一种美彩按蚊、多斑按蚊和乌头按蚊多重PCR检测试剂盒的制作方法

本发明涉及一种多重pcr同时检测美彩按蚊、多斑按蚊、乌头按蚊的试剂盒。

背景技术：

按蚊(anopheles)属昆虫纲双翅目蚊科按蚊属，已知约450种及亚种，分为6个亚属，呈世界性分布，主要分布在热带地区。按蚊雌虫吸取人、畜的血，可传播疟原虫、丝虫病等疾病，根据世界卫生组织的报告，2016年全球发生2.16亿例疟疾，44.5万人死于疟疾，受到淋巴丝虫病威胁的人数高达8.93亿，约4000万人被疾病毁容和丧失劳动力。

随着自然条件的变化和国际交通、贸易、旅游业的发展，蚊虫及其携带的病原体可借助交通工具、集装箱、货物、邮件等在国际间传播，使原本局限在一定范围内的虫媒传染病突破国境或自然地理的界限，在全球范围内广泛传播与流行，对输入国的卫生安全造成极大的威胁。因此，蚊类及其传播疾病的监测，对保障口岸地区的卫生安全，预防和控制虫媒传染病传入、传出具有重要意义。

现阶段对按蚊的鉴定，主要依靠形态学鉴定，其结果准确性难以保证，且对于残缺样本和非成虫期的样本，形态学无法鉴定；分子标记的方法耗时长成本高，对人员和设备的要求也较高。多重pcr技术是在一个反应体系中同时扩增多个目标序列，具有用时短、操作简单、准确性高和特异性强的优点。因此，迫切需要建立一种能快速准确鉴定美彩按蚊、多斑按蚊和乌头按蚊的多重pcr检测试剂盒。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种用于鉴定美彩按蚊、多斑按蚊和乌头按蚊多重pcr检测试剂盒及制备方法，具有较高的特异性和敏感性，可在较短时间内测出结果，无需测序，大大节约成本。

本发明提供了美彩按蚊、多斑按蚊、乌头按蚊的特异性引物序列，具体如下：

1)美彩按蚊：扩增目的片段66bp

f3：5’-atcctgttcctgctccat-3’(seqidno.5)

r3：5’-cttcctccctcattaactttac-3’(seqidno.6)

2)多斑按蚊：扩增目的片段135bp

f7：5’-agaggaggatataccgttca-3’(seqidno.13)

r7：5’-aggagcaccagatatagca-3’(seqidno.14)

3)乌头按蚊：扩增目的片段299bp

f13：5’-catgtgcaataccagaagaa-3’(seqidno.25)

r13：5’-agaattaggtcatccaggag-3’(seqidno.26)

本发明还提供了一种用于鉴定美彩按蚊、多斑按蚊和乌头按蚊多重pcr检测试剂盒，该试剂盒包括上述3对引物、10×buffer、dntps、mgcl2、taq酶、模板dna、无菌双蒸水。

该试剂盒的使用步骤如下：

1)配置pcr反应液：50μl所述反应液包含5μl10×buffer、3μldntps，3μlmgcl2，1μltaq酶，6条引物各1μl(浓度为50pmol/μl)，2μl模板dna，无菌双蒸水补足体积至50μl。

2)多重pcr反应条件：94℃预变性5min；94℃30s，58℃30s，72℃45s，进行35个循环；最后72℃终延伸10min。

3)pcr扩增产物的鉴定：取pcr扩增产物10μl，置于qiaxceladvanced毛细管电泳仪中进行电泳，选定alignmentmarker为15bp/600bp，sizemarker为25bp-500bp(25bp、50bp、75bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、400bp、500bp)，电泳后可见多重pcr检测美彩按蚊出现66bp的特异性条带，多斑按蚊出现135bp特异性条带，乌头按蚊出现299bp特异性条带，且无其它杂带。

特异性试验：采用该试剂盒对多种样本进行检测，结果如图1，电泳后可见多重pcr检测美彩按蚊出现64bp的特异性条带，多斑按蚊出现135bp特异性条带，乌头按蚊出现299bp特异性条带，且无其它杂带；带足按蚊、雷氏按蚊、须喙按蚊、克劳按蚊、迷糊按蚊、棋斑按蚊及无菌双蒸水结果均为阴性，这表明该方法具有良好的特异性。

多重pcr敏感性试验：用紫外分光光度计对蚊虫dna进行定量，调整浓度为10ng/μl，再按10倍梯度稀释至10^-6ng/μl，共计8个浓度，确定其检测下限为10^-4ng/μl，这表明该方法具有良好的敏感性(图2)。

本发明对样本适用范围广，适合日常蚊媒监测中各种方式捕获的蚊种，对标本的完整性没有要求，同时可对非成虫阶段样本进行鉴定。试剂盒提供的试剂，无感染性，无生物安全隐患成分，使用安全性很高。

本发明的多重pcr检测试剂盒，可在收到dna样品后的3小时内给出定性检测结果，节约成本和时间，对人员设备要求低，是一种检测美彩按蚊、多斑按蚊和乌头按蚊的有效工具。

本发明和已有技术相比，其优势是明显的，本发明可在同一反应体系内同时检测是否被测样本是否为美彩按蚊、多斑按蚊或乌头按蚊，具有较高的特异性和敏感性，可在短时间内测出结果，无需测序，高效便捷的同时能够节约成本。

附图说明

图1是多重pcr特异性检测试验结果，m为dnamarker，1-2为美彩按蚊多重pcr产物，3-4为多斑按蚊多重pcr产物，5-6为乌头按蚊多重pcr产物，7-8为带足按蚊多重pcr产物，9-10为雷氏按蚊多重pcr产物，11-12为须喙按蚊多重pcr产物，13-14为克劳按蚊多重pcr产物，15-16为迷糊按蚊多重pcr产物，17-18为棋斑按蚊多重pcr产物，19-20为无菌双蒸水。

图2是多重pcr敏感性试验结果，m为dnamarker，1-8为浓度为10ng/μl、1ng/μl、10^-1ng/μl、10^-2ng/μl、10^-3ng/μl、10^-4ng/μl、10^-5ng/μl、10^-6ng/μl的美彩按蚊多重pcr检测结果；9-16为浓度为10ng/μl、1ng/μl、10^-1ng/μl、10^-2ng/μl、10^-3ng/μl、10^-4ng/μl、10^-5ng/μl、10^-6ng/μl的多斑按蚊多重pcr检测结果；17-24为浓度为10ng/μl、1ng/μl、10^-1ng/μl、10^-2ng/μl、10^-3ng/μl、10^-4ng/μl、10^-5ng/μl、10^-6ng/μl的乌头按蚊多重pcr检测结果。

图3是美彩按蚊引物筛选试验结果，m为dnamarker，1、3、5、7、9、11分别为第1-6组引物的pcr检测结果，模板为1ng/μl美彩按蚊模板dna，2、4、6、8、10、12分别为第1-6组引物的阴性对照，模板为无菌双蒸水。结果显示5所在的第3组引物pcr产生的条带清晰，约64bp，无其余杂带。

图4是多斑按蚊引物筛选试验结果，m为dnamarker，1、3、5、7、9、11分别为第7-12组引物的pcr检测结果，模板为1ng/μl多斑按蚊模板dna，2、4、6、8、10、12分别为第7-12组引物的阴性对照，模板为无菌双蒸水。结果显示1所在的第7组引物pcr产生的条带清晰，约135bp，无其余杂带。

图5是乌头按蚊引物筛选试验结果，m为dnamarker，1、3、5、7、9、11分别为第13-18组引物的pcr检测结果，模板为1ng/μl乌头按蚊模板dna，2、4、6、8、10、12分别为第13-18组引物的阴性对照，模板为无菌双蒸水。结果显示1所在的第13组引物pcr产生的条带清晰，约299bp，无其余杂带。

具体实施方式

实施例

一、美彩按蚊引物筛选试验，依据美彩按蚊基因保守序列(基因登录号mk685253.1)，设计了6组引物(编号为第1－6组)：

第1组：

f1：5’-tcctgttcctgctccatt-3’(seqidno.1)

r1：5’-gcttcctccctcattaactt-3’(seqidno.2)

第2组：

f2：5’-cctgttcctgctccattt-3’(seqidno.3)

r2：5’-tgcttcctccctcattaac-3’(seqidno.4)

第3组：

f3：5’-atcctgttcctgctccat-3’(seqidno.5)

r3：5’-cttcctccctcattaactttac-3’(seqidno.6)

第4组：

f4：5’-ctcccgcatgagcaattc-3’(seqidno.7)

r4：5’-aatggagcaggaacaggat-3’(seqidno.8)

第5组

f5：5’-cctggatggcctaattcag-3’(seqidno.9)

r5：5’-cttgagctggaatagtaggaa-3’(seqidno.10)

第6组：

f6：5’-ctcctggatggcctaattc-3’(seqidno.11)

r6：5’-tgagctggaatagtaggaac-3’(seqidno.12)

引物筛选所用pcr反应液按照下列成分配置：50μl所述反应液包含5μl10×buffer、3μldntps，3μlmgcl2，1μltaq酶，上下游引物各1μl(浓度为50pmol/μl)，2μl模板dna，无菌双蒸水补足体积至50μl。

pcr反应条件如下：94℃预变性5min；94℃30s，58℃30s，72℃45s，进行35个循环；最后72℃终延伸10min。

图3为美彩按蚊引物筛选试验，m为dnamarker，1、3、5、7、9、11分别为第1－6组引物的pcr检测结果，模板为1ng/μl美彩按蚊模板dna，2、4、6、8、10、12分别为第1－6组引物的阴性对照，模板为无菌双蒸水，结果显示5所在的第3组引物pcr产生的条带清晰，约64bp，无其余杂带。

二、多斑按蚊引物筛选试验，依据多斑按蚊基因保守序列(基因登录号mk685255.1)，设计了6组引物(编号为第7－12组)：

第7组：

f7：5’-agaggaggatataccgttca-3’(seqidno.13)

r7：5’-aggagcaccagatatagca-3’(seqidno.14)

第8组：

f8：5’-aagaggaggatataccgttca-3’(seqidno.15)

r8：5’-ggagcaccagatatagcatt-3’(seqidno.16)

第9组：

f9：5’-ggaggatataccgttcaac-3’(seqidno.17)

r9：5’-attaggagcaccagatatag-3’(seqidno.18)

第10组：

f10：5’-aaagaggaggatataccgttc-3’(seqidno.19)

r10：5’-gagcaccagatatagcatttc-3’(seqidno.20)

第11组：

f11：5’-aagtaattcctggtgatcgt-3’(seqidno.21)

r11：5’-cttctggaattgctcatgc-3’(seqidno.22)

第12组：

f12：5’-aagaaagaggaggatataccg-3’(seqidno.23)

r12：5’-caccagatatagcatttcctc-3’(seqidno.24)

引物筛选所用pcr反应液按照下列成分配置：50μl所述反应液包含5μl10×buffer、3μldntps，3μlmgcl2，1μltaq酶，上下游引物各1μl(浓度为50pmol/μl)，2μl模板dna，无菌双蒸水补足体积至50μl。

pcr反应条件如下：94℃预变性5min；94℃30s，58℃30s，72℃45s，进行35个循环；最后72℃终延伸10min。

图4为多斑按蚊引物筛选试验，m为dnamarker，1、3、5、7、9、11分别为第7-12组引物的pcr检测结果，模板为1ng/μl多斑按蚊模板dna，2、4、6、8、10、12分别为第7-12组引物的阴性对照，模板为无菌双蒸水，结果显示1所在的第7组引物pcr产生的条带清晰，约135bp，无其余杂带。

三、乌头按蚊引物筛选试验，依据乌头按蚊基因保守序列(基因登录号mk685256.1)，设计了6组引物(编号为第13－18组)：

第13组：

f13：5’-catgtgcaataccagaagaa-3’(seqidno.25)

r13：5’-agaattaggtcatccaggag-3’(seqidno.26)

第14组：

f14：5’-caataccagaagaaagaggag-3’(seqidno.27)

r14：5’-tcgtgcagaattaggtcat-3’(seqidno.28)

第15组：

f15：5’-ccagcatgtgcaatacca-3’(seqidno.29)

r15：5’-ttaggtcatccaggagctt-3’(seqidno.30)

第16组：

f16：5’-ccagaagaaagaggagggta-3’(seqidno.31)

r16：5’-cttattcgtgcagaattaggtc-3’(seqidno.32)

第17组：

f17：5’-tgtgcaataccagaagaaag-3’(seqidno.33)

r17：5’-gcagaattaggtcatccag-3’(seqidno.34)

第18组：

f18：5’-gcaataccagaagaaagagga-3’(seqidno.35)

r18：5’-cgtgcagaattaggtcatcc-3’(seqidno.36)

引物筛选所用pcr反应液按照下列成分配置：50μl所述反应液包含5μl10×buffer、3μldntps，3μlmgcl2，1μltaq酶，上下游引物各1μl(浓度为50pmol/μl)，2μl模板dna，无菌双蒸水补足体积至50μl。

pcr反应条件如下：94℃预变性5min；94℃30s，58℃30s，72℃45s，进行35个循环；最后72℃终延伸10min。

图5为乌头按蚊引物筛选试验，m为dnamarker，1、3、5、7、9、11分别为第13-18组引物的pcr检测结果，模板为1ng/μl乌头按蚊模板dna，2、4、6、8、10、12分别为第13-18组引物的阴性对照，模板为无菌双蒸水，结果显示1所在的第13组引物pcr产生的条带清晰，约299bp，无其余杂带。

sequencelisting

<110>江苏省检验检疫科学技术研究院

南京中医药大学

江苏国际旅行卫生保健中心（南京海关口岸门诊部）

<120>一种美彩按蚊、多斑按蚊和乌头按蚊多重pcr检测试剂盒

<130>

<160>36

<170>patentinversion3.3

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<211>18

<212>dna

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<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

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<213>人工序列（artificialsequence）

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<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

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atcctgttcctgctccat18

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<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

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cttcctccctcattaactttac22

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<212>dna

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<212>dna

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<212>dna

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ctcctggatggcctaattc19

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tgagctggaatagtaggaac20

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aagaggaggatataccgttca21

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<212>dna

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ggagcaccagatatagcatt20

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<212>dna

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ggaggatataccgttcaac19

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attaggagcaccagatatag20

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<212>dna

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aaagaggaggatataccgttc21

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gagcaccagatatagcatttc21

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<212>dna

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aagtaattcctggtgatcgt20

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<212>dna

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cttctggaattgctcatgc19

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aagaaagaggaggatataccg21

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caccagatatagcatttcctc21

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caataccagaagaaagaggag21

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ccagcatgtgcaatacca18

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ccagaagaaagaggagggta20

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cttattcgtgcagaattaggtc22

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tgtgcaataccagaagaaag20

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gcaataccagaagaaagagga21

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