本发明属于生物技术领域，具体涉及一种富含黄酮和多酚的古尼虫草菌丝体及其生产方法。
背景技术：
古尼虫草（cordycepsgunnii）在我国主要分布在贵州、湖南、安徽等省，在贵州有被作为中草药使用的历史，其无性型为古尼拟青霉（paecilomycesgunnii）。1990年进行了初步的人工栽培，获得少数的子实体（刘杰麟，等.1990）。由于其子实体规模化栽培难度较大，使得古尼虫草菌丝体液体发酵生产得到较多研究，叶昌秀(2003，2004，2005)对用发酵罐（15m3）进行深层发酵进行了报道，并对菌丝体的蛋白质、氨基酸等成分进行了测定。而傅岚等人（2004）报道了古尼虫草菌丝体培养的液体深层发酵条件，并测定了菌丝体中碱溶性多糖、甘露醇，分离纯化得到7个单体化合物。目前，已经有众多研究证实：葡萄糖、蔗糖等小分子糖及淀粉等碳源和蛋白胨、酵母膏等氮源均利于古尼虫草菌丝体的生长（曹蕾等，1991；李连德等，2002；傅岚等，2004）。古尼虫草液体发酵所得的菌丝体具有镇痛(陈小荣,2009)、调节机体免疫力、抗癌、改善和增强记忆等多种药理作用(甘卓亭等，2019)。除了以菌丝体为发酵目标产物外，多糖是另一被研究的发酵产物。研究报道古尼虫草产多糖的最适碳源、氮源和无机盐等条件（孟泽彬等，2016；zhuetal.2016）。专利“一种古尼虫草多糖的制备方法cn201611053866.4”报道以古尼虫草菌丝粉为原料制备多糖的方法。而关于古尼虫草黄酮的研究，张永明等人（2007）报道了以古尼虫草子实体为材料进行黄酮提取的研究。目前未见有关提高古尼虫草菌丝体中黄酮和多酚含量的报道。
黄酮和多酚是不少中草药、菌物药常见的次级代谢产物，也是主要的抗氧化活性物质。采用深层发酵技术生产富含黄酮和多酚的菌丝体是开发应用古尼虫草这一珍贵菌物资源的有效途径。本发明旨在提供一种富含黄酮和多酚的古尼虫草菌丝体及其生产方法。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种富含黄酮和多酚的古尼虫草菌丝体及其生产方法。
本发明通过如下步骤来实现：
1、古尼虫草母种的分离与培养
以野生的新鲜古尼虫草子实体连同寄主为材料，以组织分离或多孢分离的方式获得古尼虫草菌种。菌种经转管、纯化等确定为纯培养物，即可用于菌丝体培养。菌种分离和培养的培养基为pda培养基，菌种于20－25℃下暗培养15－30天，菌丝长至斜面培养基2/3，即可使用。
2、一级液体菌种制备
将母种接种于一级液体培养基（配方：土豆10%－20%，葡萄糖1%－3%，蛋白胨0.5%－1%，酵母浸粉0.1%－0.3%，ph6.0－6.5。土豆切至1cm3大小，置于适量水中煮沸，保持微沸20min，用两层纱布过滤，取滤汁，用于一级液体培养基配制），20－28oc下，100－180r/min振荡培养7－10天，菌丝球充满液体培养基，且大小均匀一致，即可作为一级菌种使用。
3、二级液体菌种制备
将一级液体菌种接种于二级液体培养基（配方：蔗糖1%－3%，氮源0.5%－1%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.1%，ph6.0－6.5，氮源可选蛋白胨或黄豆粉或酵母浸出粉中的一种）中，接种量为5%－20%（v/v），20－28℃下，100-180r/min振荡培养3－7天，菌丝球充满液体培养基，且大小均匀一致，即可作为二级菌种使用。也可采用发酵种子罐进行二级菌种制备，二级液体培养基配方中添加消泡剂0.1%，发酵罐各参数如下：通气量为8－10l/min，搅拌速度为150－180r/min，温度20－28℃，发酵时间为45－70h。
4、培养富含黄酮和多酚的古尼虫草菌丝体
配制培养专用培养基，配方是碳源2%－4%，氮源0.8%－1.5%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.1%，消泡剂0.1%，ph6.0－6.5，碳源可选可溶性淀粉或乳糖中的一种；氮源可选蛋白胨或黄豆粉或酵母浸出粉中的一种。将二级液体菌种接种至专用培养基中，接种量为5%－20%（v/v）。20-28℃下，100-180r/min振荡培养3-7天。或者在发酵罐中进行培养，培养条件如下：通气量为8－10l/min，搅拌速度为150－180r/min，温度20－28℃，发酵时间为50－80h。
5、收集菌丝体
培养结束后，利用离心（5000r/min或以上，离心10－15min）、厢式压滤机、尼龙网等方式进行菌丝体收集，再进行风热或冻干等方法进行干燥。菌丝体中含黄酮不低于7.0mg/g、多酚不低于20mg/g。
具体实施方式
下面结合具体实施方法对本发明进一步说明，但本发明不限于以下实施例。
实例一
1、古尼虫草母种的分离与培养
以野生的新鲜古尼虫草子实体为材料，以组织分离方式获得古尼虫草菌种。挑取子实体菌肉接种于pda培养基，于20－25℃下暗培养15天，菌丝长至2/3斜面培养基，即为古尼虫草母种。将获得的菌种进行转管继代培养，观察其纯度，确保为纯培养物即可使用。
2、一级液体菌种制备
将母种接种于一级液体培养基（配方：土豆10%，葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，酵母浸粉0.1%，ph6.0。土豆切至1cm3大小，置于适量水中煮沸，保持微沸20min，用两层纱布过滤，取滤汁，用于一级液体培养基配制），20oc下，100r/min振荡培养10天，菌丝球充满液体培养基，且大小均匀一致，即可作为一级菌种使用。
3、二级液体菌种制备
将一级液体菌种接种于二级液体培养基（配方：蔗糖1%，蛋白胨0.5%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.1%，ph6.0）中，接种量为5%（v/v），20℃下，100r/min振荡培养7天，菌丝球充满液体培养基，且大小均匀一致，即可作为二级菌种使用。
4、培养富含黄酮和多酚的古尼虫草菌丝体
配制培养专用培养基，配方是可溶性淀粉2%，蛋白胨0.8%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.1%，消泡剂0.1%，ph6.0。将二级液体菌种接种至专用培养基中，接种量为5%（v/v）。20℃下，100r/min振荡培养7天。
5、收集菌丝体
培养结束后，利用离心方法收集菌丝体，5000r/min离心15min，再将菌丝体进行冻干干燥。菌丝体产量为12g/l，菌丝体中含黄酮为12mg/g、含多酚21mg/g。
实例二
1、古尼虫草母种的分离与培养
以野生的新鲜古尼虫草的寄主为材料，以组织分离方式获得古尼虫草菌种。挑取寄主虫体内菌核组织接种于pda培养基，于25℃下暗培养10天，菌丝长至斜面培养基的2/3，即为古尼虫草母种。将获得的菌种进行转管继代培养，观察其纯度，确保为纯培养物即可使用。
2、一级液体菌种制备
将母种接种于一级液体培养基（配方：土豆20%，葡萄糖2%，蛋白胨0.8%，酵母浸粉0.2%，ph6.5。土豆切至1cm3大小，置于适量水中煮沸，保持微沸20min，用两层纱布过滤，取滤汁，用于一级液体培养基配制），25℃下，120r/min振荡培养8天，菌丝球充满液体培养基，且大小均匀一致，即可作为一级菌种使用。
3、二级液体菌种制备
将一级液体菌种接种于二级液体培养基（配方：蔗糖2%，酵母浸出粉1%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.1%，消泡剂0.1%，ph6.5）中，接种量为10%（v/v）。采用发酵种子罐进行二级菌种制备，发酵罐各参数如下：通气量为8l/min，搅拌速度为150r/min，温度25℃，发酵时间为50h。
4、培养富含黄酮和多酚的古尼虫草菌丝体
配制培养专用培养基，配方是可溶性淀粉2%，酵母浸出粉0.8%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.1%，消泡剂0.1%，ph6.0。将二级液体菌种接种至专用培养基中，接种量为10%（v/v）。在发酵罐中进行培养，培养条件如下：通气量为10l/min，搅拌速度为180r/min，温度25℃，发酵时间为60h。
5、收集菌丝体
培养结束后，利用厢式压滤机进行菌丝体收集，再烘干的方法进行干燥。菌丝体产量为13g/l，菌丝体中含黄酮12.8mg/g、多酚24mg/g。
实例三
1、古尼虫草母种的分离与培养
以野生的新鲜古尼虫草的寄主为材料，以组织分离方式获得古尼虫草菌种。挑取寄主虫体内菌核组织接种于pda培养基，于25℃下暗培养10天，菌丝长至斜面培养基的2/3，即为古尼虫草母种。将获得的菌种进行转管继代培养，观察其纯度，确保为纯培养物即可使用。
2、一级液体菌种制备
将母种接种于一级液体培养基（配方：土豆20%，葡萄糖3%，蛋白胨1%，酵母浸粉0.3%，ph6.5。土豆切至1cm3大小，置于适量水中煮沸，保持微沸20min，用两层纱布过滤，取滤汁，用于一级液体培养基配制），28oc下，180r/min振荡培养7天，菌丝球充满液体培养基，且大小均匀一致，即可作为一级菌种使用。
3、二级液体菌种制备
将一级液体菌种接种于二级液体培养基（配方：蔗糖3%，黄豆粉1%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.1%，ph6.5）中，接种量为15%（v/v），28℃下，180r/min振荡培养3天，菌丝球充满液体培养基，且大小均匀一致，即可作为二级菌种使用。
4、培养富含黄酮和多酚的古尼虫草菌丝体
配制培养专用培养基，配方是乳糖3%，黄豆粉1.5%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.1%，消泡剂0.1%，ph6.5。将二级液体菌种接种至专用培养基中，接种量为10%（v/v）。28℃下，180r/min振荡培养4天。
5、收集菌丝体
培养结束后，利用200目的尼龙网进行菌丝体收集，用冻干方式对菌丝体进行干燥。菌丝体中含黄酮10.0mg/g、多酚22mg/g。
对比实例一
本对比例是针对实施例一设置的，与实施例一同步实施。
1、古尼虫草母种的分离与培养
参考实例一。
2、一级液体菌种制备
参考实例一。
3、二级液体菌种制备
参考实例一。
4、培养古尼虫草菌丝体
此对比实例不采用富含黄酮和多酚的古尼虫草菌丝体专用培养基，而是采用对比配方，配方具体为：蛋白胨0.8%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.1%，消泡剂0.1%，ph6.0。余下的培养步骤及条件同实施例一步骤4。不同之处仅在于：培养基中不添加可溶性淀粉2%。
5、收集菌丝体
培养结束后，利用离心方法收集菌丝体，5000r/min离心15min，再将菌丝体进行冻干干燥。菌丝体产量为1.16g/l，菌丝体中含黄酮为1.5mg/g、含多酚7.7mg/g。
对比实例二
本对比例是针对实施例二设置的，与实施例二同步实施。
1、古尼虫草母种的分离与培养
参考实例二。
2、一级液体菌种制备
参考实例二。
3、二级液体菌种制备
参考实例二。
4、培养古尼虫草菌丝体
此对比实例不采用富含黄酮和多酚的古尼虫草菌丝体专用培养基，而是采用对比配方，配方具体为：可溶性淀粉2%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.1%，消泡剂0.1%，ph6.0。余下的培养步骤及条件同实施例二步骤4。不同之处仅在于：培养基中不添加酵母浸出粉0.8%。
5、收集菌丝体
培养结束后，利用厢式压滤机进行菌丝体收集，再烘干的方法进行干燥。菌丝体产量为1.21g/l，菌丝体中含黄酮2.19mg/g、多酚7.91mg/g。
实施例一中获得的菌丝体产量为12g/l，菌丝体中含黄酮为12mg/g、含多酚21mg/g，而对比实例一中获得的菌丝体产量为1.16g/l，菌丝体中含黄酮为1.5mg/g、含多酚7.7mg/g；黄酮和多酚的含量分别提高了7倍和1.7倍。实施例二中获得的菌丝体产量为13g/l，菌丝体中含黄酮12.8mg/g、多酚24mg/g，而对比实例二中获得的菌丝体产量为1.21g/l，菌丝体中含黄酮2.19mg/g、多酚7.91mg/g；黄酮和多酚的含量分别提高了4.8倍和2倍。
通过对以上实施例一、二和对比例一、二的比较分析，证实采用富含黄酮和多酚的古尼虫草菌丝体专用培养基可显著提高这两种成分的含量，实现本发明的目的。
富含黄酮和多酚的古尼虫草菌丝体的抗氧化活性分析：
参照文献（叶琦,等.维药洋甘菊化学成分及dpph自由基清除活性研究,天然产物研究与开发.http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1335.q.20191023.1646.006.html），对古尼虫草菌丝体的水提物和乙醇提取物进行了抗氧化活性测定。两种提取物对dpph自由基清除率均在90%以上。