一种来源于大麦的参与硝态氮调控的转录因子HvNLP2及其用途的制作方法

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种来源于大麦的参与硝态氮调控的转录因子hvnlp2及其用途。

背景技术：

氮素是植物生长发育所需的大量元素之一，现代农业的高产稳产离不开氮肥的施用。麦类作物是我国的主要粮食作物之一，主要在其出苗期、拔节期和灌浆期等3个生长发育的阶段需要大量的氮，施用适量的氮肥能促进小麦根、茎、叶等生长发育，从而提高光合效率和营养物质的积累；施用氮素还可以促进植株的分蘖和幼穗的分化发育，有利于花、籽粒等生殖器官的生长发育(王公卿etal.,2017)。施用氮肥能够提高植株中氧化酶的活性，增加细胞质膜的稳定性，从而加强小麦叶片细胞膜的保护功能，对小麦生长发育起促进作用(赵若含etal.,2020)。氮素可以在一定程度上改善作物对水分的吸收和利用，提高作物的渗透调节和气孔导度调节能力，提高叶片净光合速率(pn)。盆栽试验条件下，混施硝态氮和尿素时小麦叶绿素含量较高；而水培试验条件下混施硝态氮和尿素，小麦则是在生长中后期叶绿素含量最高，说明氮素形态会影响作物叶片中的叶绿素含量(曹翠玲and李生秀,2004)。氮素积累和再分配是决定籽粒产量和籽粒品质的重要过程，而施氮量的多少会直接影响作物的发育，施氮量不足时氮素参与的代谢过程受到影响，施氮过量会抑制植物酶活性影响生长发育。合理施用氮肥可以提高作物各生育阶段、特别是生育后期对氮素吸收强度，这是提高作物籽粒产量和蛋白质含量的基础，研究认为0-266.55kg/hm²的施氮量是小麦重要的氮素调节区，在这个区间内随着施氮量增加，籽粒产量、蛋白质含量和产量都会相应增加(王公卿etal.,2017)。开花前的氮积累是籽粒中氮的主要来源，过量施氮会降低麦类作物花前积累的氮素向籽粒转运的效率，从而影响籽粒中的蛋白质含量，导致小麦产量和籽粒品质的下降(张玉春etal.,2018)。

大多数陆生作物如玉米、小麦等都是以吸收硝态氮为主。硝态氮不仅是植物生长发育所需的营养物质，同时也是重要的信号分子，调控植物体内基因的表达及各个生物进程。植物对硝态氮的吸收和转运主要是通过硝态氮转运蛋白家族(nrt1s、nrt2s、clcs和slac/slch)起作用，而硝态氮转运蛋白作用的时空性和强度是受硝态氮调控基因控制的(krappetal.,2014；steineretal.,1995)。吸收进入植物体内的硝态氮在硝态氮还原酶(nr)、亚硝态氮还原酶(nir)的作用下被还原为铵，再经由gs-gogat途径被还原为氨基酸和各种有机氮被植物利用，以维持植物正常的生长发育。硝态氮也是重要的信号分子，能够参与调控植物体内基因的表达及各个生物进程。硝态氮信号的作用可以分成短期效应和长期效应。短期效应是指植物对硝态氮的初级响应，即经硝态氮处理后，植物中一些基因的表达会在短期内发生改变如nrt1.1、nia1、nir、nrt2.1等。长期效应是指较长时间的硝态氮处理对植物生长发育产生的影响，包括种子萌发、根的形态建成、植物开花、气孔运动等。目前已鉴定出多个调控硝态氮信号的基因，如硝态氮感应子nrt1.1、可变剪切因子cpsf30、fip1、蛋白激酶cipk8、cipk23、转录因子nlp7、tga1/4、tcp20等。其中nlp7是重要的硝态氮调控因子，属于nlp(nin-likeproteins)转录因子蛋白家族，包括9个成员，它们都含有两个保守的结构域rwp-rk和pb1，其中rwp-rk结构域可以结合到dna元件上进而调控下游靶基因的表达。研究表明nlp7可通过与硝态氮顺式响应nre结合调控氮素相关基因的表达，进而影响植物对硝态氮的初级响应和同化利用，调控植物的生长发育(marchiveetal.,2013)。

麦类作物是世界上重要的粮食作物，其功能基因组研究对于全球粮食安全有着极为重要的意义。按总产量来算，小麦、大麦分别是世界第二、第四大禾谷类作物，同属禾本科小麦族(triticeae)。栽培小麦是六倍体，其基因组大且十分复杂，而大麦是二倍体，其基因组(5.1gb)远小于六倍体小麦(17gb)，而且基本染色体组和小麦一样均包含7个染色体，在基因组成和排列上与小麦高度保守，具有比其它作物更高的遗传相似性，所以成为研究麦类作物的模式植物。tilling(targetinginducedlocallesionsingenomes)是功能基因组学研究中通过反向遗传学方法研究基因功能的有效技术，具有高通量、低成本、不依赖于基因型等特点(mccallumetal.,2000)。该技术借助高通量的检测手段，快速有效地从化学诱变的突变群体中筛选出目的基因的突变体。tilling技术已广泛应用在拟南芥、水稻等作物的功能基因组学研究，其中在大麦上国际上共建成了三个tilling群体。在我国，作物学国家重点实验室的付道林实验室最近建立了一套大麦tilling体系，经鉴定和应用，证明该体系能快速、有效地筛选出目的基因的突变体(胡鑫etal.,2012)。这是国内报道的第一个大麦tilling群体，为麦类作物功能基因组学研究创造了条件。大麦上关于硝态氮调控方面的分子生物学研究尚十分缺乏，到目前为止仅有对硝态氮转运家族nrt2成员的克隆和鉴定，有关硝态氮调控基因的研究尚未见报道。运用反向遗传学的方法对大麦硝态氮代谢相关基因的研究也没有文献报道。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明的目的是对大麦硝态氮代谢相关基因进行研究。本发明从大麦基因组中发现了一个新的参与硝态氮调控的转录因子hvnlp2，该转录因子hvnlp2能够与nre结合并具有转录激活功能，过表达hvnlp2能促进植物对硝态氮信号的初级响应且能提高植物对硝态氮的同化利用效率。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种来源于大麦的参与硝态氮调控的转录因子hvnlp2，所述转录因子hvnlp2的氨基酸序列如seqidno.2所示。

本发明的第二方面，提供编码转录因子hvnlp2的基因hvnlp2，所述基因hvnlp2为如下a)-c)中任一项所述的dna片段：

a)seqidno.1所示的dna片段；或

b)除a)以外的编码seqidno.2所示氨基酸序列的dna片段；

c)dna片段，与a)或b)限定的dna片段具有90％或90％以上同一性，且编码的蛋白在功能上与seqidno.2所示的蛋白等价。

本发明的第三方面，提供上述转录因子hvnlp2或者编码转录因子hvnlp2的基因hvnlp2在如下(1)-(6)至少一项中的应用：

(1)增强植物体内硝态氮还原酶的活性；

(2)增加植物体内氨基酸的含量；

(3)促进植物体内硝态氮同化相关基因的表达；

(4)促进植物对硝态氮信号的初级响应；

(5)提高植物对硝态氮的同化利用效率；

(6)与下游靶基因启动子上的硝酸顺式作用元件结合并调控其表达。

上述应用中，植物体内硝态氮同化相关基因包括：基因nrt2.1、hho1和hrs1。

本发明的第四方面，提供含有基因hvnlp2的表达载体、细胞系或者宿主菌在提高植物对氮素利用率中的应用。

本发明的第五方面，提供一种提高植物对氮素利用率的方法，包括：将hvnlp2基因或者含有上述hvnlp2基因的表达载体、细胞系和/或宿主菌导入目标植物或植物组织，并使hvnlp2基因过表达。

本发明的第六方面，提供基因hvnlp2或者含有基因hvnlp2的表达载体、细胞系或者宿主菌在培育高氮效作物品种中的应用。

本发明的第七方面，提供一种高氮效作物品种的培育方法，包括以下步骤：

将基因hvnlp2转入出发植株中，获得高氮效作物；或者上调出发植株基因组中基因hvnlp2的表达，筛选得到氮利用率提高的植株。

优选的，将基因hvnlp2转入出发植株中的方法包括：聚乙二醇法、农杆菌介导法或基因枪轰击法。

本发明的第八方面，提供如下(1)-(3)任一物质在提高植物主根长度和侧根数目中的应用：

(1)seqidno.2所示的蛋白；

(2)seqidno.2所示蛋白的编码基因；

(3)含有(2)所述编码基因的植物表达载体、转基因细胞系或重组菌。

本发明的第九方面，提供如下(1)-(3)任一物质在提高植株鲜重和干重中的应用：

(1)seqidno.2所示的蛋白；

(2)seqidno.2所示蛋白的编码基因；

(3)含有(2)所述编码基因的植物表达载体、转基因细胞系或重组菌。

本发明的有益效果：

本发明首次从大麦中发现了一个参与硝态氮调控的转录因子hvnlp2，该转录因子hvnlp2能够与nre结合并具有转录激活功能，过表达hvnlp2能促进植物对硝态氮信号的初级响应且能提高植物对硝态氮的同化利用效率。本发明为提高作物的氮素利用率、培育高氮效作物新品种提供了新的思路与方向。

附图说明

图1：hvnlp2拟南芥异源表达株系荧光表型观察。拟南芥wt、nlp7-4、hvnlp2/nlp7-4-1、hvnlp2/nlp7-4-2和hvnlp2m/nlp7-4-2在kno3培养基培养上生长5天，利用荧光显微镜观察根部荧光。其中wt：野生型，nlp7-4：拟南芥nlp7突变体，hvnlp2/nlp7-4-1和hvnlp2/nlp7-4-2：hvnlp2在拟南芥nlp7突变体的转基因株系，hvnlp2m/nlp7-4-2：含有突变位点的hvnlp2在拟南芥nlp7突变体的转基因株系。

图2：大麦hvnlp2突变体和hvnlp2拟南芥异源表达株系中硝态氮响应基因表达量的检测。大麦tamalpais和hvnlp2(图2a)以及拟南芥wt、nlp7-4、hvnlp2/nlp7-4-1和hvnlp2/nlp7-4-2(图2b)在只有nh4⁺为氮源的培养基上生长7天后，分别用10mmkno3和10mmkcl(作为对照)处理2小时，取根并提取rna用于qpcr检测，其中tamalpais：大麦野生型，hvnlp2：大麦hvnlp2突变体，wt：拟南芥野生型，nlp7-4：拟南芥nlp7突变体，hvnlp2/nlp7-4-1和hvnlp2/nlp7-4-2：hvnlp2在拟南芥nlp7突变体的转基因株系。

图3-图5：大麦hvnlp2突变体和hvnlp2拟南芥异源表达株系对no3^-同化利用的调控。大麦tamalpais和hvnlp2以及拟南芥wt、nlp7-4、hvnlp2/nlp7-4-1和hvnlp2/nlp7-4-2在1/2ms培养上生长7天，取全苗用于相关实验的检测。植株全苗中的no3^-含量(图3)、硝态氮还原酶(nr)活性(图4)、氨基酸含量(图5)的检测。其中tamalpais：大麦野生型，hvnlp2：大麦hvnlp2突变体，wt：拟南芥野生型，nlp7-4：拟南芥nlp7突变体，hvnlp2/nlp7-4-1和hvnlp2/nlp7-4-2：hvnlp2在拟南芥nlp7突变体的转基因株系。

图6：大麦hvnlp2突变体和hvnlp2拟南芥异源表达株系中硝态氮同化基因表达量的检测。大麦tamalpais和hvnlp2以及拟南芥wt、nlp7-4、hvnlp2/nlp7-4-1和hvnlp2/nlp7-4-2在1/2ms培养上生长7天，取全苗并提取rna用于qpcr检测。其中tamalpais：野生型，hvnlp2：大麦hvnlp2突变体，wt：拟南芥野生型，nlp7-4：拟南芥nlp7突变体，hvnlp2/nlp7-4-1和hvnlp2/nlp7-4-2：hvnlp2在拟南芥nlp7突变体的转基因株系。

图7：hvnlp2能与硝态氮顺式作用元件(nre)结合。(a)大麦中的nre序列与拟南芥中nre序列对比。(b)酵母单杂交实验验证hvnlp2可以与nre结合；(c)荧光素酶活性检测验证hvnlp2能够结合并激活hvnir1的表达。

图8-图12：hvnlp2过表达株系提高氮素利用率的研究。wt、nlp7-4、hvnlp2/nlp7-4-1和hvnlp2/nlp7-4-2分别在0.2mm和10mmkno3固体培养基上生长10天以及在蛭石培养基上生长30天后，观察表型(图8-图9)，统计主根长度(图10)、侧根数目(图11)、鲜重(图12)。

hvnlp2/nlp7-4-1和hvnlp2/nlp7-4-2都是hvnlp2在nlp7-4中的过表达株系，是不同转化事件形成的不同株系，其中存在hvnlp2在过表达倍数上的差异。采用两个不同的株系是为了排除我们看到的硝态氮利用指标的变化并不是由于插入位点导致的。hvnlp2m/nlp7-4-2是含有突变位点的hvnlp2在nlp7-4中的转基因株系，其与hvnlp2/nlp7-4-1和hvnlp2/nlp7-4-2的区别在于hvnlp2m是从大麦hvnlp2突变体中扩增得到的含有突变位点的hvnlp2序列。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

术语说明：

硝态氮调控基因：发挥硝态氮信号调控作用的上游基因，可以调控包括响应基因在内的多个硝态氮利用基因的功能。

硝态氮响应基因：受硝态氮处理后能够发生转录水平变化的一些较下游的基因。

正如背景技术部分所介绍的，大麦是十分重要的粮食作物，也是研究麦类作物的模式植物，但目前大麦上关于no3^-调控方面的分子生物学研究尚十分缺乏。基于此，本发明在大麦关于no3^-调控基因的鉴定及功能进行了深入研究。

本发明对硝态氮调控基因atnlp7在大麦中的同源基因进行克隆和分析，利用新建成的大麦tilling系统找出同源基因对应的突变体，并对突变体进行功能鉴定，旨在找出大麦的硝态氮调控基因，研究基因的作用机制，从而为解析麦类作物对硝态氮吸收利用的分子机理奠定基础，为提高麦类作物的氮素利用率提供理论依据。

但由于拟南芥中atnlp7的信号通路尚不清楚，并且其与大麦中的调控方式存在差异，大麦nlp家族的基因具有什么样的功能更是不得而知。本发明对大麦中的5个nlp同源基因进行了生物信息学分析，发现目前对于大麦中的5个hvnlps基因的功能还未见报道，为了探究hvnlps在调控植物利用硝态氮方面的作用，我们选取了大麦中的hvnlp2基因进行克隆，并转化拟南芥nlp7突变体nlp7-4。

为研究hvnlp2在硝态氮信号及利用方面的功能，发明人首先利用pcr技术克隆了hvnlp2的基因片段，以生长10天的幼苗基因组为模板，利用下述引物扩增hvnlp2的基因片段：

上游引物：5’-tatagtcgacatggatgagattgggacacc-3’，(seqidno.3)；

下游引物：5’-tctcggtacctcgaccggatattgagctact-3’，(seqidno.4)。

在获得上述hvnlp2的基因片段之后，发明人将其转入受体植物拟南芥nlp7-4中，获得hvnlp2过量表达的转基因株系。在1/2ms培养基上培养转入hvnlp2的基因的拟南芥和受体拟南芥，并检测两种植物对硝态氮的吸收利用，结果发现转入hvnlp2基因能够明显增强硝态氮还原酶的活性、增加植物体内氨基酸的含量、促进硝态氮同化相关基因的表达。发明人还发现经硝态氮处理后，转入hvnlp2基因的拟南芥植株体内响应硝态氮的相关基因表达量显著升高，促进了植物对硝态氮的初级响应。通过酵母单杂交和荧光素酶活性测定实验验证了hvnlp2与nre结合并具有转录激活功能，进一步说明hvnlp2可能是一个转录因子。结果表明，过表达hvnlp2能促进植物对硝态氮信号的初级响应且能提高植物对硝态氮的同化利用效率，并且hvnlp2是一个转录因子，由此提出了本发明。

本发明所发现的这个来源于大麦的参与硝态氮调控的转录因子hvnlp2，其氨基酸序列如seqidno.2所示；编码该转录因子的基因hvnlp2的核苷酸序列如seqidno.1所示。

基于上述发现的参与硝态氮调控的转录因子hvnlp2及编码该转录因子的基因hvnlp2，本发明的保护范围还包括与上述基因hvnlp2同源的dna片段，只要它们编码的蛋白与seqidno.2所示的蛋白功能等价。本文所指的“与seqidno.2所示的蛋白功能等价”意味着目标dna片段所编码的蛋白在生物学功能和生理生化特征等方面与本发明中seqidno.2所示的蛋白相同或相近。seqidno.2所示的蛋白典型的生物学功能是调控植物对硝态氮信号的初级相应和植物对硝态氮的同化利用效率。通过上调seqidno.2所示的蛋白的表达量和/或活性，可以促进植物对硝态氮信号的初级相应和提高植物对硝态氮的同化利用效率。

这些与基因hvnlp2同源的dna片段包括本发明核苷酸序列(seqidno.1)对应的等位基因、同源基因、突变基因和衍生基因；它们编码的蛋白类似于本发明seqidno.2所示的蛋白，或存在一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入现象，都属于本发明内容。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的hvnlp2基因的非关键位置的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明hvnlp2基因的核苷酸序列90％或者更高同一性的核苷酸，例如90％、92％、94％、96％、97％、98％或者99％，只要编码的蛋白与seqidno.2所示的蛋白功能等价，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明seqidno.1所示的核苷酸序列具有90％或更高，或95％或更高，或99％或更高同一性的核苷酸序列。氨基酸或核苷酸序列的等同率可采用blast算法测定(altschuletal.1990.journalofmolecularbiology215:403-410；karlinandaltschul.1993.proceedingsofthenationalacademyofsciences90:5873-5877)。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例1：荧光互补实验

荧光互补实验是鉴定某基因是否是硝态氮调控基因的重要手段，为确定hvnlp2是否为硝态氮的调控基因，本发明筛选出hvnlp2/nlp7-4的纯合转基因株系，其中nlp7-4是经ems诱变筛选得到的突变体，在5mmkno3固体培养基上竖直生长5d，观察根部荧光(图1)。

由于atnlp7基因突变，导致其体内受硝态氮信号诱导的黄色荧光蛋白荧光量显著下降，故nlp7-4显示出弱荧光的表型。当我们将hvnlp2基因转化到nlp7-4中时，其转化纯合株系中受硝态氮信号诱导的黄色荧光蛋白荧光量恢复至系统野生型水平(图1)，说明hvnlp2可以发挥硝态氮信号调控的作用，其是硝态氮调控基因。

5mmkno3培养基配方：

实施例2：hvnlp2基因植物表达载体的构建

将大麦野生型在1/2ms培养基上生长10天，取全苗并提取rna，利用试剂盒将rna反转录成cdna，以cdna为模板，利用高保真dna聚合酶扩增hvnlp2的基因片段，pcr所用的引物序列为：

上游引物：5’-tatagtcgacatggatgagattgggacacc-3’，(seqidno.3)；

下游引物：5’-tctcggtacctcgaccggatattgagctact-3’，(seqidno.4)。

将pcr产物在1％的琼脂糖中进行电泳，根据dnamarker找到目的条带并将此胶块切下。利用胶回收试剂盒(购自omega公司)回收目的dna，对回收的目的dna及植物表达载体psuper1300进行酶切(bamhi和sali)，然后将酶切的dna片段和载体用t4dna连接酶连接。随后利用热激法将连接产物转化至大肠杆菌mach1感受态中，于37℃摇床，230rpm震荡培养1小时，将摇好的菌液涂布于含k⁺抗性的lb平板上，37℃倒置培养12小时。通过菌落pcr技术筛选成功转入重组载体的阳性克隆，挑取阳性克隆的菌体于5mllb培养液中培养并提取质粒用于测序。将测序结果与hvnlp2的序列进行比对，确认无误后将该质粒转化至农杆菌gv3101感受态中，放置于28℃摇床，230rpm震荡培养3小时，将菌液均匀地涂布于含k⁺抗性的lb平板上，28℃倒置培养36小时。菌落pcr鉴定成功转入重组质粒的农杆菌并将菌种在-80℃中保存。

1/2ms培养基配方：

注：定容后，用koh调ph值为5.7.

lb液体培养基配方：

实施例3：转基因阳性植株的鉴定

挑取-80℃保存的农杆菌菌体于250mllb培养液中，放置于28℃摇床，震荡培养16小时。利用浸花法将农杆菌侵染至拟南芥野生型植株。待植株成熟后，收取种子，并将种子铺在含h⁺抗性的1/2ms平皿上，筛选阳性苗即转基因株系t1代。将筛选的t1代种子移植至蛭石中培养，收获t2代种子。将t2代种子在含h⁺抗性的1/2ms平皿上培养，发现其存活率为3/4，将存活的t2植株移至蛭石中培养，单株收获t3代种子。将t3代种子在含h⁺抗性的1/2ms平皿上培养，筛选纯合的转基因株系并移至蛭石中扩繁。

实施例4：hvnlp2转基因植株的功能鉴定

利用rt-pcr技术检测上述实验获得的纯合转基因株系中hvnlp2的表达量，获得hvnlp2的转基因株系。首先利用rt-pcr技术检测了hvnlp2的转基因株系在2.5mmnh4suc培养基中生长7天后再经no3^-处理后，硝态氮响应基因nrt2.1、hho1、hrs1的表达，发现这些基因的no3^-诱导量在hvnlp2的转基因株系中明显增加(图2)。同时对转基因株系的硝态氮含量、硝酸还原酶活性、氨基酸含量进行检测(图3-图5)，结果发现，hvnlp2的转基因株系中硝态氮含量降低、nr活性和氨基酸含量升高，接下来又利用rt-pcr技术检测了hvnlp2的转基因株系中负责硝态氮同化的相关基因的表达，发现部分同化基因的表达在hvnlp2的转基因株系中的表达量显著升高(图6)。以上这些实验结果表明hvnlp2能促进植物对硝态氮的同化及响应。

2.5mmnh4suc培养基配方：

实施例5：hvnlp2转基因植株提高氮素利用率的研究

hvnlp2过表达株系提高氮素利用率的研究。将wt、nlp7-4、hvnlp2/nlp7-4-1、hvnlp2/nlp7-4-2分别在0.2mm和10mmkno3培养基上水平、竖直生长10d，观察表型(图8-图9)，统计主根长度(图10)、侧根数目(图11)和鲜重(图12)，结果发现hvnlp2能促进植物对氮素的利用率。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

sequencelisting

<110>山东农业大学

<120>一种来源于大麦的参与硝态氮调控的转录因子hvnlp2及其用途

<130>2020

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>2814

<212>dna

<213>大麦（hordeumvulgare）

<400>1

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<213>大麦（hordeumvulgare）

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