一种高通量载体构建方法
【专利摘要】一种高通量载体构建方法，使用96孔PCR板，进行扩增、纯化、浓度测定、BP反应、BP克隆、单克隆培养及质粒提取、LR反应、LR克隆的构建步骤，相对目前单个载体构建而言，实现了高通量、集约化、高效率和低成本等优点。
【专利说明】一种高通量载体构建方法
【技术领域】
[0001]本发明创造涉及一种高通量载体构建方法。
【背景技术】
[0002]随着生物技术发展日新月异，相关生物研究领域不断突破和新研究领域不断涌现，载体构建工作越来越普遍。载体构建，涉及到DNA核酸序列分析,蛋白功能分析,基因遗传表观分析等，涵盖包括:遗传学、生物信息学、蛋白组学、蛋白功能学等几乎所有生物相关科研和生产领域。目前载体构建，多以酶切连接为主，单样本单通道操作为主。在进行多元件载体构建时，常常因为找不到合适的酶切位点而加大载体构建难度。常常因为单通道载体构建，而无法提高载体构建效率和规模。因此，需要采用多种核酸操作方式达到载体构建目的。由此造成财力、人力和物力大量消耗。同时，单通道载体构建工作，往往需要做大量的重复工作，工作重复性和无序性常常导致载体构建工作中出现的样本交叉污染，给工作造成极大不便。另外，随着生物信息学的迅猛发展，目前高通量研究工作逐渐增多。面对高通量载体构建，常常因为通量小而导致高通量工作长久拖延时间。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的技术问题在于克服上述不足，提供一种基于Gateway技术的高通量载体构建流程。为实现上述目的，本发明创造提供一种高通量载体构建方法。
[0004]本发明创造解决其技术问题所采用的技术方案是:一种高通量载体构建方法，所述方法包括以下步骤:
[0005](I)将不同模板的待捕获的目标基因加入在一块96孔PCR板上，进行高通量PCR，进行纯化；`
[0006](2 )测定纯化后的PCR产物浓度；
[0007](3)将产物转移至96孔BP反应预制板，与配置在所述96孔BP反应预制板的BP反应混合液进行BP反应；
[0008](4)将BP产物转移至感受态细胞板中，进行BP产物克隆转化；
[0009](5)将BP产物转化后的细胞转移至大型LB固体培养基上，画线分离单克隆；
[0010](6)将BP反应单克隆挑取，并培养后转移至96孔PCR克隆鉴定预制板，进行BP产物克隆鉴定；
[0011](7)将鉴定后的阳性克隆转移至96深孔板中，培养后利用96孔质粒提取方式提取BP克隆质粒，并测定BP克隆质粒浓度；
[0012](8)将产物转移至96孔LR反应预制板，进行LR反应；
[0013](9)将LR产物转移至感受态细胞板中，进行LR产物转化；
[0014](10)将LR产物转化后的细胞转移至大型LB固体培养基，进行画线分离单克隆；
[0015](11)将LR反应单克隆挑取，并培养后转移至96孔PCR克隆鉴定预制板，进行LR产物克隆鉴定；[0016](12)将鉴定后的LR阳性克隆转移至96深孔板中，培养后提取LR产物克隆质粒，并测定LR克隆质粒浓度。
[0017]优选地，所述步骤(2)采用微珠进行纯化。
[0018]优选地，所述微珠为磁性微珠。
[0019]优选地,每一份所述96孔BP反应预制板的BP反应混合液,包括如下重量组分:
[0020]BP 酶IyL (lU/μ L),
[0021]pDoner221 质粒Ιμ? (75ng/ μ L),
[0022]缓冲洗脱液2 μ L ;
[0023]所述每一份BP反应混合液，与I μ L (20ng/ μ L)纯化后的PCR产物进行反应。
[0024]优选地,每一份所述96孔LR反应预制板的LR反应混合液,包括如下重量组分:
[0025]
【权利要求】
1.一种高通量载体构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (1)将不同模板的待捕获的目标基因加入在一块96孔PCR板上，进行高通量PCR，进行纯化； (2)测定纯化后的产物浓度； (3)将产物转移至96孔BP反应预制板，与配置在所述96孔BP反应预制板的BP反应混合液进行BP反应； (4)将BP产物转移至感受态细胞板中，进行BP产物转化； (5)将BP产物转化后的细胞转移至大型LB固体培养基上，进行画线分离单克隆； (6)将BP反应单克隆挑取，并培养后转移至96孔PCR克隆鉴定预制板，进行BP产物克隆鉴定； (7)将鉴定后的阳性克隆转移至96深孔板中，培养后提取BP克隆质粒，并测定BP克隆质权浓度； (8)将产物转移至96孔LR反应预制板，进行LR反应； (9)将LR产物转移至感受态细胞板中，进行LR产物转化； (10)将LR产物转化后的细胞转移至大型LB固体培养基，进行画线分离单克隆； (11)将LR反应单克隆挑取，并培养后转移至96孔PCR克隆鉴定预制板，进行LR产物克隆鉴定； (12)将鉴定后的LR阳性克隆转移至96深孔板中，培养后提取LR产物克隆质粒，并测定LR克隆质粒浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)采用微珠进行纯化。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述微珠为磁性微珠。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，每一份所述96孔BP反应预制板的BP反应混合液，包括如下重量组分: BP 酶I μ L (?υ/μ L), pDoner221 质粒IyL (75ng/ μ L), 缓冲洗脱液2 μ L ; 所述每一份BP反应混合液，与I μ L (20ng/ μ L)纯化后的PCR产物进行反应。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，每一份所述96孔LR反应预制板的LR反应混合液，包括如下重量组分:
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一质粒为P4P1R质粒，所述第二质粒为P2RP3质粒，所述第三质粒为PDest质粒。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PDest质粒为病毒骨架质粒。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(4)、(9)中，所述的感受态细胞板为96孔感受态细胞板。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(5)、(10)中，所述分离单克隆采用画线方式分离。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(7)、(12)中，所述克隆质粒采用96孔板质粒提取方法进行提取。
【文档编号】C12N15/66GK103602697SQ201310611710
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月26日 优先权日:2013年11月26日
【发明者】张玮, 蒙伟能, 温华杰, 李春园, 王文忠, 施金秀, 魏宝丽 申请人:赛业（广州）生物科技有限公司