固有层白细胞(lpl)。在cmf(1×hbss/10％fbs/25mmhepes)中洗涤组织片，并且在37℃下在搅拌的同时用cmf/5mmedta培育组织两次，每次15分钟。在用1×pbs洗涤之后，在37℃下在搅拌的同时在补充有300u/mlviii型胶原蛋白酶和50u/mldna酶i(两者都是西格玛-奥德里奇公司(sigma-aldrich))的cmf中使组织进一步消化1.5小时。在过滤上清液之后，在1×pbs中洗涤细胞一次，使小球再悬浮于facs缓冲液中，并且对其进行流式细胞测量分析。
通过流式细胞测量术进行的免疫表型和细胞因子分析。对于免疫细胞子组的荧光染色，将4-6×105个细胞与以下荧光染料结合原代小鼠特异性抗体一起培育20分钟：抗cd3pe-cy5克隆株145-2c11(加利福尼亚州圣地亚哥(sandiego)的ebioscience)、抗cd4pe-cy7克隆株gk1.5(ebioscience)、抗cd4apc克隆株rm4-5和抗cd25生物素克隆株7d4(bdbiosciences)。用facs缓冲液(补充有5％fbs和0.09％叠氮化钠的1×pbs)洗涤细胞。对于转录因子和细胞因子的细胞内染色，使用商业试剂盒根据制造商说明书(ebioscience)固定细胞并对其进行渗透。简言之，固定细胞对其进行渗透20分钟，用小鼠抗cd16/cd32fcblock(bdbiosciences)阻断fc受体，并且用针对以下的荧光染料结合抗体对细胞进行染色：抗小鼠foxp3fitc克隆株fjk-16s、抗小鼠rorγ(t)pe、克隆株b2b和抗小鼠il17-aapc克隆株ebio17b7(ebioscience)。将所有样品在暗处固定储存在4℃下，直到在facsaria流式细胞仪(bdbiosciences)上采集为止。将活细胞门控(fsc-a、ssc-a)应用于所有样品，后接单一细胞门控(fsc-h、fsc-w)，随后用于细胞的特定标记物表达。用facsdivatm(bdbiosciences)和flowjo(treestarinc)执行数据分析。
定量实时pcr。根据制造商说明书使用rneasyplus迷你试剂盒(qiagen)从小鼠结肠分离出总rna。总rna(1μg)用于使用iscripttmcdna合成试剂盒(bio-rad)来产生cdna模板。总反应体积是20μl，其中在mjminitm热循环仪(bio-rad)中如下培育反应物：在25℃下5分钟，在52℃下30分钟，在85℃下5分钟，并且保持在4℃下。使用taqdna聚合酶(invitrogen)对cdna执行pcr。用minelutepcr纯化试剂盒(qiagen)来纯化每一基因扩增子，并且在琼脂糖凝胶上通过使用dna质量序列梯(普洛麦格公司)和使用纳米滴来量化。这些经过纯化的扩增子用于在实时pcr分析中对实时pcr条件进行优化和产生标准曲线。使用oligo6软件设计引物。对于每一引物集合，使用系统梯度方案对引物浓度和粘接温度进行优化以用于icycleriqtm系统(bio-rad)在优化期间并且还在样品dna实时pcr期间，对每一引物集合维持pcr效率介于92％与105％之间并且相关系数>0.98。通过实时qpcr使用icycleriqtm系统和iqtm
统计分析。使用anova后接雪费多重比较法来分析参数数据。通过使用曼-惠特尼u测试后接邓恩多重比较测试来分析非参数数据。通过使用sas版本6.0.3(sasinstitute)的一般线性模型程序来执行anova。以p≤0.05评定统计显著性。
结果
bt-11改善ibd慢性il-10-/-模型中的疾病活动性。鉴于已知il-10遏制许多促炎性细胞因子的分泌[21]，研究克罗恩氏病慢性的多种动物研究已经采用白介素-10缺陷型小鼠(il-10-/-)小鼠模型。为了不仅在结肠炎急性模型中而且还在慢性模型中评定bt-11的功效，我们设置结肠炎il-10剔除式小鼠模型研究并且用增加剂量的bt-11(20、40和80mg/kg)处理所述小鼠。在经过处理的小鼠中，与其媒剂处理的同窝幼畜相比，用bt-11处理显著地降低疾病活动性指数评分(图18)。此外，与在第13周开始并且直到实验结束为止用20或40mg/kgbt-11化合物处理的那些小鼠相比，用最高剂量bt-11(80mg/kg)处理的小鼠显著地降低评分。
bt-11在ibd的il10-/-慢性模型中减少脾脏、mln和结肠中的宏观病变。为了最初测定临床功效，我们在用bt-11处理和后续lancl2路径活化之后评定宏观组织病变。在研究开始之后19周时，我们在安乐死和组织收集之后立刻对脾脏(图19，图a)、mln(图19，图b)和结肠(图19，图c)进行宏观评分。用低到20mg/kg浓度的bt-11处理极大并显著地降低三种组织中的宏观评分，展现其强效功效。
bt-11改善ibd的il-10-/-慢性模型中的组织病理学病变和炎症。为了评定肠道粘膜中的组织病理学病变和一般病理学，用h&e对结肠切片进行染色，并且在显微镜下观察。我们的结果基于白细胞浸润(图20，图a)、上皮细胞侵蚀(图20，图b)和粘膜增厚(图20，图c)的减少展示用bt-11处理如何显著地减少炎症。我们还观察到与粘膜增厚相关的肠道粘膜中浸润量的剂量依赖性机制。
用bt-11处理在结肠固有层、脾脏和mln中诱导强效抗炎性反应并减少促炎性子组。为了测定bt-11对免疫细胞子组的作用，我们表型地表征从结肠、脾脏和mln分离的细胞。我们的分析指示bt-11显著地降低结肠固有层中促炎性f4/80+巨噬细胞(图21，图a)、mhc-ii+cd11c+树突状细胞(图21，图b)和效应th1细胞(图21，图d)的百分比。此外，bt-11经由上调结肠lp中的foxp3表达性cd4+t细胞来发挥抗炎特性(图21，图c)。
也在mln(图22，图b)和脾脏(图22，图c)中注意到foxp3表达性cd4+t细胞的上调，也展示和展现bt-11如何具有全身性作用。也在脾脏中以剂量反应方式观察到促炎性th1细胞的下调(图22，图d)。最后，由其rorγt表达表征的效应th17细胞在mln中下调(图22，图a)。
此外，基因表达分析确认用bt-11处理上调结肠lancl2表达(图23，图a)并且下调tnfα表达(图23，图b)。这些表达作用对所投与bt-11的量具有剂量依赖性。
bt-11展现ibd结肠炎模型的cd4+t细胞诱导中的疾病活动性的改善。为了进一步验证bt-11在另一种ibd慢性模型中的功效，我们将来自野生型和lancl2-/-小鼠的未经处理的cd4+t细胞过继转移到rag2-/-接受体中。基于实验设计用媒剂或bt-11处理rag2-/-小鼠。在经过处理的小鼠中，当与其野生型同窝幼畜相比时，用我们的最优化合物bt-11处理显著地降低疾病活动性指数评分(图24)。我们发现由于bt-11的作用在lancl2损失的情况下完全消除，故这些结果具有lancl2依赖性(图25)。
有趣地，当与在7周开始直到实验结束为止用媒剂处理的小鼠相比时，bt-11处理的小鼠中的重量损失得到明显改善(图26)。
bt-11在ibd过继转移慢性模型中减少脾脏、mln和结肠中的宏观病变。为了在慢性结肠炎第二模型中确认临床功效，我们在用bt-11处理和后续lancl2路径活化之后在用野生型或lancl2-/-细胞过继转移并用媒剂或bt-11处理的小鼠中评定宏观组织病变。在研究开始之后11周时，我们在安乐死和组织收集之后立刻对脾脏(图27，图a)、mln(图27，图b)和结肠(图27，图c)和回肠(图27，图d)进行宏观评分。用80mg/kg浓度的bt-11处理极大并显著地降低四种组织中的宏观评分，展现其强效功效。我们发现这些观察结果具有lancl2依赖性，以及lancl2损失完全消除bt-11的作用(图28)。
bt-11还在慢性结肠炎过继转移模型中改善组织病理学病变和炎症。与il-10-/-诱导的结肠炎实验类似并且为了用ibd第二小鼠模型确认肠道粘膜中的组织病理学病变和一般病理学，用h&e对结肠切片进行染色，并且在显微镜下观察。我们的结果基于结肠和回肠中的白细胞浸润(图29，图a和b)和粘膜增厚(图29，图e和f)的减少确认用bt-11处理如何显著地减少炎症。值得注意的是，回肠的上皮细胞侵蚀受影响较小(图29，图d)，但发现结肠中的侵蚀在用我们的最优化合物bt-11处理的小鼠中明显较低(图29，图c)。为了确认bt-11对lancl2的依赖性，我们执行过继转移研究，并且转移来自lancl2-/-供体的cd4+t细胞。我们的结果展示白细胞浸润、上皮细胞侵蚀和粘膜增厚的减少在lancl2-/-转移的接受体中如何得到极大消除(图30)。
bt-11在小鼠中不断地诱导极大的抗炎性反应并且下调促炎性介体。为了表征用bt-11对比媒剂处理的小鼠中的免疫细胞概况，我们在从结肠、脾脏和肠系膜淋巴结分离的细胞中执行流式细胞测量术分析。我们确认在ibd第二慢性小鼠模型中，用bt-11处理持续11周时段的接受体小鼠在结肠中具有明显较低的浸润性f4/80+cd11b+促炎性巨噬细胞水平(图31，图a)，以及基于对总cd45+白细胞所进行分析的ifnγ水平降低(图31，图b)。此外，用bt-11处理不断地通过促进局部炎症位点(在此情况下，结肠粘膜)处foxp3(图31，图c)和强效抗炎性细胞因子il-10(图31，图d)的表达来上调调节性cd4+t细胞。
与在结肠固有层细胞中所观察到的概况类似，我们表征诱导位点(如脾脏和mln)中的这些群体。免疫表型结果展示用bt-11处理也如何增加诱导位点(如脾脏和mln)中foxp3和il-10水平(图32，图a、b、d和e)。值得注意的是，bt-11处理在mln和脾脏两者中降低cd45+群体中ifnγ的表达(图32，图c和f)。
靶向lancl2的bt-11的作用不依赖于pparγ。基于我们的实验结果，lancl2的活化使过多的最终调节基于il-10的抗炎性反应的路径活化，所述抗炎性反应在系统水平中调节炎症。一种活化的lancl2下游路径是pparγ路径。为了帮助克服此核因子和转录因子二级活化的潜在毒理学问题，我们也用来自pparγ-/-供体的cd4+t细胞转移rag2-/-小鼠。我们接着用媒剂或80mg/kg的bt-11处理这些小鼠。我们的结果明确展现，bt-11经由lancl2活化对疾病活动性和组织病理学的有益作用以pparγ非依赖性方式进行(图33，图a-d)。这些结果展现，lancl2的活化也对调节lancl2活化抗炎作用的其它路径进行调节。
讨论
目前针对发炎性肠病(ibd)的疗法是适度成功的，并且对于长期控制所述疾病具有明显不利的副作用[17]。植物化合物脱落酸(aba)在结肠炎小鼠模型中发挥强效抗炎作用[22，23]。羊毛硫氨酸合成酶组分c样蛋白质2(lancl2)是用于aba结合和信号传导的标靶[15，19，24]。因此，lancl2已经作为针对炎症的有前景的新颖治疗标靶出现[18]。化合物61610(双(苯并咪唑基)对苯二甲酰苯胺，btt)鉴别为在具有数百万化学品的文库中以最高亲和力结合于lancl2。另外，61610在肠道炎症小鼠模型中发挥强效抗炎作用[25]。产生20个61610源性btt的专题文库，并且bt-11鉴别为最优示例性化合物。bt-11结合于lancl2，具有口服活性，已经在3种结肠炎小鼠模型中展现抗炎性功效和突出的安全概况。
根据美国克罗恩氏病和结肠炎基金会，ibd在北美困扰超过1百万人并且在世界范围困扰4百万人。此分布广泛并引起衰弱的病导致生活品质降低和大量卫生保健相关成本[26]。在美国，用于治疗ibd单次发作的平均医学费用超过每患者$55,000[27]，并且总费用超出每年$150亿。另外，间接费用包括治疗反复性胰脏炎[28]或其它ibd并发症的成本，所述并发症如脓肿、肠梗阻、贫血、血栓症、肛周病变、关节炎、葡萄膜炎、虹膜炎或皮肤病变[29]。ibd为患者带来大量负担，常常使其与社会隔绝，影响家庭关系并且限制其专业机会[17]。在此方面，ibd患者不参与劳动力的比率较高；此高比率随时间持续[30]。另外，肠炎症(溃疡性结肠炎(uc)和克罗恩氏病(cd))尤其在早龄期(年龄<30岁)增加发展出结肠癌的风险[31]。根据全球行业分析公司的新报告，预期全球ibd治疗剂市场到2015为止达到$43亿。
尽管目前用于ibd的治疗已经改进[17，32]，但其对于慢性控制疾病仅是适度成功的并且导致明显副作用，包括免疫系统进行针对病原体或恶性病的保护性免疫反应的能力减弱。用于患者的治疗选项包括解决炎症症状。当今市场上所用的大多数药理学治疗包括氨基水杨酸盐、皮质类固醇、免疫调节剂、抗生素、生物制剂(抗肿瘤坏死因子-α抗体)。氨基水杨酸盐极其有效并且一般耐受良好。然而，具有复发或更中度疾病的患者可能需要更积极的治疗，其包括短期剂量的皮质类固醇持续较短时段以控制症状。此类型的快速起作用的疗法无法得到长时段耐受。为了维持病状，免疫调节剂也常用于cd和uc中，但其具有较慢起始作用时间(对于完全作用，3到6个月)。这些药剂具有潜在地明显不利副作用，介于从胰脏炎到糖尿病到有疤痕肝脏和发炎肺范围内。对于未能用其它疗法的控制的中度到重度疾病病例，将对患者使用抗tnf-α，其以受控设定每6-8周静脉内给予。此极其昂贵疗法尽管有效，但由于投药需要熟练技术人员和临床环境而难以使用。此外，存在明显副作用，如库欣氏综合征、躁症、失眠、高血压、高血糖、骨质疏松、恶性病、感染以及长骨无血管坏死。
示例性化合物bt-11已经展示极其安全的毒理学概况。我们在ibd慢性模型中的功效数据展示bt-11处理如何在两个慢性ibd模型中改善疾病活动性评分(图18和24)以及体重损失(图26)。我们的数据展现这些效果如何具有lancl2依赖性(图25)我们的功效数据也展现通过bt-11的lancl2路径活化促进主要由以下表征的抗炎性反应：il-10产生性和foxp3表达性cd4+t细胞(图21、22、31和32)以及发炎性巨噬细胞、树突状细胞和促炎性因子(如ifnγ)的显著减少(图22、23、31和32)。此外，基因表达分析通过展示用bt-11处理如何降低结肠中的tnfα水平(图23)来确认这些基于细胞的发现。所有这些发现在一起在两个慢性ibd模型中在白细胞浸润、上皮细胞侵蚀和粘膜增厚方面造成结肠粘膜中剧烈的lancl2依赖性改善(图20、29和30)。我们也已经展现，bt-11在结合于lancl2后的作用是pparγ非依赖性的(图33)。这些结果确认lancl2的活化使过多的下游活化子活化，所述活化子经由pparγ非依赖性机制调节炎症。在一起，这些结果强有力地支持以下事实：lancl2是用于发炎性疾病的新颖治疗标靶，并且bt-11适用作新药物。
实例22：bt-11治疗1型糖尿病(t1d)的用途
介绍
糖尿病(diabetesmellitus，dm)(也简单称为糖尿病(diabetes))是在长期时间段存在高血糖水平的一组代谢疾病。两种类型的糖尿病被称作1型和2型。这些病状以前的名称是胰岛素依赖性和非胰岛素依赖性糖尿病，或幼年期发作和成年期发作糖尿病。在t1d中，身体不产生胰岛素。关于t2d，t1d完全不如t2d常见。实际上，大致10％的所有糖尿病病例是1型。t1d困扰3百万美国人。每年，在美国有超过15,000名儿童和15,000名成人诊断为患有t1d。估计世界范围内14岁以下儿童当中的t1d发生率每年增加3％。t1d患者需要胰岛素注射以保持存活，但其不治愈疾病或预防其严重副作用。
目前的抗糖尿病药剂有效改善胰岛素敏感性，但其慢性投药具有明显副作用，如心血管并发症、肝毒性、重量增加、液体潴留和膀胱肿瘤。羊毛硫氨酸合成酶组分c样2(lancl2)路径发挥抗糖尿病作用而不具有副作用[18]。bt-11结合于lancl2，具有口服活性，已经展现小鼠中的抗糖尿病功效和突出的安全概况。
方法
小鼠。nod小鼠购自jacksonlaboratory，并且在特定无病原体条件下收容于通风架中。小鼠维持在动物设施中。所有实验方案都由机构动物照护与使用委员会批准，并且符合或超出美国国家卫生研究院实验室动物福利和公共卫生服务办公室政策的指导原则。
体重和葡萄糖耐量的评定。在研究开始之前，确定所有小鼠为血糖量正常的(空腹血液葡萄糖水平低于250mg/dl)，并且具有类似重量(20±1.5g)。每周对小鼠进行称重，并且由不知情的观察者检查疾病临床征象。在标准12小时禁食之后，使用
组织病理学。将来自小鼠中nod研究的胰脏切片固定在10％缓冲中性福尔马林中，稍后嵌入于石蜡中，并且接着切片(5μm)并用h&e染色剂染色以用于组织学检查。取决于淋巴细胞浸润、细胞损伤和组织侵蚀，用0-4的评分对切片进行分级，并且分析数据作为归一化的混合评分。
统计分析。使用anova后接雪费多重比较法来分析参数数据。通过使用曼-惠特尼u测试后接邓恩多重比较测试来分析非参数数据。通过使用sas版本6.0.3(sasinstitute)的一般线性模型程序来执行anova。以p≤0.05评定统计显著性。
结果
bt-11在1型糖尿病小鼠模型中降低空腹血液葡萄糖水平并且增加胰岛素。
为了测定bt-11在t1d小鼠模型中调节血糖水平的作用，我们在研究开始之后第0、1、3、4、5、10和11周执行空腹血液葡萄糖测试。我们的结果展示用我们的化合物bt-11处理的小鼠在禁食12小时时段之后如何具有明显较低的血液中葡萄糖水平(图34，图a)。并行地，我们在第5周评定胰岛素水平，并且我们的结果展示用bt-11处理的小鼠如何具有明显升高的血浆胰岛素水平(图34，图b)。
bt-11改善小鼠nod模型中的临床组织病理学胰脏病变和炎症。为了评定t1d小鼠模型中的组织病理学病变，收集胰脏并且用10％福尔马林固定。接着用h&e对胰脏切片进行染色，并且在显微镜下观察。我们的结果展示，当与媒剂处理的小鼠相比时，用bt-11处理如何显著地减少胰脏中的临床组织病理学病变(图35)。
讨论
需要用于1型糖尿病(t1d)的有效并安全的口服药剂，所述t1d是困扰超过3百万美国人的疾病。aba处理发挥抗糖尿病作用[2]。羊毛硫氨酸合成酶组分c样蛋白质2(lancl2)是用于aba结合和信号传导的标靶[15，19，24]。因此，lancl2已经作为针对炎症的有前景的新颖治疗标靶出现[18]。aba有效改善糖尿病[2，33]和免疫介导疾病，如发炎性肠病(ibd)[22，23]。化合物61610(双(苯并咪唑基)对苯二甲酰苯胺，btt)在具有数百万化学品的文库中以最高亲和力结合于lancl2。另外，61610在肠道炎症小鼠模型中发挥强效免疫调节作用[25]。bt-11在nod小鼠中发挥抗糖尿病作用(图34和35)。此外，aba增加人类胰脏β-细胞中的胰岛素分泌[34]，表明aba作为1型糖尿病(t1d)治疗的潜在应用。
在免疫细胞中，aba由lancl2识别，所述lancl2是在豆蔻酰化后与细胞膜缔合的g蛋白偶合受体[19，35]。结合于lancl2的aba增加camp并且引发经由pka的信号传导，并且调节巨噬细胞和t细胞中的免疫反应[8]。我们通过使用lancl1晶体结构作为模板来执行同源性模型化以构筑lancl2的三维结构。使用分子对接，第一计算机模拟并且接着体外展现aba结合于lancl2。由spr结果和与人类lancl2的结合分析验证此计算预测[35]。我们使用经由同源性模型化而获得的lancl2结构执行基于lancl2的虚拟筛选以发现新lancl2配位体。用autodock将来自ncidiversitysetii、chembridge和zinc天然产物数据库的化合物对接到lancl2模型中，并且通过亲和力计算值来定级。虽然aba对lancl2具有高亲和力，但也预测其它含二烯天然化合物(如61610)结合在相同区中并且也可以成为lancl2结合性药物[12]。bt-11还展现强结合于lancl2和在t1d的nod小鼠模型中的治疗功效(图34)。此数据提供lancl2路径和其它本发明化合物适用作用于t1d的免疫调节药物的一定验证。支持lancl2路径作为调节免疫反应并改善自身免疫性疾病手段的作用的进一步证据包括aba[22，23]、61610[12，18]和bt-11在发炎性肠病(ibd)小鼠模型中的lancl2结合和保护性作用。
t1d的发生率在世界范围内以每年3％的估计速率增加[36-38]。虽然成功移植胰脏胰岛可以治疗t1d，但缺乏足够胰岛、进行中的免疫介导的移植胰岛破坏和免疫抑制药物的副作用极大地限制此方法的广泛使用[39]。因而，安全地组合促进胰脏β-细胞功能与免疫调节的能力的疗法是治疗t1d的基本策略。我们的数据展现，由bt-11使lancl2活化不仅改善血液中的葡萄糖水平，而且还改善其在葡萄糖攻击之后的正常化(图34)。此外，在t1d发作期间用bt-11处理改善胰脏中的组织病理学(图35)。实际上，aba预防性地并且治疗性地遏制炎症并改善葡萄糖耐量[2，3]。因此，lancl2的天然活化引起如由其在ibd中的治疗作用所说明的免疫调节[12，18，22，23]和葡萄糖稳态调节，其归因于炎症遏制和胰岛素敏感性增强[2，3]。基于此背景以及在图34和35中所呈现的数据，对lancl2作为t1d治疗标靶的作用的研究是至关重要的。
实例23：bt-11治疗2型糖尿病(t2d)的用途
介绍
糖尿病(dm)是当身体无法产生足够胰岛素或无法有效使用胰岛素时发生的慢性病状，并且由遗传倾向性与环境因素偶合诱导。不同于患有1型糖尿病的人，2型糖尿病能够产生胰岛素。然而，此类患者的胰脏不制造足够的胰岛素，或身体无法足够充分地使用胰岛素。此现象称作胰岛素抵抗。当不存在足够胰岛素或胰岛素不以其应使用的方式使用时，葡萄糖无法得到加工和使用。因此，当葡萄糖在血流中积聚而非进入细胞中并得到代谢时，系统中的其它细胞无法正确起作用。实际上，高血糖症和糖尿病是发病和死亡的重要原因，这归因于心血管疾病(cvd)、肾病变、神经病变、足部溃疡和视网膜病变。
约2830万美国人患有2型糖尿病(t2d)，并且超过40.1％的中年人患有前驱糖尿病，所述前驱糖尿病是特征在于葡萄糖耐量异常、全身性炎症和胰岛素抵抗的病状。世界卫生组织估计到2030年为止患有t2d的人数到将增加到3亿6600万。
如上文所陈述，目前的抗糖尿病药剂有效改善胰岛素敏感性，但其慢性投药具有明显副作用，如心血管并发症、肝毒性、重量增加、液体潴留和膀胱肿瘤。羊毛硫氨酸合成酶组分c样2(lancl2)路径发挥抗糖尿病作用而不具有副作用[18]。bt-11结合于lancl2，具有口服活性，已经展现小鼠中的抗糖尿病功效和突出的安全概况。
方法
小鼠和膳食治疗。c57bl/6和db/db小鼠购自jacksonlaboratory，并且在特定无病原体条件下收容于通风架中。向膳食诱导肥胖糖尿病模型(dio)中的小鼠喂食高脂肪膳食(40kcal％脂肪)。小鼠维持在动物设施中。所有实验方案都由机构动物照护与使用委员会批准，并且符合或超出美国国家卫生研究院实验室动物福利和公共卫生服务办公室政策的指导原则。
体重和葡萄糖耐量的评定。在研究开始之前，确定所有小鼠为血糖量正常的(空腹血液葡萄糖水平低于250mg/dl)，并且具有类似重量(重量±1.5g)。每周对小鼠进行称重，并且由不知情的观察者检查疾病临床征象。在标准12小时禁食之后，在不同天测定葡萄糖。简言之，经由侧尾静脉收集血液，并且放到毛细血管血液收集试管上。接着通过腹膜内注射d-葡萄糖(每千克体重2g)向小鼠投与葡萄糖耐量测试，并且在注射之前(时间0)(对应于在上午6点开始12小时禁食后的基线fbg水平)和在葡萄糖注射后15、60和90分钟时(db/db模型)或15、30、60、90、120、180、220和265分钟时(dio模型)收集血液样品。接着切除腹部(附睾)白色脂肪组织(wat)、皮下wat和肝脏，并且进行称重。随后对腹部(附睾)wat进行消化和分级分离。
白色脂肪组织的消化。切除腹部wat，称重，剁碎成<10mg的小片，并且放到消化培养基(补充有2.5％hepes(弗吉尼亚州赫恩登(herndon,va)的mediatech)和10％胎牛血清的含有ii型胶原蛋白酶(0.2％，西格玛-奥德里奇公司)的1×hbss(mediatech))中。将样品在37℃培育箱中培育30分钟，经由100μm尼龙细胞过滤器过滤以去除未消化的粒子，并且在4℃下以1000×g离心10分钟。用1×hbss洗涤由基质血管细胞(svc)组成的小球，并且在4℃下以1000×g离心10分钟。弃去上清液，并且通过在2ml红细胞溶解缓冲液中培育svc持续2分钟来溶解红细胞，随后用9ml1×pbs停止反应。接着将细胞在4℃下以1000×g再次离心10分钟，悬浮于1ml1×pbs中，并且用库尔特计数器(加利福尼亚州富勒顿的贝克曼库尔特公司(beckmancoulter,fullerton,ca))来计数。
对基质血管细胞进行免疫表型。对于免疫表型，以2×105个细胞/孔将svc接种到96孔板(costar)中。在用fcblock(20μg/ml；bdbiosciences-pharmingen)培育初始20分钟以抑制非特异性结合之后，在含有5％血清和0.09％叠氮化钠的pbs(facs缓冲液)中洗涤细胞，并且用特异性原代抗小鼠抗体染色。用facsaria流式细胞仪计算流动结果，并且用facsdivatm(bdbiosciences)和flowjo(treestar)执行数据分析。。
实时定量pcr。根据制造商说明书使用rneasy脂质迷你试剂盒(qiagen)从脂肪组织和使用rneasy迷你试剂盒(qiagen)从细胞分离出总rna。总rna用于使用qscripttmcdna合成试剂盒(马里兰州盖瑟斯堡(gaithersburg,md)的quantabiosciences)来产生互补dna(cdna)模板。总反应体积是20μl，其中在mjminitm热循环仪(bio-rad)中如下培育反应物：在25℃下5分钟，在52℃下30分钟，在85℃下5分钟，保持在4℃下。用minelutepcr纯化试剂盒(qiagen)来纯化每一基因扩增子，并且在琼脂糖凝胶上通过使用dna质量序列梯(普洛麦格公司)来定量。这些经过纯化的扩增子用于在实时pcr分析中对实时pcr条件进行优化。对于每一引物集合，使用系统梯度方案对引物浓度和粘接温度进行优化以用于cfx系统(bio-rad)在优化期间并且还在样品dna实时pcr期间，对每一引物集合维持pcr效率介于92％与105％之间并且相关系数高于0.98。使用δδct量化方法展示数据。
结果
bt-11在t2d小鼠dio模型中降低空腹血液葡萄糖水平。为了评定示例性化合物bt-11在t2d模型中的功效，我们向c57bl/6小鼠喂食高脂肪膳食(dio模型)。在高脂肪喂食第12周时，在经过bt-11处理的小鼠中，当与其媒剂处理的同窝幼畜相比时，口服bt-11投药显著地降低血液葡萄糖水平(图36，图a)。此外，在12小时禁食和经由ip以每千克体重2g进行葡萄糖攻击之后，用bt-11处理的小鼠能够比未经处理的小鼠快得多地使血液葡萄糖水平正常化(图36，图b)。
bt-11处理减少白色脂肪组织中的促炎性巨噬细胞浸润以及促炎性粒细胞。为了表征浸润白色脂肪组织的细胞，如方法部分中所指定，收集腹部wat并进行消化。执行流式细胞测量术分析以评估wat中的不同促炎性群体。我们的结果展示用bt-11处理如何显著地降低f4/80+cd11b+促炎性巨噬细胞的水平(图37，图a)以及具有高水平ly6c的促炎性粒细胞(gr1+ly6c高)的数目(图37，图b)。
bt-11在t2d小鼠db/db模型中降低空腹血液葡萄糖水平。为了评估口服bt-11处理在两个糖尿病小鼠模型中的治疗功效，我们还使用db/db小鼠，其由于瘦素受体中的突变而发展出自发性t2d。通过经口管饲向db/db小鼠投与80mg/kg日剂量的bt-11。我们通过测量空腹血液葡萄糖浓度来测定bt-11对葡萄糖稳态的作用。与其媒剂处理的同窝幼畜相比，用bt-11处理早在一周内就显著地降低血液葡萄糖水平，在第3周使随时间的差异更突出(图38，图a)。为了确定口服bt-11处理是否调节动物如何引发葡萄糖稳态，我们向实验动物给予腹膜内葡萄糖攻击，并且评估葡萄糖注射后0到265分钟时的血浆葡萄糖动力学。在注射之前(时间0)(对应于12小时禁食后的基线fbg水平)收集血液样品。我们的结果展示在ip葡萄糖攻击之前(时间0，图38，图b)用bt-11口服处理如何显著地降低葡萄糖水平。在于db/db模型中进行葡萄糖攻击后，我们的结果展示用我们的最优化合物bt-11处理的小鼠中的葡萄糖水平如何比媒剂处理的小鼠更快速地落到正常水平(图38，图b)。
bt-11降低tnfα和mcp-1的mrna水平并且上调lancl2。为了进一步确认bt-11的抗炎性效力，如方法部分中所指示，我们评定wat上的基因表达。我们的结果展示当与未经处理的小鼠相比较时，用bt-11处理的小鼠如何具有更高的lancl2表达水平并显著地降低促炎性因子tnfα和mcp-1的mrna水平(图39)。
讨论
随着肥胖和2型糖尿病(t2d)在美国的比率持续上升，越来越多的人变得依赖于口服抗糖尿病药物。约2830万(群体的8.3％)美国人患有t2d，并且超过40.1％的中年人患有前驱糖尿病，所述前驱糖尿病是特征在于葡萄糖耐量异常和胰岛素抵抗的病状[40]。在美国，可归因于t2d的总直接和间接成本超过$1320亿[40]。尽管具有此增长中的问题，但药物制造商尚不能研发出安全并且有效的药剂。最受欢迎和有效的口服抗糖尿病药剂中的一种是噻唑烷二酮(tzd)类别的胰岛素敏化药。尽管tzd增强胰岛素敏感性，但其具有限制其可用性的明显不利副作用，包括重量增加、充血性心力衰竭、膀胱癌、肝毒性和液体潴留[41，42]。举例来说，大致10％-15％的使用tzd的患者由于水肿而强制停止治疗，并且来自过量液体潴留的细胞外体积增加也成为患有先前存在的充血性心力衰竭的个体中的主要问题。在2000年，在曲格列酮
lancl2是待鉴别的lanc样蛋白质家族的第二成员。第一成员lancl1是从人类红细胞膜中分离的[44]。随后鉴别lancl2并且在整个身体[1，18]中表达，包括免疫细胞、胰脏、肺和肠[1，44]。羊毛硫氨酸合成酶c样2(lancl2)路径作为用于t2d的新颖治疗标靶出现[18]。大量的临床前测试提供lancl2配位体(如脱落酸(aba))在糖尿病和慢性发炎性疾病中治疗潜能的充分证据[2，3，22，23，45]。化合物61610(双(苯并咪唑基)对苯二甲酰苯胺，btt)在具有数百万化学品的文库中以最高亲和力结合于lancl2。
鉴于目前用于t2d的药物未能在无副作用的情况下满足患者第一需要(即葡萄糖控制)的事实，bt-11代表极有吸引力的潜在取代。我们的结果展示在不同的t2d小鼠模型中投与bt-11如何在禁食时段之后显著地降低血液中的葡萄糖水平(图36和38)。此外，投与此化合物也有助于在葡萄糖攻击之后使葡萄糖水平正常化(图36和38)。bt-11的抗炎特性也反映在我们的免疫表型结果中。实际上，投与bt-11引起腹部wat中促炎性巨噬细胞和促炎性粒细胞的更少浸润(图37)。这些结果由两种极重要促炎性因子tnfα和mcp-1的基因表达数据支持，发现所述促炎性因子在用bt-11处理的小鼠中显著地减少(图39)。
实例24：bt-11在流感感染期间的用途
介绍
造成肺炎的呼吸道病原体是工业化国家中传染性疾病相关死亡的首要原因。有效疫苗和抗病毒剂的不存在与增长中的对抗病毒抗性出现的关注偶合，强调需要研发靶向宿主的免疫治疗方法。与呼吸道感染相关联的肺部致病机制和临床疾病常常由病毒的致细胞病变作用与宿主免疫反应的组合产生。在此方面，考虑将针对调节先天性免疫反应的疗法用于治疗流感[46]。
流感仍是世界范围内主要的公共健康问题。季节性流感与常常失能的上呼吸道过程相关联，并且需要数天受约束的活动。据估计单独在美国，每年流感流行导致3000万人门诊访问和300,000人住院。某些群体(例如，幼儿、老年人和具有易感染医学病状的人)具有更高的发展出病毒性肺炎的风险。专家已经估计，在美国中每年25,000到35,000人因季节性流感而死亡，并且全球财政负担已计算为数千亿美元[47]。流感大流行周期每30-50年发生一次，其中由于其不可预测表现和缺乏预先存在的免疫性而增加复杂性，并且与高死亡率相关联[48]。流感与较高发病率和死亡率相关联，但缺乏有效和安全的药物治疗。
数据表明羊毛硫氨酸合成酶组分c样蛋白质2(lancl2)是用于aba结合和信号传导的标靶[15，19，24]。因此，lancl2已经作为有前景的用于免疫调节的新颖治疗标靶出现。使用分子模型化和表面等离子共振(spr)，bti鉴别化合物bt-11(双(苯并咪唑基)对苯二甲酰苯胺，btt)，其以高亲和力结合于lancl2。另外，bt-11在肺中发挥强效促消肿(pro-resolutive)作用，并且在流感小鼠模型中降低死亡率和发病率。
方法
小鼠。c57bl/6小鼠购自jacksonlaboratory，并且在特定无病原体条件下收容于通风架中。所有实验方案都由机构动物照护与使用委员会批准，并且符合或超出美国国家卫生研究院实验室动物福利和公共卫生服务办公室政策的指导原则。
用流感病毒对小鼠进行鼻内感染。使用气化器台用2％-5％异氟醚对小鼠进行麻醉，经由鼻孔投与50μl103tcid50的病毒稀释液(每个25μl)。接着将小鼠放在其笼中，并且监视麻醉恢复。
通过口胃管饲经口投与bt-11。使用可商购的安全球镶尖的管饲针(18-24规格，取决于动物重量)通过口胃管饲向小鼠投与bt-11。此程序不造成疼痛或痛苦。以80mg/kg剂量用bt-11处理小鼠，每24小时一次持续实验时长。
监测小鼠和疾病活动性以及称重。在感染之后每日一次监测小鼠(或如果其发展出等效于疾病评分2的严重疾病临床征象，则每4小时监测一次)，并且如果其发展出明显病征，则在规划终点之前进行安乐死，所述病征如通过重量损失(即，逐渐损失25％初始体重)、脱水、运动性损失、疼痛区域的防护/保护、乱毛(竖毛)所测量。一天一次对小鼠进行称重持续实验时长。
结果
经口投与bt-11在具有流感病毒的小鼠中降低临床评分和发病率。
为了评估bt-11的治疗功效，我们在小鼠中使用流感感染小鼠模型。简言之，在用5％异氟醚麻醉之后，对小鼠进行鼻内感染。每日以80或40mg/kg用bt-11口服悬浮液处理小鼠。对小鼠进行称重和评分持续实验时长(16天)。结果展示投与bt-11如何在第3天开始并在整个实验中显著地降低活动性(图40，图a)。此外，在接受40和80mg/kgbt-11处理的小鼠中，物理外观的临床评分显著地降低(图40，图b)。
为了评估处理在疾病发病率中的作用，我们计算重量损失百分比，并且进一步评估每一实验组内损失超过15％的小鼠数目。在感染后第6天开始，当与媒剂组相比时，用80mg/kgbt-11处理引起更小发病率。差异在第10天开始突出，并且持续到第12天(图40，图c)。
讨论
控制流感扩散和疾病的传统方法以经由疫苗接种和抗病毒治疗的病毒侧面为中心。疫苗必须每年基于前一季的流行菌株来调配。然而，不论新型疫苗是用于季节性流感还是大流行性流感，生产、得到许可和测试其功效需要约4到6个月[49]。抗病毒剂的主要缺点是抗性菌株的极频繁出现和选择。除以病毒为中心的治疗以外，基于控制加重的宿主反应的疗法发展有极高可能性用于补充抗微生物和预防策略。靶向宿主的治疗剂具有在不同杂交情况下提供交叉保护的优点，并且因此每季有效，其可以生产并储备，并且可以用于在病毒暴露之后治疗疾病[46，50，51]。
将lancl2鉴别为用于流感的新颖治疗标靶为靶向宿主的治疗剂开辟了一条新途径。我们展现通过bt-11对lancl2进行活化不仅改善活动性和临床评分，而且还降低由流感病毒造成的发病率，并且促进从流感感染恢复(图33)。这些结果强有力地支持lancl2是用于流感的新颖治疗标靶并且bt-11是靶向宿主的潜在新药物。
参考文献
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