用于快速鉴定产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的引物及检测方法与流程

本发明属于检验检疫领域，特别涉及用于快速鉴定产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的引物及其检测方法。

背景技术：

蜡样芽胞杆菌(bacilluscereus)是一种可引起食物中毒的常见食源性致病菌。食用了被蜡样芽胞杆菌污染的食品易引发腹泻和呕吐，导致食物中毒，甚至会引发心内膜炎、脑膜炎和菌血症等疾病。蜡样芽胞杆菌可导致腹泻型和呕吐型两种不同类型的食物中毒，分别由其产生的腹泻毒素(肠毒素)和呕吐毒素引起。据报道，当被污染的食品中蜡样芽孢杆菌数量超过10⁵cfu/g可能导致食物中毒甚至死亡。

国外蜡样芽胞杆菌引起的食物中毒事件频发。1950年在挪威发表了第一起蜡样芽胞杆菌食物中毒的报告，之后许多国家，尤其是欧洲一些国家相继报告了类似食物中毒的爆发。蜡样芽胞杆菌已被挪威和荷兰认定为食品中最容易检出的病原微生物。我国在上世纪70年代确认蜡样芽胞杆菌中毒事件后，此类中毒事件的报道逐年增多。据2008-2015年我国国家食源性疾病监测网统计资料显示，微生物性食源性疾病占比39％，居首位，其中蜡样芽胞杆菌引起的中毒事件占17％，在细菌性病原体中排在第三，危害极为严重。在我国由蜡样芽胞杆菌引发的食品中毒主要是由呕吐毒素引起的(约占75％)。因此，蜡样芽胞杆菌尤其是呕吐型菌株的快速检测尤为重要。

我国目前检测蜡样芽胞杆菌的方法是食品安全国家标准食品微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验(gb4789.14—2014)。主要分为以下几步：增菌、分离培养、镜检、生化鉴定、生化分型。而对于分离的蜡样芽胞杆菌主要是采用pcr的方法鉴定其是否是呕吐毒株(呕吐毒素基因存在与否)。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)作为一种新兴的检测方法，一经报道就受到各国学者的广泛关注。lamp方法与pcr技术相比，检测时间短，具有更高的灵敏度和特异性，操作简单，仅仅需要普通水浴锅就可以完成检测。在食源性致病菌方面，目前已经建立了副溶血性弧菌(vibrioparahaemolyticus)、沙门氏菌(salmonellaspp.)和蜡样芽胞杆菌等致病菌的lamp技术，但没有产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌lamp的报道。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供用于快速鉴定产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的引物。

本发明以产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌基因cesb为靶基因，设计lamp反应特异性引物，构建lamp反应体系，建立一种更为特异、灵敏的快速鉴定技术，为卫生检验和食品质量安全提供技术保障，提高我国公共卫生控制水平。

本发明另一目的在于提供一种采用上述引物以lamp法快速鉴定产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的检测方法。

本发明再一目的在于提供上述检测方法的应用。

本发明的目的通过下述方案实现：

用于快速鉴定产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的引物，包括上游外引物f3、下游外引物b3、上游内引物fip和下游内引物bip，序列如下所示：

f3：5’-ctacaacaattttctgcaaagt-3’

b3：5’-agccaagtgaagaataccat-3’

fip：5’-tgtaattcctctaatgacgcaagatatttattgtaggaagaacagca-3’

bip：5’-tgttcactatatcgatggggaccctgtcccccaaatctctt-3’。

本发明还提供了一种基于上述引物的检测方法，包括以下步骤：

以待检测样本的dna为模板，利用上述引物进行lamp反应扩增，再通过荧光染料目测观察法进行检测。

所述lamp反应体系优选为：25μl，其中f3与b3分别为0.1-0.3μmol/l，fip与bip分别为1.2-2.0μmol/l，2.5μl1×thermopol反应缓冲液，1.2-2.0mmol/ldntps，2-10mmol/lmgso4，0.5-1.5mol/l甜菜碱，8ubstdna聚合酶，10-100ngdna模板，不足部分用无菌双蒸水补足；lamp反应条件为在60-65℃孵育45-60min。

所述lamp反应体系更优选为：25μl，其中f3与b3分别为0.2μmol/l，fip与bip分别为1.6μmol/l，2.5μl1×thermopol反应缓冲液，1.6mmol/ldntps，6mmol/lmgso4，1mol/l甜菜碱，8ubstdna聚合酶，50ngdna模板，不足部分用无菌双蒸水补足。

所述荧光染料目测观察法：在lamp反应的最终扩增产物中加入1μl显色剂，所述显色剂为sybrgreenⅰ，观察结果进行判断。显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性。

本发明检测方法结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高，适用于产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的快速可靠的检测和鉴定，为卫生检验和食品质量安全提供技术保障，提高我国公共卫生控制水平。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

1、结果可靠：本发明的lamp引物及lamp反应体系，已经对含产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的样本进行了多次重复验证，结果可靠。

2、特异性强：本发明的lamp引物是针对产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌基因cesb设计出4条特异性引物，样本区域与引物不匹配不能进行核酸扩增，故特异性高。

3、灵敏度高：本发明的lamp检测方法对产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的检测灵敏度可达到0.0124ng/25μl。

4、操作简便快速：应用本发明方法，对含产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌样本进行快速检测，且lamp核酸扩增是在等温条件下进行，不需要复杂的仪器设备和昂贵的分子试剂，结果肉眼直接可见。

附图说明

图1为产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的荧光检测结果。

图2为产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的灵敏度检测结果。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中涉及的物料若无特殊说明均可从商业渠道获得。所述方法若无特别说明均为常规方法。其中，bstdna聚合酶购自国neb公司；dntps试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司。菌株可购自atcc(美国菌种保藏中心)、cmcc(中国医学细菌菌种保藏管理中心)和nctc(国家标准菌库(英国))、gdmcc(广东省微生物菌种保藏中心，gim编号)。

实施例1：产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌lamp引物设计

根据产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌特异性靶基因，从ncbi数据库下载该基因的序列，分析比对找出特异序列，利用专门设计lamp引物的设计软件primerexplorerversion4设计lamp反应的引物。使用dnaman，primerpremier5.0、rnastructure等软件对产生的备选引物的二级结构进行分析挑选，注意引物之间的距离、引物退火温度值的高低、引物长度和gc/at含量等综合因素，设计出一套lamp检测引物，包括上游外引物f3、下游外引物b3、上游内引物fip和下游内引物bip，引物序列分别为：

f3：5’-ctacaacaattttctgcaaagt-3’

b3：5’-agccaagtgaagaataccat-3’

fip：5’-tgtaattcctctaatgacgcaagatatttattgtaggaagaacagca-3’

bip：5’-tgttcactatatcgatggggaccctgtcccccaaatctctt-3’。

实施例2：lamp快速检测体系的建立及产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌lamp引物的特异性检测

(1)菌株培养

将待鉴定菌株接种至在胰蛋白胨肉汤tsb培养(其中，副溶血性弧菌在3.5％氯化钠营养肉汤)，36℃±1℃培养16-18h。

(2)细菌dna的提取

取1ml细菌培养物于12000r/min离心5min，弃上清，收集菌体；加入50μl的te缓冲液充分悬浮混匀，于100℃水浴10min，冰浴3min，12000r/min离心5min，取上清备用。

(3)lamp反应体系的建立

lamp反应体系：25μl，其中f3与b3分别为0.2μmol/l，fip与bip分别为1.6μmol/l，2.5μl10×thermopol反应缓冲液，1.6mmol/ldntps，6mmmol/lmgso4，1mol/l甜菜碱，8ubstdna聚合酶，3μl步骤(2)制备得到的待鉴定菌株模板dna，不足部分用无菌双蒸水补足；lamp反应条件为在60-65℃孵育45-60min，80℃终止反应1-2min。

(4)显色剂观察

在反应管中加入1μl显色剂，显色剂为sybrgreenⅰ，显色结果观察到绿色荧光，直接用肉眼观察颜色变化，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，鉴定为产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌；橙色则判断为阴性。本发明针对数十株菌株进行检测，结果如表1和图1所示。

表1特异性试验所用菌株及实验结果

备注：结果表述为“阳性菌株数/所测菌株数”。

图1中，a试剂阴性对照，b为蜡样芽胞杆菌，c为产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌nctcf4810/72，d为产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌3733-2c-bc(详见front.microbiol.,26march2018：00533)。由图1可见，产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的显色结果可观察到绿色荧光，蜡样芽胞杆菌的显示结果为橙色。由表1可见，除了产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的显色结果可观察到绿色荧光，为阳性结果，其他菌株(苏云金杆菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌等)的显示结果均为橙色，为阴性结果。这说明本发明设计的lamp引物对于产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌具有高特异性，可被用于产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌快速可靠的检测和鉴定。

实施例3：lamp引物对产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的灵敏性检测

将产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌f4810在胰蛋白胨肉汤tsb增菌液中37℃培养16-18h后，取1ml菌液，用东盛生物科技有限公司的dna抽提试剂盒进行抽提，用酶标仪测定dna的浓度为124ng/μl，作为母液。采用10倍浓度系列稀释法将其稀释成12.4ng/25μl，1.24ng/25μl，0.124ng/25μl，0.0124ng/25μl共4个不同浓度梯度。

lamp反应体系的建立：25μl，其中f3与b3分别为0.2μmol/l，fip与bip分别为1.6μmol/l，2.5μl10×thermopol反应缓冲液，1.6mmol/ldntps，6mmmol/lmgso4，1mol/l甜菜碱，8ubstdna聚合酶，25ng上述dna模板，不足部分用无菌双蒸水补足；lamp反应条件为在60-65℃孵育45-60min，80℃终止反应1-2min。在lamp反应的最终扩增产物中加入1μl显色剂，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性。结果见图2。

检测结果：由图2可见，本发明检测方法的检测灵敏度可达0.0124ng/25μl，具有显著提高的灵敏度。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>广东岭南职业技术学院

<120>用于快速鉴定产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的引物及检测方法

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>f3

<400>1

ctacaacaattttctgcaaagt22

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>b3

<400>2

agccaagtgaagaataccat20

<210>3

<211>47

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>fip

<400>3

tgtaattcctctaatgacgcaagatatttattgtaggaagaacagca47

<210>4

<211>41

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>bip

<400>4

tgttcactatatcgatggggaccctgtcccccaaatctctt41