根据LAMP2-H260fs突变基因设计的引物制备Danon病诊断试剂盒的应用的制作方法

本发明涉及danon病的基因诊断试剂盒，更具体地说是一种利用lamp2基因h260fs突变检测的试剂盒，该试剂盒及方法可用于该疾病的辅助诊断和早期诊断，属于生物
技术领域：
。
背景技术：
：danon病为lamp2基因突变导致的溶酶体膜蛋白2异常的一种溶酶体贮积疾病为x染色体显性遗传性疾病。属于罕见病，临床特点：a.danon病会导致患者肌无力，心肌肥厚(通常室壁厚度≥30mm)及智力低下三联征表现；b.心电图可有pr间期缩短，左心室高电压，qrs间期延长，预激综合征等特征性表现；c.男性多在20岁前发病，并快速进展为心力衰竭，或发生恶性心律失常而猝死。女性则多在成年发病。男性患者ctni、ck-mb等心肌标志物指标升高，而女性患者多正常，表明男性患者心肌受损较严重。且同女性患者相比较，男性患者心脏磁共振结果显示较大面积心肌延迟强化信号，提示存在大量心肌纤维化，同样表明心肌受损较严重。danon病与多种代谢性疾病临床表现相似，利用基因检测，男性患者检测到携带致病性lamp2半合子基因突变；结合肌无力，心肌肥厚(通常室壁厚度≥30mm)及智力低下三联征表现；心电图pr间期缩短，左心室高电压，qrs间期延长等特征性表现，可以基本确诊为danon病。danon病发病早，起病急，临床上尚无特效治疗方法主要以对症治疗为主。心肌细胞的不断病变如果不能有效缓解，可能发展为心脏衰竭，需要心脏移植。存在对icd抵抗的现象，恶性心律失常和心力衰竭是最终结局。此类疾病的早期诊断，可为患者等待移植心脏供体提供相对充足的时间。技术实现要素：本发明研究发现在携带致病性的lamp2基因突变的先证者中，存在danon病先证者及母亲携带lamp2-h260fs突变位点，该位点属于缺失突变，使得h260之后氨基酸发生了改变，提前产生终止密码子，蛋白长度发生了截短，从而严重影响蛋白的功能进而疾病发生；而正常人的筛查未检测到该突变位点。基于上述发现，本发明提供了根据lamp2-h260fs突变基因设计的引物用于制备诊断danon病试剂盒的应用，所述lamp2-h260fs突变基因为lamp2基因的799到782的四个核苷酸发生缺失。本发明还提供了一种danon病诊断试剂盒，所述试剂盒包括根据lamp2-h260fs突变基因设计的引物。一种实施方式中，本发明的根据lamp2-h260fs突变基因设计的引物为：lamp2-h260fs-f：5’-tgattttgtttggtagagtg-3’；lamp2-h260fs-r：5’-tttctaagagaatgaacctaac-3’进一步，所述试剂盒还包括缓冲液和dna聚合酶。一种实施方式中，本发明的试剂盒包括：20ul10xpcr缓冲液，4ul10mmdntp混合液，2ul5unit/ul的taqdna聚合酶，10ul10pmol/ullamp2-h260fs-f：5’-tgattttgtttggtagagtg-3’，10ul10pmol/ullamp2-h260fs-r：5’-tttctaagagaatgaacctaac-3’。本发明提供了中国人群中存在lamp2基因的一种突变，并且说明了该基因突变与danon病相关。同时，利用本发明的试剂盒检测方法简单、成本低，检测结果直接、可靠，适用于对danon病lamp2基因h260fs突变的大规模的筛查和诊断。附图说明图1为lamp2基因外显子6的部分测序结果，a为野生型即未发生突变的碱基序列；b为发生缺失变异的碱基序列。图2为某家系ⅰ、ⅱ、ⅲ三代hcm家系图，图中方框代表男性，圆圈代表女性，涂黑为hcm患者，空心为正常人，斜线代表死亡，+号代表lamp2-h260fs,-号代表不携带lamp2-h260fs。具体实施方式本发明所述“根据lamp2-h260fs突变基因设计的引物”是指对lamp2-h260fs突变基因进行扩增和识别所设计的引物。例如可根据primerpremier5.0进行引物设计。示例：lamp2-h260fs-f：5’-tgattttgtttggtagagtg-3’；lamp2-h260fs-r：5’-tttctaagagaatgaacctaac-3’。本发明研究前期通过超声科门诊收集肥厚型心肌病患者，在患者及家属自愿的前提下，签署知情同意书后，留取5ml血样，建立病历资料库，详细记录患者病情、家系中发病情况以及联系方式。并对病人及正常家属进行二维超声心动图，十二导联心电图。病人再加做24小时动态心电图，心脏核磁共振，超声负荷心动图，且相关研究得到了本单位伦理委员会批准。发明人通过对1074例肥厚型心肌病患者的先证者及300名正常的对照成员进行与心血管相关的96个基因筛查，发现7例携带明确致病的lamp2基因突变的先证者，且经临床诊断7例先证者均被诊断为罕见的肥厚型心肌病--danon病。进一步，发明人对7例danon病先证者及家属进行一代测序验证及基因型与临床表型的共分离的家系验证，再次过滤良性变异，找出可能致病突变，在这些家系中hcm415家系有lamp2-h260fs突变，如图2所示。且hcm415家系中除先证者外先证者母亲携带该基因突变也诊断为danon病，其余2名家属未携带该基因突变均正常，在300名正常人中也未发现该突变位点，正常人数据库中也未发现该突变位点，进一步，通过生物信息学分析和家系验证后，如图1结果显示所有携带lamp2-h260fs基因突变的danon患者lamp2基因的799、781、780和782位点的四个核苷酸actc发生了缺失，使得h260之后氨基酸发生了改变，提前产生终止密码子，蛋白长度发生了截短，从而严重影响蛋白的功能进而发生疾病。因此该突变很可能为致danon病的致病突变位点。因此致病性分析及家系验证时发现了lamp2基因h260fs突变位点属于hcm415家系的可能致病基因突变位点。发明人查阅了hgmd数据库及clinvar数据库均为未报道的突变位点，属于新发现的致病突变位点。下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步叙述，以使公众对
发明内容有更深入的了解，并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所进行的任何本领域等同替换，均属于本发明的保护范围。实施例1：lamp2基因h260fs半合子缺失突变的检测方法一.研究对象通过超声科门诊收集hcm患者1074例，在患者及家属自愿的前提下，签署知情同意书后，留取5ml血样，建立病历资料库，详细记录患者病情、家系中发病情况以及联系方式，且研究得到了本单位伦理委员会批准。二.制备基因组dna第一天1.1在抗凝剂edta存在下，将收集的5ml人外周血在3000rpm，离心分离30分钟除去血清；1.2在血细胞中加入0.2％nacl溶液，使总体积为50ml，轻轻振荡溶液5-6次，并使其放置于冰上15分钟；1.32500rpm离心分离30分钟，借此收集沉淀物；1.4用0.2％的nacl溶液，采用步骤2-3再进行洗涤，收集沉淀物；1.5在沉淀物中加入10mmtris-hcl(ph8.0)和10mmedta(4ml)，以悬浮该沉淀物；1.6将10％sds，25mg/ml的蛋白酶k和10mg/ml的rnasea加入悬液中，其加入量分别为4ml、16ul和20ul，接着上下颠倒悬液轻轻混合；1.7在37℃过夜温育悬液；第二天2.1加入4ml酚/tris溶液，上下颠倒混合物混合所得的混合物；2.2以3000rpm进行离心分离10分钟，收集水层；2.3将水层和4ml酚/氯仿溶液混合，并以3000rpm离心分离10分钟；2.4除去水层，用氯仿提取两次，以获得水相，往其中加1/10，3mnaac(ph5.2)，两倍量的冷无水乙醇，使dna沉淀；2.5用70％的乙醇洗涤以获得基因组dna；2.6使这样获得的dna，基因组dna溶解于te中，然后定量测定混合物在260nm的吸收率；2.7dna工作液浓度校正至50ng/ul，置-20℃冰箱保存。三.lamp2基因h260的pcr扩增1.引物序列上游引物：lamp2-h260fs-f：5’-tgattttgtttggtagagtg-3’；下游引物：lamp2-h260fs-r：5’-tttctaagagaatgaacctaac-3’2.pcr反应体系表1pcr反应体系反应体系加样量10×pcrbuffer2.0μl25mmdntp0.2μlprimer(10μmol/l)各1μl模板dna1.0μltaqdna聚合酶(takara)0.2μlddh2o补足20μl表2lamp2基因h260fs片段pcr反应过程对hcm415家系的pcr产物进行测序：测序引物与pcr扩增引物相同，应用abi公司3730dna测序仪进行正反向测序，将得到的序列与genbank中的标准序列比对，确定h260fs突变位点，结果如图1b所示。实施例2：lamp2基因h260fs半合子缺失突变的检测的试剂盒一.成分：包含有可扩增出lamp2基因h260fs半合子突变位点的引物对，及其测序相应试剂，成分和含量如下，于-20℃保存：20ul10xpcr缓冲液(北京天根)，4ul10mmdntp混合液(北京天根)，2ul(5unit/ul)taqdna聚合酶(takara)，各10ul(10pmol/ul)lamp2-h260fs-f和lamp2-h260fs-r引物(自制)，1.5ml纯水。二.所述试剂盒的使用方法主要包括如下步骤：(1)提取待测血样的dna，利用序列表seqidno.1、seqidno.2所示的一对lamp2-h260fs-f和lamp2-h260fs-r引物，进行pcr扩增反应；(2)pcr反应产物纯化后直接测序，将得到的序列与genebank中的标准序列确定突变位点的存在；(3)按照正常阅读框进行翻译以确定是否存在所述氨基酸突变位点。发明人通过上述试剂盒对7名临床怀疑danon病人进行二代测序并对其家属进行一代验证，携带lamp2-h260fs基因突变的病人共有2名，临床上被诊断为danon病，此类疾病属于罕见疾病，早期诊断可为患者等待移植心脏供体提供相对充足的时间。本试剂盒可以简便快捷地检测lamp2基因所述突变位点，从而应用于danon病病例的突变检测及诊断治疗。本发明的一个实施方案中提供一个检测lamp2基因突变的试剂盒，本试剂盒内装有用以检测lamp2基因h260fs突变的成分，与之同时提供可以是经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品的制造、使用及销售信息。例如，采用pcr扩增后，直接检测样品中lamp2基因突变位点的试剂盒，可含有扩增引物、dntp、用于pcr反应的dna聚合酶及其缓冲液、测序反应所需试剂等的一种或多种。本领域技术人员已知，以上组分仅是示意性的，例如，所述引物可以采用上述的一对lamp2-h260fs-f和lamp2-h260fs-r引物，所述的用于pcr反应的dna聚合酶是能够用于pcr扩增的酶。核苷酸序列表电子文件<110>中国人民解放军空军军医大学<120>根据lamp2-h260fs突变基因设计的引物制备danon病诊断试剂盒的应用<141><160><210>1<211>20<212>dna<213>mlamp2-h260fs-f<220><223><400>155’-tgattttgtttggtagagtg-3’<210>2<211>22<212>dna<213>lamp2-h260fs-r<220><223><400>25’-tttctaagagaatgaacctaac-3’当前第1页12