一种嵌合抗原受体及其应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，属于疾病的细胞免疫治疗
技术领域：
，涉及一种嵌合抗原受体及其应用，尤其涉及一种靶向baff-r阳性肿瘤细胞的嵌合抗原受体及其在制备治疗cd19抗原缺失造成的肿瘤复发的药物中的应用。
背景技术：
：嵌合抗原受体(car)t细胞已广泛应用于治疗b细胞恶性肿瘤，靶向cd19的car-t细胞是car-t疗法治疗b细胞恶性肿瘤的先驱，为治疗b细胞恶性肿瘤提供了有效方案。然而，cd19抗原缺失造成的肿瘤复发，极大地减弱了治疗效果。cd19阴性复发已成为一个重要问题，在大约30％的患者中会发生cd19阴性复发。b细胞的相关靶点还包括cd20和cd22等，但是其在b细胞白血病和淋巴瘤中的表达水平远低于cd19。研究显示，靶向cd19的car-t疗法的有效性优于靶向cd20和cd22的car-t，提示高密度car靶点表达具有更好的治疗效果。因此，探索新的高表达于b细胞表面的抗原靶点，是目前解决cd19抗原丢失逃逸问题的重要研究方向。tnf家族的b细胞活化因子(bcellactivatingfactorbelongingtothetnffamily，baff)是一种重要的肿瘤坏死因子(tnf)超家族成员，具有膜结合型和可溶型两种形式，二者的生物学活性基本一致，不仅广泛参与调节b细胞发育、分化和抗体产生，而且还广泛参与调节t细胞活化和应答过程。baff通过与三种不同的受体结合，发挥促b细胞分化成熟、类别转换、促进体液免疫应答及t细胞活化等功能，同时还能使b细胞发生恶化，诱导淋巴瘤的生成(novaka,darcej,arendtb,etal.expressionofbcma,taci,baff-rinmultiplemyeloma:amechanismforgrowthandsurvival.blood,2004,103(2):689-694.；kleinb,tartek,jourdanm,etal.survivalandproliferationfactorofnormalandmalignantplasmacells.int-j-hematol,2003,78(2):106-113.)。baff与增殖诱导配体(aproliferationinducingligand，april)具有较高的同源性。如图1所示，baff可以与b细胞活化因子受体(baff-r)、b细胞成熟抗原(bcellmaturationantigen，bcma)和穿膜蛋白活化物(transmembraneactivatorandcyclophilinligandinteractor，taci)3个受体结合，而april则与bcma、taci结合发挥作用。据文献报道，bcma对april的亲和力显著高于对baff的亲和力，这种结合选择性可能是由受体半胱氨酸富集区(crds)内dxlmotif之外的序列差异性造成的。baff-r是baff的专一受体，对baff介导b细胞存活和成熟具有重要影响。baff-r广泛表达于包括未成熟b、过渡期b、成熟b、记忆b、生发中心b以及浆细胞在内的b细胞亚群。发明人前期发现，baff-r与cd19在多种b淋巴肿瘤细胞系上共表达，提示baff-r是一个治疗cd19阴性复发的潜在靶点。cn109311991a公开了用抗baff-r抗体构建car-t，发现对人类淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病(all)系细胞具有细胞毒性。baff-r-cart细胞可以清除cd19缺乏的肿瘤细胞。(hongqinetal.，cartcellstargetingbaff-rcanovercomecd19antigenlossinbcellmalignancies.sciencetranslationalmedicine2019：vol.11，issue511，eaaw9414，doi：10.1126/scitranslmed.aaw9414)。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种新的靶向baff-r的嵌合抗原受体并构建靶向baff-r的car-t细胞，所述嵌合抗原受体采用baff单体或三聚体(tribaff)作为car分子的抗原结合结构域，制备的car-t细胞靶向b细胞表面的baff-r，用于治疗baff-r阳性表达的b细胞相关疾病，为解决cd19car-t细胞疗法阴性复发提供了有效方案。为达此目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供了一种改造的baff，所述改造的baff为将可溶型baff的活化氨基酸进行缺失突变而获得的肽段。本发明中，将可溶型baff(solubleform：134-285)第217-224位活化必需的氨基酸vhvfgdel替换为gg，获得改造的baff，改造后的baff缺失了baff活化能力，但是保留有baff-r结合能力，作为抗原结合结构域构建的car-t细胞既能抑制baff活化造成的恶性b细胞增殖，又保留识别b细胞的能力。优选地，所述改造的baff包括seqidno:1所示的氨基酸序列；seqidno:1：avqgpeetvtqdclqliadsetptiqkgsytfvpwllsfkrgsaleekenkilvketgyffiygqvlytdktyamghliqrkkggslvtlfrciqnmpetlpnnscysagiakleegdelqlaiprenaqisldgdvtffgalkll。第二方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域和信号传导结构域；所述抗原结合结构域包括第一方面所述的改造的baff单体和/或多聚体。本发明中，采用如seqidno:1所示的改造的baff作为抗原结合结构域，构建car分子可以识别结合baff-r，但不会引发baff活化造成的恶性b细胞增殖，由此制备的car-t细胞对cd19抗原缺失的b肿瘤细胞具有特异性靶向杀伤作用，有望成为一种治疗cd19抗原缺失造成的肿瘤复发的新的手段。优选地，所述抗原结合结构域包括第一方面所述的改造的baff单体。优选地，所述抗原结合结构域包括seqidno:1所示的氨基酸序列。优选地，所述抗原结合结构域包括第一方面所述的改造的baff三聚体。优选地，所述改造的baff三聚体之间采用ggggs连接子连接。优选地，所述抗原结合结构域包括seqidno:2所示的氨基酸序列；seqidno:2：avqgpeetvtqdclqliadsetptiqkgsytfvpwllsfkrgsaleekenkilvketgyffiygqvlytdktyamghliqrkkggslvtlfrciqnmpetlpnnscysagiakleegdelqlaiprenaqisldgdvtffgalkllggggsavqgpeetvtqdclqliadsetptiqkgsytfvpwllsfkrgsaleekenkilvketgyffiygqvlytdktyamghliqrkkggslvtlfrciqnmpetlpnnscysagiakleegdelqlaiprenaqisldgdvtffgalkllggggsavqgpeetvtqdclqliadsetptiqkgsytfvpwllsfkrgsaleekenkilvketgyffiygqvlytdktyamghliqrkkggslvtlfrciqnmpetlpnnscysagiakleegdelqlaiprenaqisldgdvtffgalkll。本发明中，采用改造的baff三聚体作为抗原结合结构域，制备的car-t细胞对baff-r阳性的肿瘤细胞的杀伤能力显著增强，这是由于baff三聚体与受体baff-r的结合能力较baff单体或野生型baff得到显著提高。优选地，所述信号肽包括cd8α信号肽。优选地，所述cd8α信号肽包括seqidno:3所示的氨基酸序列；seqidno:3：malpvtalllplalllhaarp。优选地，所述铰链区包括cd8α铰链区。优选地，所述cd8α铰链区包括seqidno:4所示的氨基酸序列；seqidno:4：tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacd。优选地，所述跨膜结构域包括cd8α跨膜结构域。优选地，所述cd8α跨膜结构域包括seqidno:5所示的氨基酸序列；seqidno:5：iyiwaplagtcgvlllslvitlyc。优选地，所述共刺激结构域包括4-1bb。优选地，所述4-1bb包括seqidno:6所示的氨基酸序列；seqidno:6：krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel。优选地，所述信号传导结构域包括cd3ζ。优选地，所述cd3ζ包括seqidno:7所示的氨基酸序列；seqidno:7：rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr。优选地，所述嵌合抗原受体由cd8α信号肽、改造的baff单体、cd8α铰链区、cd8α跨膜结构域、4-1bb和cd3ζ串联组成。优选地，所述嵌合抗原受体包括seqidno:8所示的氨基酸序列；seqidno:8：malpvtalllplalllhaarpavqgpeetvtqdclqliadsetptiqkgsytfvpwllsfkrgsaleekenkilvketgyffiygqvlytdktyamghliqrkkggslvtlfrciqnmpetlpnnscysagiakleegdelqlaiprenaqisldgdvtffgalkllsgggsdptttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr*。本发明中，以改造的baff单体作为抗原结合结构域，构建得到seqidno:8所示的嵌合抗原受体baffcar，*表示终止密码子对应的氨基酸。优选地，所述嵌合抗原受体由cd8α信号肽、改造的baff三聚体、cd8α铰链区、cd8α跨膜结构域、4-1bb和cd3ζ串联组成。优选地，所述嵌合抗原受体包括seqidno:9所示的氨基酸序列；seqidno:9：malpvtalllplalllhaarpavqgpeetvtqdclqliadsetptiqkgsytfvpwllsfkrgsaleekenkilvketgyffiygqvlytdktyamghliqrkkggslvtlfrciqnmpetlpnnscysagiakleegdelqlaiprenaqisldgdvtffgalkllggggsavqgpeetvtqdclqliadsetptiqkgsytfvpwllsfkrgsaleekenkilvketgyffiygqvlytdktyamghliqrkkggslvtlfrciqnmpetlpnnscysagiakleegdelqlaiprenaqisldgdvtffgalkllggggsavqgpeetvtqdclqliadsetptiqkgsytfvpwllsfkrgsaleekenkilvketgyffiygqvlytdktyamghliqrkkggslvtlfrciqnmpetlpnnscysagiakleegdelqlaiprenaqisldgdvtffgalkllsgggsdptttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr*。本发明中，以改造的baff三聚体作为抗原结合结构域，构建得到seqidno:9所示的嵌合抗原受体tribaffcar。第三方面，本发明提供了一种第二方面所述的嵌合抗原受体的编码基因。第四方面，本发明提供了一种慢病毒载体，所述慢病毒载体包括第三方面所述的编码基因。第五方面，本发明提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒为转染有第四方面所述的慢病毒载体和辅助质粒的哺乳细胞。优选地，所述哺乳细胞包括293细胞、293t细胞或293f细胞中的任意一种或至少两种的组合，优选为293t细胞。第六方面，本发明提供了一种car-t细胞，所述car-t细胞表达第一方面所述的改造的baff和/或第二方面所述的嵌合抗原受体。本发明中，以改造的baff作为抗原结合结构域，构建car分子可以识别结合肿瘤细胞表面的baff-r，由此制备的car-t细胞对baff-r阳性细胞、甚至cd19抗原缺失的b肿瘤细胞具有特异性靶向杀伤作用，为治疗cd19抗原缺失造成的肿瘤复发提供了新的手段。优选地，所述car-t细胞的基因组中整合有第三方面所述的编码基因。优选地，所述car-t细胞包括第四方面所述的慢病毒载体和/或第五方面所述的重组慢病毒。第七方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的改造的baff、第二方面所述的嵌合抗原受体、第三方面所述的编码基因、第四方面所述的慢病毒载体、第五方面所述的重组慢病毒或第六方面所述的car-t细胞中的任意一种或至少两种的组合。优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。第八方面，本发明提供了一种第一方面所述的改造的baff、第二方面所述的嵌合抗原受体、第三方面所述的编码基因、第四方面所述的慢病毒载体、第五方面所述的重组慢病毒、第六方面所述的car-t细胞或第七方面所述的药物组合物在制备疾病治疗药物中的应用。优选地，所述疾病包括b细胞恶性肿瘤。优选地，所述疾病包括cd19抗原缺失造成的b细胞恶性肿瘤复发。根据本发明，cd19抗原缺失造成的肿瘤复发极大地减弱了cd19car-t疗法的治疗效果，cd19阴性复发已成为一个重要问题，本发明通过对可溶型baff进行改造，保留baff与baff-r结合的能力、而缺失了baff活化引发b肿瘤细胞增殖的能力，获得的改造的baff作为抗原结合结构域制备car分子，构建的car-t细胞对baff-r阳性肿瘤细胞、尤其是cd19抗原缺失的肿瘤细胞具有显著的靶向杀伤作用，为治疗cd19抗原缺失造成的b细胞恶性肿瘤复发提供了有效手段。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明对可溶型baff进行改造，将活化必需的氨基酸vhvfgdel替换为gg，改造后的baff缺失了baff活化能力，但是保留有baff-r结合能力，作为抗原结合结构域构建的car-t细胞既能抑制baff活化造成的恶性b细胞增殖，又保留识别b细胞的能力；(2)本发明采用改造的baff单体或三聚体作为抗原结合结构域构建car分子，可以识别结合baff-r，由此制备的car-t细胞对baff-r阳性细胞具有特异性靶向杀伤作用，其中tribaffcar-t细胞对baff-r阳性的肿瘤细胞具有强烈的杀伤作用；(3)本发明以改造的baff作为抗原结合结构域构建的car-t细胞对cd19抗原缺失的b肿瘤细胞具有特异性靶向杀伤作用，为治疗cd19抗原缺失造成的肿瘤复发提供了有效手段。附图说明图1为baff和april与受体结合的示意图；图2为改造的baff对raji细胞增殖作用；图3(a)为识别位点为baff-r的baffcar和tribaffcar结构，图3(b)为识别位点为cd19的cd19car结构；图4(a)为baffcar慢病毒载体结构，图4(b)为tribaffcar慢病毒载体结构，图4(c)为cd19car慢病毒载体结构；图5为t细胞表面car分子的表达情况的流式检测结果；图6为恶性b细胞系共表达cd19和baff-r；图7为car-t细胞对k562细胞系的杀伤作用；图8为car-t细胞对cd19和baff-r双阳性肿瘤细胞的杀伤作用；图9为raji细胞敲除cd19后的表达情况；图10为car-t细胞对raji-cd19-ko的杀伤作用。具体实施方式为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。实施例1baff抗原结合结构域的设计与功能为采用baff作为car分子的抗原结合结构域，本实施例对可溶型baff进行改造，将可溶型baff(solubleform：134-285)第217-224位活化必需的氨基酸vhvfgdel替换为gg，得到如seqidno:1所示的改造的baff。(1)改造的baff对baff-r的结合能力结果如表1所示，改造后的baff(mbaff)缺失了baff活化能力，但是保留有baff-r结合能力。表1重组baff及改造后蛋白与k562-baffr细胞结合分析目的蛋白平均荧光强度(mfi)结合阳性率野生可溶型baff85659.35％改造可溶型baff96962.56％野生可溶型baff三聚体296897.45％改造可溶型baff三聚体256595.67％pbs250.12％(2)改造的baff对raji细胞增殖作用1×104个raji-luc(表达荧光素酶的raji)细胞接种于黑色96孔板中(上海晶安，货号j09602)，每天加入重组baff蛋白(5μg/ml)。继续培养5天后，加入100μlreconstitutedreagent(bright-gloluciferaseassaysystem，货号e2620)，孵育2min后，用fluostaromega仪器进行荧光检测。对照组(添加pbs)的荧光值设为100％，评估各组raji细胞的增殖情况。结果如图2所示：野生可溶型baff和野生可溶型baff三聚体都能显著促进raji细胞的扩增，而改造可溶型baff和改造可溶型baff三聚体都丧失了促进raji细胞增殖的能力。实施例2car分子的设计本实施例利用如seqidno:1所示的改造的baff作为抗原结合结构域，构建如图3(a)所示的基于单体baff的嵌合抗原受体(baffcar)和基于三聚体baff的嵌合抗原受体(tribaffcar)，tribaffcar分子中的三个baff之间由ggggs连接子连接，识别结合baff-r；同时还设计了如图3(b)所示的基于抗cd19抗体(fmc63)scfv的cd19car，特异性识别cd19抗原。除了抗原结合结构域之外，上述car分子还包括cd8α信号肽序列(leader)、cd8α铰链区(hinge)和跨膜区(transmembrane)序列、4-1bb共刺激域序列和cd3ζ信号传导域序列。实施例3慢病毒载体的构建(1)全基因合成以下car分子的核酸分子：baffcar：由cd8a信号肽序列、改造的baff序列、cd8a铰链区和跨膜区序列、4-1bb和cd3ζ串联组成(氨基酸序列如seqidno:8所示)；tribaffcar：由cd8a信号肽序列、三段重复的改造的baff序列(三个baff之间由ggggs连接子连接)、cd8a铰链区和跨膜区序列、4-1bb和cd3ζ串联组成(氨基酸序列如seqidno:9所示)；cd19car：由cd8a信号肽序列、cd19scfv、cd8a铰链区和跨膜区序列、4-1bb和cd3ζ串联组成(氨基酸序列如seqidno:10所示)；seqidno:10：cd19car的氨基酸序列：malpvtalllplalllhaarpdiqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr*。将上述car分子的核酸分子采用ecori和bamhi双酶切，于37℃水浴中孵育30min，将酶切产物在1.5％琼脂糖凝胶中进行dna电泳，使用天根的琼脂糖凝胶试剂盒纯化回收酶切片段。(2)线性化pcdh-ef1-mcs载体与car核酸片段连接配制如表2所示的连接体系，22℃连接1h；将连接产物转化入stbl3大肠杆菌感受态细胞，取200μl转化产物涂布氨苄抗性lb平板，于37℃培养箱倒置培养过夜；次日早晨随机挑选3个单克隆进行菌落pcr鉴定，将阳性克隆送样测序。表2连接体系成分用量线性化pcdh-ef1-mcs载体2μl(50ng)car基因10μl(150ng)t4dna连接酶缓冲液2μlt4dna连接酶(neb)1μlddh2o5μl成功构建的慢病毒载体元件baffcar、tribaffcar和cd19car的示意图分别如图4(a)、图4(b)和图4(c)所示。实施例4慢病毒包装本实施例采用四质粒系统对实施例3构建的三种慢病毒载体进行慢病毒包装，将辅助质粒gag/pol、rev和vsv-g与三种慢病毒载体之一按比例混合后，加至一定体积的无血清dmem中，混匀放置15min；将上述混合液加至铺有293t细胞的细胞培养瓶中，轻轻混匀，于37℃、5％co2细胞培养箱中培养6h；6h后更换新鲜培养基，继续培养，并加入10mm丁酸钠溶液；72h后收集慢病毒培养上清进行纯化检测。实施例5t细胞的分离与扩增采集30ml全血，将外周血采用生理盐水按1:1比例稀释；向离心管中加入ficoll淋巴细胞分离液，并缓缓加入稀释的外周血，密度梯度离心后轻轻吸取pbmc层移入另一离心管中；采用生理盐水洗涤pbmc层，转入x-vivo培养基(含50ng/mlokt3和300iu/mlil-2)进行激活，2日后将培养基更换为含300iu/ml的x-vivo进行扩大培养；而后每两天进行一次计数，并更换新鲜的含300iu/ml的x-vivo培养基，将细胞浓度维持在(0.5～1)×106个/ml。实施例6慢病毒感染t细胞本实施例利用retronectin提高慢病毒对t细胞的感染效率，步骤如下：将30μgretronectin包被于6孔板内，置于37℃细胞培养箱保持2h；吸取retronectin，利用含2.5％bsa的hank’s溶液封闭包被后的6孔板，置于37℃细胞培养箱保持0.5h；吸取封闭液，利用含2％hepes的hank’s溶液洗涤6孔板，加入x-vivo培养基，加入适量的慢病毒溶液，2000g离心2h，弃上清；加入1×106个t细胞(cd3阳性>90％)，1000g离心10min，置于37℃、5％co2和一定湿度的细胞培养箱内培养。感染5天后采用流式细胞仪检测t细胞表面car分子的表达，利用fitc-labeledhumancd19蛋白(货号cd9-hf251，acrobiosystems)检测cd19car的表达，利用抗baff的抗体(anti-baffmab)测定baffcar和tribaffcar的表达。结果如图5所示，构建的cart细胞表面成功表达cd19、baff或tribaff。实施例7流式检测各细胞表达cd19和baff-r的阳性比例本实施例采用fitc标记的cd19抗体和baff-r抗体检测多种肿瘤细胞系表达cd19和baff-r的情况，包括人骨髓瘤细胞系nci-h929、人多发性骨髓瘤细胞系rpmi8226、人burkitt's淋巴瘤细胞系daudi、人套细胞淋巴瘤细胞jeko-1、人t淋巴母细胞系jurkat、人burkitt's淋巴瘤细胞raji、人b淋巴白血病细胞nalm-6、人b淋巴细胞急性白血病细胞ball-1、组织细胞淋巴瘤细胞u937、人慢性髓系白血病细胞k562、过表达cd19的k562细胞k562-cd19和过表达baff-r的k562细胞k562-baff-r。表达阳性率见表3。表3各细胞表达cd19和baff-r的阳性比例细胞类型名称cd19(％)baff-r(％)人骨髓瘤细胞系nci-h92901.5人多发性骨髓瘤细胞系rpmi822601.55人burkitt's淋巴瘤细胞系daudi96.4494.42人套细胞淋巴瘤细胞jeko-195.2284.25人t淋巴母细胞系jurkat1.230.45人burkitt's淋巴瘤细胞raji97.8394.53人b淋巴白血病细胞nalm-696.0391.32人b淋巴细胞急性白血病细胞ball-192.1397.45组织细胞淋巴瘤细胞u9371.322.31人慢性髓系白血病细胞k5622.144.58人慢性髓系白血病细胞k562-cd1998.242.16人慢性髓系白血病细胞k562-baff-r3.6397.26可以看出，在恶性b细胞系daudi、jeko-1、raji、nalm-6和ball-1中，cd19和baff-r呈现共表达，相应的结果如图6所示；而骨髓瘤细胞系nci-h929和rpmi8226、t细胞系jurkat和髓系细胞u937和k562均不表达cd19和baff-r。实施例8car-t细胞杀伤肿瘤细胞为了验证实施例6制备的car-t细胞对靶细胞的特异性杀伤作用，发明人在双阴性细胞系k562上分别构建了过表达cd19蛋白的k562-cd19细胞和过表达baff-r蛋白的k562-baff-r细胞，阳性率分别为98.24％和97.26％，见表3；同时，双阳性raji、jeko-1、ball-1细胞系也作为肿瘤靶细胞。采用cd19-car-t、baff-car-t和tribaff-car-t进行细胞毒性检测实验，以未转染的t细胞(mockt)作为空白对照，利用ldh检测car-t细胞对k562、k562-cd19、k562-baff-r、raji、jeko-1和ball-1的细胞毒性，步骤如下：将各种肿瘤靶细胞离心后，用无血清无酚红的rpmi1640培养基多次洗涤后计数；取50μl1×106个k562、k562-cd19、k562-baff-r、raji、jeko-1和ball-1细胞，铺板于96孔板内，作为靶细胞；按不同的效靶比e:t(靶细胞:效应细胞)分别加入未转染的t细胞和三种car-t细胞，于37℃、5％co2和一定湿度的细胞培养箱内培养12h；加入裂解液作为阳性对照；而后250g离心5min，每孔取100μl培养上清，加入新的96孔板中，加入20μl反应液，置于暗室反应20～30min，酶标仪在590nm处测定结果；根据以下公式计算特异性裂解率(specificlysisi)：细胞毒性(％)＝[(实验孔－培养基背景孔)－(效应细胞自发ldh释放孔－培养基背景孔)－(靶细胞自发ldh释放孔－培养基背景孔)]/[(靶细胞最大ldh释放孔－体积校正孔)－(靶细胞自发ldh释放孔－培养基背景孔)]×100％；具体步骤参照申请号为201510362935.5的专利《cd33特异性嵌合抗原受体及其应用》。图7显示，cd19-car-t细胞仅能特异性杀伤过表达cd19的k562-cd19细胞；baff-car-t和tribaff-car-t细胞仅能特异性杀伤过表达baff-r的k562-baff-r细胞，且tribaff-car-t细胞的杀伤效果优于baff-car-t细胞。图8显示，cd19-car-t、baff-car-t和tribaff-car-t均能杀伤cd19和baff-r双阳性的肿瘤靶细胞，其中cd19-car-t细胞和tribaff-car-t细胞的杀伤能力相当，而baff-car-t细胞的杀伤能力稍弱。实施例9构建敲除cd19的稳转细胞系raji-cd19-ko为了探索单体baff-car-t和三聚体tribaff-car-t在治疗cd19阴性复发肿瘤中的潜力，本实施例采用crispr-cas9技术敲除raji细胞中的cd19表达，参照张锋lenticrisprv2载体说明书，将靶向cd19的sgrna(seqidno:11)构建至慢病毒lenticrisprv2载体，其中lenticrisprv2质粒为经bsmbi内切酶酶切后回收的大片段，连接体系如表4所示；seqidno:11：5’-cagtcctatgaggatatgag-3’；表4连接体系成分用量线性化lenticrisprv2载体1μl(50ng)sgrna对应的双链dna1μlt4dna连接酶(neb)1μl2×quick连接缓冲液(neb)5μlddh2o3μl将慢病毒载体lenticrisprv2-cd19-sgrna包装慢病毒，感染raji细胞，用嘌呤霉素(5μg/ml)筛选敲除稳转株。图9显示，raji细胞中的cd19被敲除，敲除cd19的raji细胞raji-cd19-ko成功构建。实施例10tribaff-car-t治疗cd19阴性复发肿瘤的潜力为了验证单体baff-car-t和三聚体tribaff-car-t对cd19缺失的肿瘤靶细胞的杀伤作用，本实施例以raji-cd19-ko细胞为肿瘤靶细胞，分别用cd19-car-t、baff-car-t和tribaff-car-t进行细胞毒性检测实验，并以未转染的t细胞(mockt)作为空白对照。结果如图10显示，由于raji-cd19-ko细胞缺失了cd19抗原，cd19-car-t细胞丧失了对该靶细胞的杀伤能力；而baff-car-t和tribaff-car-t均可以有效杀伤raji-cd19-ko细胞，其中tribaff-car-t细胞展示出更优的杀伤能力。这些结果说明tribaff-car-t细胞可以用于治疗cd19-car-t细胞疗法阴性复发的病人。综上所述，cd19抗原缺失造成的肿瘤复发极大地减弱了cd19car-t疗法的治疗效果，cd19阴性复发已成为一个重要问题，本发明通过对可溶型baff进行改造，保留baff与baff-r结合的能力、而缺失了baff活化引发b肿瘤细胞增殖的能力，获得的改造的baff作为抗原结合结构域制备car分子，构建的car-t细胞对baff-r阳性肿瘤细胞、尤其是cd19抗原缺失的肿瘤细胞具有显著的靶向杀伤作用，为治疗cd19抗原缺失造成的b细胞恶性肿瘤复发提供了有效手段。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。sequencelisting<110>广州百暨基因科技有限公司<120>一种嵌合抗原受体及其应用<130>20200527<160>11<170>patentinversion3.3<210>1<211>146<212>prt<213>人工序列<400>1alavalglnglyproglugluthrvalthrglnaspcysleuglnleu151015ilealaaspsergluthrprothrileglnlysglysertyrthrphe202530valprotrpleuleuserphelysargglyseralaleugluglulys354045gluasnlysileleuvallysgluthrglytyrphepheiletyrgly505560glnvalleutyrthrasplysthrtyralametglyhisleuilegln65707580arglyslysglyglyserleuvalthrleupheargcysileglnasn859095metprogluthrleuproasnasnsercystyrseralaglyileala100105110lysleuglugluglyaspgluleuglnleualaileproarggluasn115120125alaglnileserleuaspglyaspvalthrphepheglyalaleulys130135140leuleu145<210>2<211>448<212>prt<213>人工序列<400>2alavalglnglyproglugluthrvalthrglnaspcysleuglnleu151015ilealaaspsergluthrprothrileglnlysglysertyrthrphe202530valprotrpleuleuserphelysargglyseralaleugluglulys354045gluasnlysileleuvallysgluthrglytyrphepheiletyrgly505560glnvalleutyrthrasplysthrtyralametglyhisleuilegln65707580arglyslysglyglyserleuvalthrleupheargcysileglnasn859095metprogluthrleuproasnasnsercystyrseralaglyileala100105110lysleuglugluglyaspgluleuglnleualaileproarggluasn115120125alaglnileserleuaspglyaspvalthrphepheglyalaleulys130135140leuleuglyglyglyglyseralavalglnglyproglugluthrval145150155160thrglnaspcysleuglnleuilealaaspsergluthrprothrile165170175glnlysglysertyrthrphevalprotrpleuleuserphelysarg180185190glyseralaleugluglulysgluasnlysileleuvallysgluthr195200205glytyrphepheiletyrglyglnvalleutyrthrasplysthrtyr210215220alametglyhisleuileglnarglyslysglyglyserleuvalthr225230235240leupheargcysileglnasnmetprogluthrleuproasnasnser245250255cystyrseralaglyilealalysleuglugluglyaspgluleugln260265270leualaileproarggluasnalaglnileserleuaspglyaspval275280285thrphepheglyalaleulysleuleuglyglyglyglyseralaval290295300glnglyproglugluthrvalthrglnaspcysleuglnleuileala305310315320aspsergluthrprothrileglnlysglysertyrthrphevalpro325330335trpleuleuserphelysargglyseralaleugluglulysgluasn340345350lysileleuvallysgluthrglytyrphepheiletyrglyglnval355360365leutyrthrasplysthrtyralametglyhisleuileglnarglys370375380lysglyglyserleuvalthrleupheargcysileglnasnmetpro385390395400gluthrleuproasnasnsercystyrseralaglyilealalysleu405410415glugluglyaspgluleuglnleualaileproarggluasnalagln420425430ileserleuaspglyaspvalthrphepheglyalaleulysleuleu435440445<210>3<211>21<212>prt<213>人工序列<400>3metalaleuprovalthralaleuleuleuproleualaleuleuleu151015hisalaalaargpro20<210>4<211>45<212>prt<213>人工序列<400>4thrthrthrproalaproargproprothrproalaprothrileala151015serglnproleuserleuargproglualacysargproalaalagly202530glyalavalhisthrargglyleuaspphealacysasp354045<210>5<211>24<212>prt<213>人工序列<400>5iletyriletrpalaproleualaglythrcysglyvalleuleuleu151015serleuvalilethrleutyrcys20<210>6<211>42<212>prt<213>人工序列<400>6lysargglyarglyslysleuleutyrilephelysglnprophemet151015argprovalglnthrthrglnglugluaspglycyssercysargphe202530proglugluglugluglyglycysgluleu3540<210>7<211>112<212>prt<213>人工序列<400>7argvallyspheserargseralaaspalaproalatyrglnglngly151015glnasnglnleutyrasngluleuasnleuglyargarggluglutyr202530aspvalleuasplysargargglyargaspproglumetglyglylys354045proargarglysasnproglngluglyleutyrasngluleuglnlys505560asplysmetalaglualatyrsergluileglymetlysglygluarg65707580argargglylysglyhisaspglyleutyrglnglyleuserthrala859095thrlysaspthrtyraspalaleuhismetglnalaleuproproarg100105110<210>8<211>397<212>prt<213>人工序列<400>8metalaleuprovalthralaleuleuleuproleualaleuleuleu151015hisalaalaargproalavalglnglyproglugluthrvalthrgln202530aspcysleuglnleuilealaaspsergluthrprothrileglnlys354045glysertyrthrphevalprotrpleuleuserphelysargglyser505560alaleugluglulysgluasnlysileleuvallysgluthrglytyr65707580phepheiletyrglyglnvalleutyrthrasplysthrtyralamet859095glyhisleuileglnarglyslysglyglyserleuvalthrleuphe100105110argcysileglnasnmetprogluthrleuproasnasnsercystyr115120125seralaglyilealalysleuglugluglyaspgluleuglnleuala130135140ileproarggluasnalaglnileserleuaspglyaspvalthrphe145150155160pheglyalaleulysleuleuserglyglyglyseraspprothrthr165170175thrproalaproargproprothrproalaprothrilealasergln180185190proleuserleuargproglualacysargproalaalaglyglyala195200205valhisthrargglyleuaspphealacysaspiletyriletrpala210215220proleualaglythrcysglyvalleuleuleuserleuvalilethr225230235240leutyrcyslysargglyarglyslysleuleutyrilephelysgln245250255prophemetargprovalglnthrthrglnglugluaspglycysser260265270cysargpheproglugluglugluglyglycysgluleuargvallys275280285pheserargseralaaspalaproalatyrglnglnglyglnasngln290295300leutyrasngluleuasnleuglyargarggluglutyraspvalleu305310315320asplysargargglyargaspproglumetglyglylysproargarg325330335lysasnproglngluglyleutyrasngluleuglnlysasplysmet340345350alaglualatyrsergluileglymetlysglygluargargarggly355360365lysglyhisaspglyleutyrglnglyleuserthralathrlysasp370375380thrtyraspalaleuhismetglnalaleuproproarg385390395<210>9<211>699<212>prt<213>人工序列<400>9metalaleuprovalthralaleuleuleuproleualaleuleuleu151015hisalaalaargproalavalglnglyproglugluthrvalthrgln202530aspcysleuglnleuilealaaspsergluthrprothrileglnlys354045glysertyrt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