一种检测细菌核酸的方法、芯片及在龋齿检测中的应用

1.本发明属于分子诊断领域，具体涉及一种检测细菌核酸的方法、芯片及在龋齿检测中的应用。


背景技术：

2.龋齿是发生在牙齿的慢性感染性疾病，被认为是人来最普遍的感染性疾病之一。其发病趋势呈渐进性和不可逆性，直接导致牙齿组织的缺损乃至整个牙齿缺失，并引发一系列的感染和疼痛。变异链球菌和远缘链球菌，已被认为是人类龋齿的病原体。一些研究表明，远缘链球菌的流行与龋齿活动的关联性高于变异链球菌，而远缘链球菌与变异链球菌相比也具有更高的产酸能力。据报道，携带变异链球菌和远缘链球菌的儿童龋齿发生率明显高于单独携带变异链球菌的儿童。因此，对两种链球菌的检测为龋齿的预测、治疗及预防尤为重要。
3.目前，已经发展了多种方法用于检测变异链球菌和远缘链球菌。例如，直接显微镜观察，培养，酶试验，单克隆抗体，酶联免疫分析和物种特异性dna探针等。后来，聚合酶链式反应(pcr)用来检测和辨别变异链球菌和远缘链球菌，然而，pcr需要精密的仪器来精确地控制反应温度，携带不便且价格较贵，不适于临床的牙齿诊断。随后，发展了环介导等温扩增技术(lamp)，这种方法大大提高了检测的灵敏度，但是，这些方法涉及复杂的引物/模板设计和具有固有的非特异性背景扩增的耗时的实验程序。因此，迫切需要开发一种不涉及任何核酸扩增的简单方法用于灵敏检测细菌核酸的方法。


技术实现要素：

4.为解决上述问题，本发明提出了一种检测细菌核酸的方法，将离心式微流控芯片与基于双链特异性核酸酶辅助的靶循环和探针切割的比色法结合，用于灵敏地检测和辨别变异链球菌和远缘链球菌。
5.为实现上述目的，本发明一方面提供了一种检测细菌核酸的方法，包括以下步骤：
6.s1：将探针、扩增试剂、待测菌的rna、显色试剂混匀；所述探针为具有茎环结构的发夹探针，由三个片段组成：(1)3'末端设计能够形成g-四链体的序列，(2)在5'末端的9个碱基能够与3'末端部分g-四链体序列互补配对，阻碍g-四链体的形成，(3)一个环状区域；
7.s2：进行等温扩增反应；
8.s3：通过比色反应对细菌中的16s rrna进行可视化检测，通过颜色深浅来判断细菌中16s rrna含量的高低。
9.所述扩增试剂为双链特异性核酸酶(dsn)及其缓冲溶液。
10.所述显色剂为abts。
11.所述离心转速为2000-3000rpm,离心时间为30秒。
12.本发明的方法是非诊断非治疗的。
13.本发明另一方面提供了一种用于检测细菌核酸的微流控芯片，所述芯片包括至少
1个反应单元，所述检测单元包括第一进样口、第二进样口、第三进样口、混合通道和反应室，所述第一进样口和第二进样口靠近圆心，所述反应室位于芯片边缘，所述第一进样口和第二进样口与混合通道的一端相连，混合通道的另一端与反应室相连，反应室与第三通道进样口相连。
14.在第一进样口加入探针、扩增试剂，在第二进样口加入待测菌的rna，在第三进样口加入显色试剂，通过混合通道进入反应室进行等温扩增反应。
15.所述混合通道为曲折形状。
16.进一步的，所述芯片包含4-12个反应单元，优选为8-10个反应单元。
17.又一方面，本发明提供了一种检测细菌核酸的方法在龋齿检测中的应用。
18.所述一种检测细菌核酸的方法在龋齿检测中的应用，具体包括对龋齿中变异链球菌和远缘链球菌16s rrna的检测。
19.所述一种检测细菌核酸的方法在龋齿检测中的应用，具体包括通过颜色深浅来判断细菌中16s rrna含量的高低，并且将患龋齿的程度划分为四个等级：无、低风险、中风险、高风险。
20.本发明的有益效果为：
21.1.原理简单，成本低，用时少：本发明方案，相比于聚合酶链式反应(pcr)，不需要精密的仪器来控制反应温度，利用比色法，通过肉眼观察便可以达到对16s rrna的直观可视化检测，大大简化了信号的输出形式、缩短分析时间、降低了实验成本。
22.2.灵敏度高：本发明方案中，设计的发夹探针将富g序列包含在茎状区域，降低实验的背景信号。我们引入双链特异性核酸酶介导的信号扩增，可以通过简单的反应过程有效地消除非特异性扩增的风险，从而达到很高的灵敏度。
23.3.特异性好：本发明优异的特异性是由于双链特异性核酸酶对于完全匹配的双链体具有比非完全匹配的双链体更高的切割活性。因此大幅降低了非特异性扩增可能产生的干扰信号。进而达到很高的特异性。
24.4.结合离心式微流控芯片技术，能够对待测靶标进行高通量检测，且能够同时检测多个样本，实现龋齿细菌16s rrna的精准分析。
25.5.将该检测系统应用于临床实际样品的检测，为基础研究和临床应用提供技术支撑。
附图说明
26.在所属附图中，相同部分和特征具有相同的附图标记。许多附图为示意图，其比例可能不准确。
27.图1为基于比色法的可视化离心式微流控芯片的方案原理说明；
28.图中：a.芯片设计示意图；b.芯片中的扩增反应原理。
29.图2为具有8个反应单元的微流控芯片结构。
具体实施方式
30.为便于对本发明实施例的理解，下面将结合附图以几个具体实施例做进一步的解释说明，且各个实施例并不构成对本发明实施例的限定。此外，附图为示意图，因此本发明
装置和设备并不受所述示意图的尺寸或比例限制。
31.需要说明的是，在本专利的权利要求和说明书中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。
32.实验原理：
33.针对靶标16s rrna的具有茎环结构的发夹探针，由三个片段组成：(1)在3'末端设计形成g-四链体的序列，(2)在5'末端的9个碱基能够与部分g-四链体序列互补配对，阻碍g-四链体的形成，(3)一个环状区域。当靶标16s rrna不存在时，具有茎环结构的发夹探针保持原来的结构，不能产生富g的片段，因此无法检测到比色信号。当靶标16s rrna存在时，发夹探针与靶16s rrna杂交形成探针-靶16s rrna双链体，其探针链被双链特异性核酸酶识别及消化，从而释放靶16s rrna并且产生富g的片段。释放的靶16s rrna可以与新的发夹探针杂交形成新的探针-靶16s rrna双链体，引发多个发夹探针链的循环消化。产生的富g片段在血红素的作用下形成具有催化作用的g-四链体，通过过氧化氢和abts在g-四链体催化作用下发生氧化还原反应，最终abts被氧化成abts
+
，产生明显的肉眼可见的绿色信号，可以简单地检测靶16s rrna。
34.实施例1
35.一、微流控芯片的设计：
36.①
设计芯片结构，进行菲林掩膜打印。将清洗过的硅片滴上su-8光刻胶进行甩胶，后将其覆盖掩膜，在曝光机下进行曝光，并用显影液将未固化部分清洗干净，得到硅片模板。
37.②
将pdms单体与固化剂按一定比例混匀，得到pdms高聚物。将pdms高聚物倒在硅片模板上，烘干后得到带有通道结构的pdms芯片。
38.③
将带有通道结构的pdms芯片上用冲子打出进样口。下层芯片为pdms光滑基片，无刻蚀图案。
39.④
上下两层芯片低温键合，置于70℃过夜恢复芯片疏水性。
40.微流控芯片反应单元结构示意图如图1a所示。每一个反应单元包括进样口、混合通道、反应室。将检测靶标16s rrna、扩增试剂、显色试剂分别加入到三个进样口，通过混合通道进入反应室进行酶辅助的扩增反应，最终在反应室显示肉眼可见的绿色。从而达到对变异链球菌和远缘链球菌16s rrna的可视化检测。图2所示为具有8个反应单元的微流控芯片结构。
41.二、原理说明：
42.在第一进样口加入发夹探针、双链特异性核酸酶以及反应缓冲溶液，在第二进样口加入靶标16s rrna，在第三进样口加入过氧化氢、abts等显色试剂。各种反应试剂加入进样口之后，通过3000rpm离心30秒进行混匀使靶标16s rrna、扩增试剂、显色试剂在反应室混匀，于55℃下进行扩增反应。当靶标16s rrna存在时，发夹探针与靶16s rrna杂交形成探针-靶16s rrna双链体，其探针链被双链特异性核酸酶识别及消化，从而释放靶16s rrna并且产生富g的片段。释放的靶16s rrna可以与新的发夹探针杂交形成新的探针-靶16s rrna双链体，引发多个发夹探针链的循环消化。产生的富g片段在血红素的作用下形成具有催化作用的g-四链体，通过过氧化氢和abts在g-四链体催化作用下发生氧化还原反应，abts被
氧化成abts
+
，最终在反应室内观察到明显的肉眼可见的绿色信号。通过比色反应可以简单地检测靶16s rrna。原理示意图如图1b。
43.此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。