本发明应用于基因检测技术领域，具体涉及一种儿童个体化用药基因检测方法。
背景技术：
药物不良反应是除了癌症、脑溢血和心脏病外的第四大死因。我国药物不良反应监测中心调研发现，儿科用药不良反应平均发生率为12.9％，约是成人的2倍，是因为儿童肝肾等器官功能发育尚不完全，在药动学和药效学方面与成人不同，对药物的耐受度较低；其对药物的吸收、代谢、疗效等方面有着特殊的反应，对于一些药物的清除速度与成人相比较慢，因此对于儿童，用药更应谨慎。根据who统计，5岁以下儿童死亡中有三分之二是死于用药不当。不合理的盲目用药会引发一系列的不良反应，轻则治疗无效，浪费医务资源，贻误病情，重则损伤患儿器官、致畸、致残、致癌，甚至危及性命。而导致药效差异和不良反应的主要原因可能与体内代谢酶、受体或者转运体的突变有关。药物代谢酶的基因多态性不同会影响药物的代谢、分泌、吸收等，如果盲目用药，不仅达不到预期的治疗效果，还会导致上述一系列的不良后果。
因此，利用基因检测手段，明确个体的相关药物代谢酶的基因多态性，依据个体基因特性指导用药和给出相应的治疗方案，最终实现个体化用药，提高药效的同时还能避免不良反应的发生并减轻不必要的社会和经济负担。
目前针对基因多态性检测的技术很多，普遍使用的技术包括基于tm值和溶解曲线的荧光定量pcr法和一代测序等等，这些技术有的操作繁琐，有的无法实现多位点的同时检测，使得目前在临床上对于多态性检测技术应用仍不理想，一直无法满足临床检测需求。随着高通量测序技术的发展，二代测序(ngs)越来越多的被应用基因检测项目，第二代测序技术以其可高效率地完成大量序列的检测，同时精度可以达到99.99％。二代测序技术在保证检测精度的同时还可以一次对成千上万个样本进行处理。
技术实现要素：
本发明针对现有技术中存在的检测儿童用药基因位点时灵敏度低、操作复杂、成本高等问题，提供一种儿童个体化用药基因检测方法。本发明基于二代测序技术，具有高灵敏度、低成本、操作简单、通量高等特点，可以同时一次性检测112个相关基因位点。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案实现的：
一种儿童个体化用药基因检测方法，包括以下步骤：
1)取含有edta抗凝剂血液样本进行核酸提取；
2)将112个基因位点对应的扩增引物分为三个引物体系，分别为引物体系ⅰ、引物体系ⅱ、引物体系ⅲ，所述引物体系ⅰ包含49个引物对，所述引物体系ⅱ包含35个引物对，所述引物体系ⅲ包含36个引物对；
3)将步骤1)提取的核酸和步骤2)预混好的引物体系ⅰ、引物体系ⅱ、引物体系ⅲ分别加入到反应管里面形成多重pcr反应液ⅰ、pcr反应液ⅱ、pcr反应液ⅲ，进行多重pcr扩增反应；
4)扩增产物利用产物纯化试剂盒进行纯化，完成测序文库制备；
5)将步骤4)制备完成的测序文库定量后进行二代测序(ngs)；
6)测序结束后,利用生物信息统计法，根据每个位点的引物进行拆分，得到每个位点对应的片段的扩增序列总条数，再统计出野生型纯合/杂合/突变纯合序列条数占对应位点扩增序列总条数的百分比，通过计算出的百分比进行基因分型判读。
进一步的，所述112个基因位点为yeats4(rs7297610)、vkorc1(rs9923231)、ugt2b15(rs1902023)、ugt1a4(rs2011425)、ugt1a10(rs3064744)、trib3(rs2295490)、tpmt(rs1800584、rs1800462、rs1800460、rs1142345)、slco2b1(rs2306168)、slco1b1(rs72559745、rs4149056、rs4149015、rs2306283、rs11045879)、slc47a2(rs12943590)、slc28a2(rs1719247)、scn5a(rs200034939)、scn2a(rs2304016、rs17183814)、scn1a(rs3812718、rs2298771)、rgs4(rs951439、rs2842030)、ptgs2(rs20417)、ptgs1(rs10306114)、prkca(rs16960228)、pnpla3(rs738409)、pla2g4a(rs12746200)、oprm1(rs1799971)、nudt15(rs116855232)、creb1(rs2952768)、nat2(rs1801280、rs1801279、rs1799931、rs1799930、rs1799929、rs1208、rs1041983)、mtrr(rs1801394)、mt-rnr1(rs267606619、rs267606618、rs267606617)、mthfr(rs1801133)、mir3683(rs6977967)、mc4r(rs489693)、ltc4s(rs730012)、kif6(rs20455)、kcnj11(rs5219)、kcne1(rs1805128)、itpa(rs7270101)、ifnl3(rs8099917、rs12979860)、hmgcr(rs17238540)、hla-dqb1(rs9274407)、hells(rs12777823)、gp1ba(rs6065)、gnb3(rs5443)、gatm-as1(rs1346268)、gata3(rs3824662)、g6pd(rs1050828)、fkbp5(rs4713916)、fcer1a(rs2298805)、drd2(rs1799978)、dok5(rs117532069)、cyp4f2(rs2108622)、cyp3a5(rs776746)、cyp3a4(rs2740574)、cyp2d6(rs61736512、rs59421388、rs5030865、rs5030656、rs3892097、rs35742686、rs28371725、rs28371706、rs16947、rs1135840、rs1065852、rs1058164)、cyp2c9(rs9332239、rs1799853、rs1057910)、cyp2c8(rs10509681)、cyp2c19(rs4986893、rs4244285、rs28399504、rs12248560、rs11188072)、cyp1a1(rs2606345)、cxcl12(rs1801157)、crhr2(rs7793837)、crhr1(rs1876828)、coq2(rs4693075)、comt(rs4680)、col22a1(rs6988229)、ces1(rs200707504)、c11orf65(rs11212617)、atic(rs4673993)、apoe(rs7412)、apoa5(rs662799)、ankk1(rs1800497)、adrb2(rs1042714、rs1042713)、adipoq(rs2241766)、add1(rs4961)、abcg2(rs2231142)、abcc2(rs717620)、abcc1(rs119774)、abcb1(rs2032582、rs1045642)；上述112个基因位点依次命名为pg1-pg112。
进一步的，所述引物体系ⅰ包含pg2、pg5、pg6、pg7、pg11、pg13、pg19、pg20、pg21、pg27、pg28、pg30、pg31、pg37、pg39、pg42、pg43、pg44、pg48、pg49、pg50、pg51、pg54、pg56、pg59、pg61、pg62、pg63、pg64、pg65、pg66、pg67、pg70、pg72、pg73、pg75、pg76、pg77、pg79、pg82、pg92、pg97、pg100、pg102、pg103、pg107、pg109、pg110、pg112共49个基因位点中任意一个或多个引物对；
所述引物体系ⅱ包含pg3、pg8、pg10、pg14、pg17、pg18、pg22、pg23、pg25、pg26、pg29、pg32、pg35、pg36、pg45、pg47、pg53、pg57、pg58、pg60、pg68、pg74、pg81、pg84、pg87、pg88、pg89、pg90、pg91、pg93、pg94、pg98、pg101、pg106、pg111共35个基因位点中任意一个或多个引物对；
所述引物体系ⅲ包含pg1、pg4、pg9、pg12、pg15、pg16、pg24、pg33、pg34、pg38、pg40、pg41、pg46、pg52、pg55、pg69、pg71、pg78、pg80、pg83、pg85、pg86、pg95、pg96、pg99、pg104、pg105、pg108、pg3、pg7、pg20、pg22、pg25、pg39、pg87、pg90共36个基因位点中任意一个或多个引物对。
进一步的，所述引物体系ⅰ中各引物对摩尔比为pg2：pg5：pg6：pg7：pg11：pg13：pg19：pg20：pg21：pg27：pg28：pg30：pg31：pg37：pg39：pg42：pg43：pg44：pg48：pg49：pg50：pg51：pg54：pg56：pg59：pg61：pg62：pg63：pg64：pg65：pg66：pg67：pg70：pg72：pg73：pg75：pg76：pg77：pg79：pg82：pg92：pg97：pg100：pg102：pg103：pg107：pg109：pg110：pg112＝0.28：0.35:0.15:0.35:0.075:0.175:0.2:0.25:0.09:0.1625:0.13:0.25:0.0875：0.35:0.25:0.0625:0.125:0.1:0.1:0.225:0.075:0.15:0.1:0.2:0.15:0.225：0.125:0.2:0.15:0.065:0.15:0.25:0.075:0.075:0.1:0.175:0.125:0.075:0.075:0.075:0.175:0.225:0.15：0.1:0.125:0.2:0.25:0.175:0.175；
所述引物体系ⅱ中各引物对摩尔比为pg3：pg8：pg10：pg14：pg17：pg18：pg22：pg23：pg25：pg26：pg29：pg32：pg35：pg36：pg45：pg47：pg53：pg57：pg58：pg60：pg68：pg74：pg81：pg84：pg87：pg88：pg89：pg90：pg91：pg93：pg94：pg98：pg101：pg106：pg111＝0.2:0.2:0.3:0.3:0.1:0.12:0.25:0.3:0.15:0.15:0.1:0.15:0.1:0.15:0.175:0.125:0.15:0.15:0.1:0.15:0.2:0.1:0.125:0.125:0.2:0.1:0.1375:0.225:0.1:0.15:0.0875:0.15:0.15:0.1:0.225；
所述引物体系ⅲ中各引物对摩尔比为pg1：pg4：pg9：pg12：pg15：pg16：pg24：pg33：pg34：pg38：pg40：pg41：pg46：pg52：pg55：pg69：pg71：pg78：pg80：pg83：pg85：pg86：pg95：pg96：pg99：pg104：pg105：pg108：pg3：pg7：pg20：pg22：pg25：pg39：pg87：pg90＝0.15:0.1:0.125:0.15:0.275:0.2:0.25:0.2:0.1:0.2:0.1375:0.125:0.125:0.2:0.115:0.175:0.12:0.1:0.1:0.125:0.075:0.15:0.2:0.1:0.25:0.11:0.05:0.0875:0.15:0.15:0.15:0.2:0.2:0.15:0.15:0.15。
进一步的，所述pcr反应液ⅰ中包括multiplexpcrbuffer，20μl；multiplexpcrenzymemix，0.20μl；引物体系ⅰ，15μl；基因组dna(模板)，200ng；灭菌去离子水；
pcr反应液ⅱ、pcr反应液ⅲ中包括multiplexpcrbuffer，15μl；multiplexpcrenzymemix，0.15μl；引物体系ⅰ，10μl；基因组dna(模板)，150ng；灭菌去离子水。
进一步的，所述用于二代测序的芯片接头序列，分别为：aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatcttaaggcga和caagcagaagacggcatacgagattaccgaatgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatc。
进一步的，所述扩增引物中包含用于序列分析时的index序列，一次拆分序列和二次拆分序列分别为taccgaat和taaggcga。
进一步的，所述步骤3)中多重pcr扩增反应条件为：
预变性：94℃，1分钟；
35个扩增循环：变性：94℃，30秒；退火：60℃，30秒；延伸：72℃，30秒；
延伸：72℃，5分钟。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明实现了对112对儿童用药多态性基因位点同时进行检测，将112对儿童用药基因位点的引物对预混包装，方便检测，实现了一个反应体系的多基因变异分析，降低成本的同时大大提高了检测通量和效率；
(2)本发明具有高灵敏度、低成本、操作简便、检测通量高等特点，可以快速精准的对儿童个体化用药基因多态性进行检测。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明技术方案作进一步详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
另外，除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备均可通过市场购买获得或现有方法制备得到。
实施例1：检测试剂的制备
1、药物和检测基因靶点的选择
通过分析ncbi数据库和临床上儿童常用药物的使用和代谢及药效的个体差异，筛选出与153种儿童药物密切相关基因的112个多态性位点，并制备出检测该112个多态性位点的引物组合物和使用该组合物的检测试剂，建立准确的检测方法用以实现有效的用药指导。涉及美敏伪麻溶液、孟鲁司特、福莫特罗等153种药物的用药基因检测。药物和基因关联分析如表1：
表1药物和基因关联分析
上述112个多态性检测位点及核酸变异情况见表2：
表2pcr反应体系中检测位点
2、检测靶点扩增引物设计
本发明上述112个基因位点的序列信息经过大量实验筛选，优选扩增引物对如下：
表3pcr扩增引物序列
上述扩增引物中包含用于高通量测序的芯片接头序列，分别为：aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatcttaaggcga和caagcagaagacggcatacgagattaccgaatgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatc。上述扩增引物中同时包含用于序列分析时的index序列，优选的一次拆分序列和二次拆分序列分别为taccgaat和taaggcga。
3、测序文库构建
本发明采用多重pcr一步法进行测序文库的制备。本发明经过大量的实验验证，将112个基因位点对应的扩增引物分为三个引物体系，分别为引物体系ⅰ、引物体系ⅱ、引物体系ⅲ，其中引物体系ⅰ包含49个基因位点中任意一个或多个引物对；引物体系ⅱ包含35个基因位点中任意一个或多个引物对；引物体系ⅲ包含36个基因位点中任意一个或多个引物对。
其中各引物体系中包含的引物对及摩尔比如下：引物体系ⅰ中各引物对摩尔比为pg2：pg5：pg6：pg7：pg11：pg13：pg19：pg20：pg21：pg27：pg28：pg30：pg31：pg37：pg39：pg42：pg43：pg44：pg48：pg49：pg50：pg51：pg54：pg56：pg59：pg61：pg62：pg63：pg64：pg65：pg66：pg67：pg70：pg72：pg73：pg75：pg76：pg77：pg79：pg82：pg92：pg97：pg100：pg102：pg103：pg107：pg109：pg110：pg112＝0.28：0.35:0.15:0.35:0.075:0.175:0.2:0.25:0.09:0.1625:0.13:0.25:0.0875：0.35:0.25:0.0625:0.125:0.1:0.1:0.225:0.075:0.15:0.1:0.2:0.15:0.225：0.125:0.2:0.15:0.065:0.15:0.25:0.075:0.075:0.1:0.175:0.125:0.075:0.075:0.075:0.175:0.225:0.15：0.1:0.125:0.2:0.25:0.175:0.175。
引物体系ⅱ中各引物对摩尔比为pg3：pg8：pg10：pg14：pg17：pg18：pg22：pg23：pg25：pg26：pg29：pg32：pg35：pg36：pg45：pg47：pg53：pg57：pg58：pg60：pg68：pg74：pg81：pg84：pg87：pg88：pg89：pg90：pg91：pg93：pg94：pg98：pg101：pg106：pg111＝0.2:0.2:0.3:0.3:0.1:0.12:0.25:0.3:0.15:0.15:0.1:0.15:0.1:0.15:0.175:0.125:0.15:0.15:0.1:0.15:0.2:0.1:0.125:0.125:0.2:0.1:0.1375:0.225:0.1:0.15:0.0875:0.15:0.15:0.1:0.225。
引物体系ⅲ中各引物对摩尔比为pg1：pg4：pg9：pg12：pg15：pg16：pg24：pg33：pg34：pg38：pg40：pg41：pg46：pg52：pg55：pg69：pg71：pg78：pg80：pg83：pg85：pg86：pg95：pg96：pg99：pg104：pg105：pg108：pg3：pg7：pg20：pg22：pg25：pg39：pg87：pg90＝0.15:0.1:0.125:0.15:0.275:0.2:0.25:0.2:0.1:0.2:0.1375:0.125:0.125:0.2:0.115:0.175:0.12:0.1:0.1:0.125:0.075:0.15:0.2:0.1:0.25:0.11:0.05:0.0875:0.15:0.15:0.15:0.2:0.2:0.15:0.15:0.15。上面所述的引物混合体系中的各引物对的具体用量见表4。
将待测样本的dna和按表4预混好的引物体系ⅰ、引物体系ⅱ、引物体系ⅲ分别加入到反应管里面形成多重pcr反应液ⅰ、pcr反应液ⅱ、pcr反应液ⅲ，进行多重pcr扩增反应(本发明中多重pcr扩增反应采用takara生产的multiplexpcrassaykitver.2试剂盒进行扩增)。多重pcr反应液的配制如表5。
(3)本发明中pcr扩增条件为：
(4)扩增产物利用meckmancoulter的产物纯化试剂盒(agencourtampurexp60mlkit)进行纯化，完成测序文库制备。
表4引物混合体系中引物对用量
引物体系ⅰ(primermixⅰ)
引物体系ⅱ(primermixⅱ)
引物体系ⅲ(primermixⅲ)
表5多重pcr反应液的配置
4、高通量测序及结果分析
本发明专利中使用的检测平台为iillumina公司生产cn500高通量测序仪，制备完成的测序文库定量后进行二代测序(ngs)；测序结束后,利用生物信息统计法，根据每个位点的引物进行拆分，得到每个位点对应的片段的扩增序列总条数，再统计出野生型纯合/杂合/突变纯合序列条数占对应位点扩增序列总条数的百分比，通过计算出的百分比进行基因分型判读。
实施例2：儿童个体化用药基因检测
本实施例收集了2例患者外周血，分别编号为1和2，并采用一代测序进行对照验证结果的准确性。2例外周样本来自重庆市第九人民医院，均使用含有edta抗凝剂的釆血管采集血液标本5ml。样本室温静置30分钟，1500～2000rpm离心10分钟，分别收集血浆和血液中细胞于无菌螺口塑料管中。
1、样本处理
将样本利用商业化试剂盒进行核酸提取，本发明采用美基生物生产的hipureblooddnaminikit(货号：d3111)，实验步骤参考说明书进行。在1.5ml离心管中，加入25μlproteinasek，转移10-250μl抗凝血液至装有蛋白酶的离心管中。轻轻振荡混匀，加入250μlbufferal至样品中，颠倒3-5次混匀，最高速度涡旋30秒混匀，70℃水浴10分钟，其间涡旋混匀一次。加入250μl无水乙醇至样品中，涡旋30秒混匀，短暂离心收集管壁的液滴。把dna柱装在新的收集管中，转移混合液至柱子中。10000×g离心1分钟，丢弃收集管和流出液。把dna柱装在新的收集管中，加入500μlbufferdw1至柱子上，颠倒混匀几次，10000×g离心30-60秒，倒弃流出液，把柱子重新装回收集管中。加入650μlbufferdw2(已用乙醇稀释)至柱子中，10000×g离心30-60秒，倒弃流出液，把柱子重新装回收集管中。10000×g离心2分钟，可彻底去除柱子中残留的乙醇。将柱子转移至新的1.5ml离心管中。加入30-100μl预热至70℃elutionbuffer或bufferte至柱子的膜中央，放置3分钟后，10000×g离心1分钟。再加入30-100μl预热至70℃elutionbuffer或bufferte至柱子的膜中央，放置3分钟，10000×g离心1分钟，丢弃dna结合柱，检测dna液体的浓度，把dna保存2-8℃，长期保存需保存于-20℃。
2、反应体系配制
反应体系配制按照实施例1中的pcr反应液配制反应体系。
3、pcr反应
按照实施例1中的方案，将2个样本提取的dna加入配制好的反应体系中，每个样本做3管多重pcr反应，加入的模板量分别约200/150/150ng。
4、pcr反应程序
6、产物测序前纯化
本实验采用贝克曼的商业化试剂盒进行pcr产物测序前纯化，步骤如下：
将存放于4℃冰箱的磁珠置于室温回温5-10min；将第二轮pcr产物瞬离(若壁上无残留则不需要此步骤)；每管pcr产物加入56ul磁珠，吹吸混匀15次，室温放置5min；放置磁力架，2min后弃上清；每孔加250ul80％乙醇，30s后弃上清；(乙醇现配现用)重复步骤5)；吸除孔内剩余乙醇；室温静置10min，待磁珠晾干；每孔加50ul洗脱液，吹吸混匀15次，室温放置5min；放置磁力架5min；收集30ul洗脱下来的液体于新的离心管中，分别检测3管pcr产物的浓度，将这3管产物按照10/7/7的核酸含量比例，依据浓度，分别取相应体积的产物混在一起，并用洗脱液稀释至1-5ng/ul再上机测序。
7、测序结果
反应结束后下机数据用生物信息法统计结果并进行基因分型的结果判读。1号和2号样本采用本发明的检测方法与一代测序结构完全一致，检测结果见表6。
表6本发明检测方法与一代测序检测结果对比
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术构思前提下所作任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。