一株具有缓解骨质疏松功效的发酵乳杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及一株具有缓解骨质疏松功效的发酵乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域以及医药技术领域。

背景技术：

骨质疏松(osteoporosis)是以骨量减少和骨的微观结构退化为特征，导致骨的脆性增加的一种全身性骨骼疾病。人们常用一些临床症状来诊断骨质疏松，包括：腰背、四肢疼痛，脊柱畸形，骨折等。

根据发病率和人口统计学资料显示，骨质疏松是目前世界上发病率、死亡率及保健费用消耗较大的疾病之一。仅我国，就有超过7000万的骨质疏松患者正在遭受疾病的折磨，其中，绝经后骨质疏松症患者占比约80％。

与正常人群相比，发生股骨颈或脊椎骨折的骨质疏松患者在骨折发生后一年以内的死亡率明显升高，并且，骨质疏松还会引发疼痛，严重降低疏松患者的生活质量，另外，骨质疏松在严重的情况下可致残，使患者活动受限、生活不能自理，给个人、家庭和社会带来沉重的精神和经济负担。

现在临床上常选择起效快、作用强的西药治疗骨质疏松，比较常见的药物包括降钙素、二磷酸盐、异丙氧黄酮、氟化物以及合成类固醇等。这些药物能够有效的促进成骨细胞的形成，抑制破骨细胞的形成，从而达到治疗骨质疏松的目的。可是，这些药物均有其各自的代谢特点及适用人群，普适性不强(例如，唑来膦酸就只适用于绝经后骨质疏松人群)，有些药物长期使用会一些特殊的不良反应(例如，选择性雌激素受体调节剂雷洛昔芬会导致静脉血栓栓塞症和中风)，有些药物长期使用还会让患者产生依赖性与耐受性，一旦停药就会产生戒断症状等各种停药反应。

因此，仍需找到一种药物，此药物可有效缓解骨质疏松，并且，长期使用不会导致患者产生不良反应、依赖性与耐受性，同时，普适性强、适用人群广。

技术实现要素：

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一株可缓解骨质疏松，长期使用不会导致患者产生不良反应、依赖性与耐受性，同时，普适性强、适用人群广的发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)。

[技术方案]

为解决上述问题，本发明提供了一株发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)ccfm1126，所述发酵乳杆菌ccfm1126保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno.61020，保藏日期为2020年05月06日。

所述发酵乳杆菌ccfm1126来源于湖北恩施地区的健康人群新鲜粪便样本，该菌株经测序分析，其16srdna序列如seqidno.1所示，将测序得到的序列在genebank中进行核酸序列比对，结果显示菌株为发酵乳杆菌，命名为发酵乳杆菌ccfm1126。

所述发酵乳杆菌ccfm1126的形态特征为：革兰氏阳性菌；镜检呈短杆状，成对排列，无鞭毛，无孢子；

所述发酵乳杆菌ccfm1126的菌落特征为：圆形、白色、光滑，不产生色素(菌落特征具体可见图1)；

所述发酵乳杆菌ccfm1126的生理生化特征为：能利用阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、核糖和蔗糖；不利用七叶树苷、水杨苷、棉子糖，山梨醇、肌醇、卫矛醇、鼠李糖、半乳糖；过氧化氢酶、h2s产生、尿素分解、硝酸盐还原等均为阴性。

本发明还提供了上述发酵乳杆菌在制备预防和/或治疗骨质疏松的产品中的应用。

本发明的一种实施方式中，所述产品中，上述发酵乳杆菌ccfm1126的活菌数为不低于1×10⁶cfu/ml或1×10⁶cfu/g。

本发明的一种实施方式中，所述产品包含食品或药品。

本发明的一种实施方式中，所述药品含有上述发酵乳杆菌ccfm1126、药物载体和/或药用辅料。

本发明的一种实施方式中，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。

本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含赋形剂和/或附加剂。

本发明的一种实施方式中，所述赋形剂包含着色剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂。

本发明的一种实施方式中，所述附加剂包含微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素和/或精制卵磷脂。

本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。

本发明的一种实施方式中，所述食品为保健食品；或所述食品为使用含有上述发酵乳杆菌ccfm1126的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品或果蔬制品；或所述食品为含有上述发酵乳杆菌ccfm1126的饮料或零食。

本发明的一种实施方式中，所述发酵剂的制备方法为将上述发酵乳杆菌ccfm1126按照占培养基总质量2～4％的接种量接种到培养基中，于37℃下培养18h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用生理盐水清洗3次后用冻干保护剂重悬，得到重悬液；将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，得到发酵剂。

本发明的一种实施方式中，所述冻干保护剂和菌体的质量比为2:1。

在本发明的一种实施方式中，所述冻干保护剂包含130g/l的脱脂奶粉。

本发明的一种实施方式中，所述培养基为mrs液体培养基。

本发明的一种实施方式中，所述培养基的ph为6.8。

本发明还提供了一种用于预防和/或治疗骨质疏松的产品，所述产品含有上述发酵乳杆菌ccfm1126。

本发明的一种实施方式中，所述产品中，上述发酵乳杆菌ccfm1126的活菌数为不低于1×10⁶cfu/ml或1×10⁶cfu/g。

本发明的一种实施方式中，所述产品包含食品或药品。

本发明的一种实施方式中，所述药品含有上述发酵乳杆菌ccfm1126、药物载体和/或药用辅料。

本发明的一种实施方式中，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。

本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含赋形剂和/或附加剂。

本发明的一种实施方式中，所述赋形剂包含着色剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂。

本发明的一种实施方式中，所述附加剂包含微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素和/或精制卵磷脂。

本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。

本发明的一种实施方式中，所述食品为保健食品；或所述食品为使用含有上述发酵乳杆菌ccfm1126的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品或果蔬制品；或所述食品为含有上述发酵乳杆菌ccfm1126的饮料或零食。

本发明的一种实施方式中，所述发酵剂的制备方法为将上述发酵乳杆菌ccfm1126按照占培养基总质量2～4％的接种量接种到培养基中，于37℃下培养18h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用生理盐水清洗3次后用冻干保护剂重悬，得到重悬液；将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，得到发酵剂。

本发明的一种实施方式中，所述冻干保护剂和菌体的质量比为2:1。

在本发明的一种实施方式中，所述冻干保护剂包含130g/l的脱脂奶粉。

本发明的一种实施方式中，所述培养基为mrs液体培养基。

本发明的一种实施方式中，所述培养基的ph为6.8。

有益效果：

1、本发明提供了一株发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)ccfm1126，此发酵乳杆菌ccfm1126能够预防和/或治疗骨质疏松，具体体现在：

(1)提高去卵巢大鼠的子宫系数；

(2)显著提高去卵巢大鼠的骨密度；

(3)显著提高去卵巢大鼠的皮质体积；

(4)显著降低去卵巢大鼠血清中酒石酸磷酸酶(tracp)的含量；

(5)显著降低去卵巢大鼠血清中i型胶原交联羧基末端肽(ctx-i)的含量；

(6)显著降低去卵巢大鼠血清中肿瘤坏死因子-α(tnf-α)的含量；

(7)降低去卵巢大鼠血清中白细胞介素-1β(il-1β)的含量；

(8)显著提高去卵巢大鼠血清中雌二醇(e2)的含量，

可见，发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)ccfm1126在制备预防和/或治疗骨质疏松的产品(如食品或药品等)中具有巨大的应用前景。

2、发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)是益生菌的一种，目前已被纳入卫生部下发的《可用于食品的菌种名单》，可见，本发明的发酵乳杆菌ccfm1126以及有效成分为发酵乳杆菌ccfm1126的产品长期使用不会导致患者产生不良反应、依赖性与耐受性，同时，普适性强、适用人群广。

生物材料保藏

一株发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)ccfm1126，分类学命名为lactobacillusfermentum，已于2020年05月06日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno.61020，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

附图说明

图1：发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)ccfm1126的菌落特征。

图2：不同组别去卵巢大鼠的子宫系数。

图3：不同组别去卵巢大鼠的骨密度。

图4：不同组别去卵巢大鼠的皮质体积。

图5：不同组别去卵巢大鼠血清中酒石酸磷酸酶(tracp)的含量。

图6：不同组别去卵巢大鼠血清中i型胶原交联羧基末端肽(ctx-i)的含量。

图7：不同组别去卵巢大鼠血清中肿瘤坏死因子-α(tnf-α)的含量。

图8：不同组别去卵巢大鼠血清中白细胞介素-1β(il-1β)的含量。

图9：不同组别去卵巢大鼠血清中雌二醇(e2)的含量。

图2-9中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。

具体实施方式

绝经后骨质疏松的动物模型于1969年由saville用去卵巢大鼠首先建立，后被反复证实，现已成为研究绝经后骨质疏松的经典动物模型，因此，下述实施例中使用去卵巢大鼠模拟骨质疏松大鼠。

下述实施例中涉及spf级sd雌性大鼠购自斯莱克实验动物有限公司；下述实施例中涉及的脱脂乳粉购自纽瑞兹食品有限公司；下述实施例中涉及阿伦磷酸钠购自石家庄石药集团欧意药业有限公司。

下述实施例中涉及的培养基如下：

mrs固体培养基(g/l)：蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、葡萄糖20g/l、乙酸钠2g/l、酵母粉5g/l、柠檬酸氢二铵2g/l、k2po4·3h2o2.6g/l、mgso4·7h2o0.1g/l、mnso40.05g/l、吐温801ml/l、琼脂20g/l、半胱氨酸氨酸盐0.5g/l，ph为6.8。

mrs液体培养基(g/l)：蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、葡萄糖20g/l、乙酸钠2g/l、酵母粉5g/l、柠檬酸氢二铵2g/l、k2po4·3h2o2.6g/l、mgso4·7h2o0.1g/l、mnso40.05g/l、吐温801ml/l、半胱氨酸氨酸盐0.5g/l，ph为6.8。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

活菌数的检测方法：采用国标《gb4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》。

下述实施例中涉及的发酵乳杆菌菌悬液的制备方法如下：

将发酵乳杆菌划线于mrs固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于mrs液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于mrs液体培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经8000g离心10min，得到发酵乳杆菌菌体；将发酵乳杆菌菌体经生理盐水洗涤后重悬于浓度为130g/l的脱脂乳粉溶液中至菌浓度为1×10⁹cfu/ml，得到菌悬液，将菌悬液于-80℃下保存待用。

实施例1：发酵乳杆菌的获取

具体步骤如下：

以来源于湖北恩施地区的健康人群新鲜粪便为样本，吸取0.5ml样本添加至5ml的mrs液体培养基中，37℃培养18～24h，进行富集，得到富集后的样品；吸取0.5ml富集后的样品添加至4.5ml无菌生理盐水中获得10^-1稀释液，然后吸取0.5ml10^-1稀释液于4.5ml生理盐水中，得到10^-2稀释液，按此操作，依次得到10^-3，10^-4，10^-5，10^-6稀释液；吸取100μl梯度稀释液涂布于mrs固体培养基上，10^-4，10^-5，10^-6每个梯度1个板，37℃培养48h，得到菌落；根据菌落形状、大小、边缘、透明度等选择mrs固体培养基上具有发酵乳杆菌典型特征的菌落，用接种环挑取菌落在mrs固体培养基上进行划线，37℃培养48h，得到纯化的单菌落；挑取纯化的单菌落分别接种至5ml的mrs液体培养基中，37℃培养18～24h，得到菌液；将各菌液所对应的各菌株编号后，参照教科书《微生物学》(沈萍，陈向东主编)中所记载的步骤进行菌株鉴定、革兰氏染色、生理生化等实验，选取具有发酵乳杆菌典型特征的菌株，经实验共获得三株菌株，三株菌株分别命名为ccfm1126、fzjtz20、l10；

其中，菌株鉴定过程如下：

提取ccfm1126、fzjtz20、l10的基因组，将ccfm1126、fzjtz20、l10的16srdna进行扩增和测序(由上海生工生物工程股份有限公司完成)，将测序分析得到的ccfm1126、fzjtz20、l10的16srdna序列(ccfm1126的16srdna序列如seqidno.1所示)在genbank中进行比对，结果显示三株菌株均为发酵乳杆菌，分别命名为发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)ccfm1126、发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)fzjtz20和发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)l10；

发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)ccfm1126的形态特征为：革兰氏阳性菌；镜检呈短杆状，成对排列，无鞭毛，无孢子；

发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)ccfm1126的菌落特征为：圆形、白色、光滑，不产生色素(菌落特征具体可见图1)；

发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)ccfm1126的生理生化特征为：能利用阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、核糖和蔗糖；不利用七叶树苷、水杨苷、棉子糖，山梨醇、肌醇、卫矛醇、鼠李糖、半乳糖；过氧化氢酶、h2s产生、尿素分解、硝酸盐还原等均为阴性。

实施例2：发酵乳杆菌对去卵巢大鼠子宫系数的影响

具体步骤如下：

取体重在250±20g的spf级sd雌性大鼠30只，随机分为6组，每组5只，6组分别为：假手术组、模型对照组、灌胃阿伦磷酸钠溶液的阳性对照组、灌胃发酵乳杆菌ccfm1126菌悬液的ccfm1126组、灌胃发酵乳杆菌fzjtz20菌悬液的fzjtz20组和灌胃发酵乳杆菌l10菌悬液的l10组。

实验共9周：第一周为大鼠适应期，适应期大鼠饲养在温度22±2℃、湿度40～70％、12h昼夜交替的环境下，自由饮食，所用饲料为购自苏州双狮实验动物饲料科技有限公司的大鼠繁殖配合饲料，普通饮食适应一周后进行实验。

第一周结束后，将模型对照组、阳性对照组、ccfm1126组、fzjtz20组和l10组大鼠按照3.3ml/kg的剂量腹腔注射10％(v/v)水合氯醛进行麻醉，腹部常规消毒，腹部正中切口打开腹腔，切除双侧卵巢，分两层缝合切口；将假手术组大鼠按照3.3ml/kg的剂量腹腔注射10％水合氯醛进行麻醉，腹部常规消毒，腹部正中切口打开腹腔，切除卵巢周围部分脂肪组织，不摘除卵巢，分两层缝合切口；术后连续3天按20000u/100g的剂量给各组大鼠注射青霉素抗感染；

实验第4周开始灌胃直至实验结束，阳性对照组大鼠按1mg/(kg·d)的剂量灌胃阿仑膦酸钠溶液(阿仑膦酸钠溶液是通过将阿仑膦酸钠溶于浓度为130g/l的脱脂乳粉溶液得到的)，ccfm1126组、fzjtz20组和l10组大鼠按1.5ml/天的剂量灌胃菌悬液，假手术组和模型对照组按1.5ml/天的剂量灌胃浓度为130g/l的脱脂乳粉溶液；共灌胃4周。

灌胃结束后处死所有大鼠，测定子宫湿重，计算大鼠子宫指数，检测结果见图2；其中，子宫系数(％)＝子宫质量/大鼠体重。

由图2可知，与假手术组相比，模型对照组大鼠的子宫系数显著下降，可见，摘除双侧卵巢后，大鼠雌激素缺乏，子宫明显萎缩；灌胃发酵乳杆菌后，大鼠的子宫系数较模型对照组大鼠有所提高；发酵乳杆菌fzjtz20与发酵乳杆菌l10提高去卵巢大鼠子宫系数的能力则明显不如发酵乳杆菌ccfm1126。

实施例3：发酵乳杆菌对去卵巢大鼠骨密度和皮质体积的影响

具体步骤如下：

取体重在250±20g的spf级sd雌性大鼠30只，随机分为6组，每组5只，6组分别为：假手术组、模型对照组、灌胃阿伦磷酸钠溶液的阳性对照组、灌胃发酵乳杆菌ccfm1126菌悬液的ccfm1126组、灌胃发酵乳杆菌fzjtz20菌悬液的fzjtz20组和灌胃发酵乳杆菌l10菌悬液的l10组。

实验共9周：第一周为大鼠适应期，适应期大鼠饲养在温度22±2℃、湿度40～70％、12h昼夜交替的环境下，自由饮食，所用饲料为购自苏州双狮实验动物饲料科技有限公司的大鼠繁殖配合饲料，普通饮食适应一周后进行实验。

第一周结束后，将模型对照组、阳性对照组、ccfm1126组、fzjtz20组和l10组大鼠按照3.3ml/kg的剂量腹腔注射10％(v/v)水合氯醛进行麻醉，腹部常规消毒，腹部正中切口打开腹腔，切除双侧卵巢，分两层缝合切口；将假手术组大鼠按照3.3ml/kg的剂量腹腔注射10％水合氯醛进行麻醉，腹部常规消毒，腹部正中切口打开腹腔，切除卵巢周围部分脂肪组织，不摘除卵巢，分两层缝合切口；术后连续3天按20000u/100g的剂量给各组大鼠注射青霉素抗感染；

实验第4周开始灌胃直至实验结束，阳性对照组大鼠按1mg/(kg·d)的剂量灌胃阿仑膦酸钠溶液(阿仑膦酸钠溶液是通过将阿仑膦酸钠溶于浓度为130g/l的脱脂乳粉溶液得到的)，ccfm1126组、fzjtz20组和l10组大鼠按1.5ml/天的剂量灌胃菌悬液，假手术组和模型对照组按1.5ml/天的剂量灌胃浓度为130g/l的脱脂乳粉溶液；共灌胃4周。

灌胃结束后处死所有大鼠，统一将各组大鼠左侧股骨从长径中点锯断，将股骨远心端按要求置于microct上，测定其距髁间窝约4mm附近干骺端的骨密度(bmd,g/cm³)、骨皮质体积(ct.v,mm³)，检测结果见图3～4。

由图3～4可知，与假手术组相比，模型对照组大鼠的骨密度和皮质体积显著下降，分别从2.33±0.06g/cm³和23.92±3.56mm³下降为2.10±0.03g/cm³和16.15±2.21mm³；ccfm1126组大鼠的骨密度和皮质体积则较模型对照组大鼠显著上升，分别从2.33±0.06g/cm³和23.92±3.56mm³上升为2.16±0.03g/cm³和25.80±3.49mm³，而fzjtz20组和l10组大鼠的骨密度和皮质体积与模型对照组大鼠相比没有显著差异。

可见，发酵乳杆菌ccfm1126可显著提高去卵巢大鼠的骨密度和皮质体积。

实施例4：发酵乳杆菌对去卵巢大鼠血清中酒石酸磷酸酶(tracp)含量的影响

具体步骤如下：

取体重在250±20g的spf级sd雌性大鼠30只，随机分为6组，每组5只，6组分别为：假手术组、模型对照组、灌胃阿伦磷酸钠溶液的阳性对照组、灌胃发酵乳杆菌ccfm1126菌悬液的ccfm1126组、灌胃发酵乳杆菌fzjtz20菌悬液的fzjtz20组和灌胃发酵乳杆菌l10菌悬液的l10组。

实验共9周：第一周为大鼠适应期，适应期大鼠饲养在温度22±2℃、湿度40～70％、12h昼夜交替的环境下，自由饮食，所用饲料为购自苏州双狮实验动物饲料科技有限公司的大鼠繁殖配合饲料，普通饮食适应一周后进行实验。

第一周结束后，将模型对照组、阳性对照组、ccfm1126组、fzjtz20组和l10组大鼠按照3.3ml/kg的剂量腹腔注射10％(v/v)水合氯醛进行麻醉，腹部常规消毒，腹部正中切口打开腹腔，切除双侧卵巢，分两层缝合切口；将假手术组大鼠按照3.3ml/kg的剂量腹腔注射10％水合氯醛进行麻醉，腹部常规消毒，腹部正中切口打开腹腔，切除卵巢周围部分脂肪组织，不摘除卵巢，分两层缝合切口；术后连续3天按20000u/100g的剂量给各组大鼠注射青霉素抗感染；

实验第4周开始灌胃直至实验结束，阳性对照组大鼠按1mg/(kg·d)的剂量灌胃阿仑膦酸钠溶液(阿仑膦酸钠溶液是通过将阿仑膦酸钠溶于浓度为130g/l的脱脂乳粉溶液得到的)，ccfm1126组、fzjtz20组和l10组大鼠按1.5ml/天的剂量灌胃菌悬液，假手术组和模型对照组按1.5ml/天的剂量灌胃浓度为130g/l的脱脂乳粉溶液；共灌胃4周。

灌胃结束后处死所有大鼠，取血液采用elisa试剂盒测定各组大鼠血清中酒石酸磷酸酶tracp的浓度，检测结果见图5。

由图5可知，去卵巢手术将大鼠血清中酒石酸磷酸酶tracp的含量从7.20±0.72ng/ml上升至9.13±0.75ng/ml，而经过发酵乳杆菌ccfm1126的治疗，大鼠血清中tracp的含量下调为4.11±1.37ng/ml，水平接近假手术组；发酵乳杆菌fzjtz20与发酵乳杆菌l10调节血清中酒石酸磷酸酶tracp的能力则明显不如发酵乳杆菌ccfm1126。

可见，发酵乳杆菌ccfm1126能显著降低去卵巢大鼠血清中酒石酸磷酸酶tracp的含量。

实施例5：发酵乳杆菌对去卵巢大鼠血清中i型胶原交联羧基末端肽(ctx-i)含量的影响

具体步骤如下：

取体重在250±20g的spf级sd雌性大鼠30只，随机分为6组，每组5只，6组分别为：假手术组、模型对照组、灌胃阿伦磷酸钠溶液的阳性对照组、灌胃发酵乳杆菌ccfm1126菌悬液的ccfm1126组、灌胃发酵乳杆菌fzjtz20菌悬液的fzjtz20组和灌胃发酵乳杆菌l10菌悬液的l10组。

实验共9周：第一周为大鼠适应期，适应期大鼠饲养在温度22±2℃、湿度40～70％、12h昼夜交替的环境下，自由饮食，所用饲料为购自苏州双狮实验动物饲料科技有限公司的大鼠繁殖配合饲料，普通饮食适应一周后进行实验。

第一周结束后，将模型对照组、阳性对照组、ccfm1126组、fzjtz20组和l10组大鼠按照3.3ml/kg的剂量腹腔注射10％(v/v)水合氯醛进行麻醉，腹部常规消毒，腹部正中切口打开腹腔，切除双侧卵巢，分两层缝合切口；将假手术组大鼠按照3.3ml/kg的剂量腹腔注射10％水合氯醛进行麻醉，腹部常规消毒，腹部正中切口打开腹腔，切除卵巢周围部分脂肪组织，不摘除卵巢，分两层缝合切口；术后连续3天按20000u/100g的剂量给各组大鼠注射青霉素抗感染；

实验第4周开始灌胃直至实验结束，阳性对照组大鼠按1mg/(kg·d)的剂量灌胃阿仑膦酸钠溶液(阿仑膦酸钠溶液是通过将阿仑膦酸钠溶于浓度为130g/l的脱脂乳粉溶液得到的)，ccfm1126组、fzjtz20组和l10组大鼠按1.5ml/天的剂量灌胃菌悬液，假手术组和模型对照组按1.5ml/天的剂量灌胃浓度为130g/l的脱脂乳粉溶液；共灌胃4周。

灌胃结束后处死所有大鼠，取血液采用elisa试剂盒测定各组大鼠血清中i型胶原交联羧基末端肽(ctx-i)的浓度，检测结果见图6。

由图6可知，经过发酵乳杆菌ccfm1126的治疗，大鼠血清中ctx-i的含量显著下调；发酵乳杆菌fzjtz20与发酵乳杆菌l10调节血清中i型胶原交联羧基末端肽(ctx-i)的能力则明显不如发酵乳杆菌ccfm1126。

可见，发酵乳杆菌ccfm1126能显著降低去卵巢大鼠血清中i型胶原交联羧基末端肽(ctx-i)的含量。

实施例6：发酵乳杆菌对去卵巢大鼠血清中肿瘤坏死因子-α(tnf-α)和白细胞介素-1β(il-1β)含量的影响

具体步骤如下：

取体重在250±20g的spf级sd雌性大鼠30只，随机分为6组，每组5只，6组分别为：假手术组、模型对照组、灌胃阿伦磷酸钠溶液的阳性对照组、灌胃发酵乳杆菌ccfm1126菌悬液的ccfm1126组、灌胃发酵乳杆菌fzjtz20菌悬液的fzjtz20组和灌胃发酵乳杆菌l10菌悬液的l10组。

实验共9周：第一周为大鼠适应期，适应期大鼠饲养在温度22±2℃、湿度40～70％、12h昼夜交替的环境下，自由饮食，所用饲料为购自苏州双狮实验动物饲料科技有限公司的大鼠繁殖配合饲料，普通饮食适应一周后进行实验。

第一周结束后，将模型对照组、阳性对照组、ccfm1126组、fzjtz20组和l10组大鼠按照3.3ml/kg的剂量腹腔注射10％(v/v)水合氯醛进行麻醉，腹部常规消毒，腹部正中切口打开腹腔，切除双侧卵巢，分两层缝合切口；将假手术组大鼠按照3.3ml/kg的剂量腹腔注射10％水合氯醛进行麻醉，腹部常规消毒，腹部正中切口打开腹腔，切除卵巢周围部分脂肪组织，不摘除卵巢，分两层缝合切口；术后连续3天按20000u/100g的剂量给各组大鼠注射青霉素抗感染；

实验第4周开始灌胃直至实验结束，阳性对照组大鼠按1mg/(kg·d)的剂量灌胃阿仑膦酸钠溶液(阿仑膦酸钠溶液是通过将阿仑膦酸钠溶于浓度为130g/l的脱脂乳粉溶液得到的)，ccfm1126组、fzjtz20组和l10组大鼠按1.5ml/天的剂量灌胃菌悬液，假手术组和模型对照组按1.5ml/天的剂量灌胃浓度为130g/l的脱脂乳粉溶液；共灌胃4周。

灌胃结束后处死所有大鼠，取血液采用elisa试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司产品)测定各组大鼠血清中肿瘤坏死因子tnf-α和白细胞介素-1β(il-1β)的浓度，检测结果见图7～8。

由图7可知，去卵巢手术将大鼠血清中肿瘤坏死因子tnf-α的含量从17.99±1.71pg/ml上升至20.91±1.84pg/ml，而经过发酵乳杆菌ccfm1126的治疗，大鼠血清中tnf-α的含量下调为17.30±0.67pg/ml，水平接近假手术组；发酵乳杆菌fzjtz20与发酵乳杆菌l10调节血清中肿瘤坏死因子tnf-α的能力则明显不如发酵乳杆菌ccfm1126。

可见，发酵乳杆菌ccfm1126能显著降低去卵巢大鼠血清中肿瘤坏死因子tnf-α的含量。

由图8可知，去卵巢手术将大鼠血清中白细胞介素-1β(il-1β)的含量从23.80±3.18pg/ml上升至31.46±2.87pg/ml，而发酵乳杆菌ccfm1126的治疗对大鼠血清中白细胞介素-1β的含量没有显著性影响。

实施例7：发酵乳杆菌对去卵巢大鼠血清中雌二醇(e2)含量的影响

具体步骤如下：

取体重在250±20g的spf级sd雌性大鼠30只，随机分为6组，每组5只，6组分别为：假手术组、模型对照组、灌胃阿伦磷酸钠溶液的阳性对照组、灌胃发酵乳杆菌ccfm1126菌悬液的ccfm1126组、灌胃发酵乳杆菌fzjtz20菌悬液的fzjtz20组和灌胃发酵乳杆菌l10菌悬液的l10组。

实验共9周：第一周为大鼠适应期，适应期大鼠饲养在温度22±2℃、湿度40～70％、12h昼夜交替的环境下，自由饮食，所用饲料为购自苏州双狮实验动物饲料科技有限公司的大鼠繁殖配合饲料，普通饮食适应一周后进行实验。

第一周结束后，将模型对照组、阳性对照组、ccfm1126组、fzjtz20组和l10组大鼠按照3.3ml/kg的剂量腹腔注射10％(v/v)水合氯醛进行麻醉，腹部常规消毒，腹部正中切口打开腹腔，切除双侧卵巢，分两层缝合切口；将假手术组大鼠按照3.3ml/kg的剂量腹腔注射10％水合氯醛进行麻醉，腹部常规消毒，腹部正中切口打开腹腔，切除卵巢周围部分脂肪组织，不摘除卵巢，分两层缝合切口；术后连续3天按20000u/100g的剂量给各组大鼠注射青霉素抗感染；

实验第4周开始灌胃直至实验结束，阳性对照组大鼠按1mg/(kg·d)的剂量灌胃阿仑膦酸钠溶液(阿仑膦酸钠溶液是通过将阿仑膦酸钠溶于浓度为130g/l的脱脂乳粉溶液得到的)，ccfm1126组、fzjtz20组和l10组大鼠按1.5ml/天的剂量灌胃菌悬液，假手术组和模型对照组按1.5ml/天的剂量灌胃浓度为130g/l的脱脂乳粉溶液；共灌胃4周。

灌胃结束后处死所有大鼠，取血液采用elisa试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司产品)测定各组大鼠血清中雌二醇的浓度，检测结果见图9。

由图9可知，假手术组大鼠血清中雌二醇的含量为117.90±4.92pg/ml，模型对照组大鼠血清中雌二醇的含量显著下降至70.40±7.55pg/ml，ccfm1126组大鼠血清中雌二醇的含量显著上升为88.38±6.46pg/ml，而fzjtz20组和l10组大鼠血清中雌二醇含量与假手术组大鼠相比没有显著差异。

可见，发酵乳杆菌ccfm1126能显著提高去卵巢大鼠血清中雌二醇的含量。

实施例8：发酵乳杆菌的应用

发酵乳杆菌ccfm1126可用于制备菌粉，菌粉的具体制备过程如下：

发酵乳杆菌ccfm1126划线于mrs固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于mrs液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于mrs液体培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经8000g离心10min，得到菌泥；将菌泥用生理盐水清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×10¹⁰cfu/ml，得到菌悬液；将菌悬液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到发酵乳杆菌ccfm1126菌粉；

所述保护剂为浓度为130g/l的脱脂奶粉溶液。

实施例9：发酵乳杆菌的应用

发酵乳杆菌ccfm1126可用于制备乳饮品，乳饮品的具体制备过程如下：

发酵乳杆菌ccfm1126划线于mrs固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于mrs液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于mrs液体培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经8000g离心10min，得到菌泥；将菌泥用生理盐水清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×10¹⁰cfu/ml，得到菌悬液；将菌悬液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到发酵乳杆菌ccfm1126菌粉；

其中，所述保护剂为浓度为130g/l的脱脂奶粉溶液。

将脱脂奶在95℃热杀菌20min后冷却至4℃，得到原料；在原料中添加发酵乳杆菌ccfm1126菌粉至浓度为不低于1×10⁶cfu/ml，得到乳饮品(乳饮品需在4℃下冷藏保存)。

实施例10：发酵乳杆菌的应用

发酵乳杆菌ccfm1126可用于制备果蔬饮料，果蔬饮料的具体制备过程如下：

发酵乳杆菌ccfm1126划线于mrs固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于mrs液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于mrs液体培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经8000g离心10min，得到菌泥；将菌泥用生理盐水清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×10¹⁰cfu/ml，得到菌悬液；将菌悬液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到发酵乳杆菌ccfm1126菌粉；

其中，所述保护剂为浓度为130g/l的脱脂奶粉溶液。

将新鲜水果和蔬菜洗净后榨汁，得到果蔬汁；将果蔬汁在温度140℃下高温热杀菌2秒，得到杀菌后的果蔬汁；将杀菌后的果蔬汁降温至约37℃后在杀菌后的果蔬汁中添加发酵乳杆菌ccfm1126菌粉至浓度为不低于1×10⁶cfu/ml，得到果蔬饮料(果蔬饮料需在4℃下冷藏保存)。

实施例11：发酵乳杆菌的应用

发酵乳杆菌ccfm1126可用于制备胶囊制品，胶囊制品的具体制备过程如下

发酵乳杆菌ccfm1126划线于mrs固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于mrs液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于mrs液体培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经8000g离心10min，得到菌泥；将菌泥用生理盐水清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×10¹⁰cfu/ml，得到菌悬液；菌悬液添加至浓度为30g/l的海藻酸钠溶液中至浓度为2×10⁹cfu/ml后，充分搅拌，使得发酵乳杆菌ccfm1126的细胞均匀地分散于海藻酸钠溶液中，得到混合液；将混合液挤压到浓度为20g/l的氯化钙溶液中形成胶粒；待形成的胶粒静止固化30min后，过滤收集胶粒；将收集得到的胶粒进行冷冻干燥48h，得到粉剂；将粉剂装入到药用胶囊中，得到胶囊制品。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110>江南大学

<120>一株具有缓解骨质疏松功效的发酵乳杆菌及其应用

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>953

<212>dna

<213>发酵乳杆菌

<400>1

gtctatcatgcaagtcgacgcgttggcccaattgattgatggtgcttgcacctgattgat60

tttggttgccaacgagtggcggacgggtgagtaacacgtaggtaacctgcccagaagcgg120

gggacaacatttggaaacagatgctaataccgcataacagcgttgttcgcatgaacaacg180

cttaaaagatggcttctcgctatcacttctggatggacctgcggtgcattagcttgttgg240

tggggtaacggcctaccaaggcgatgatgcatagccgagttgagagactgatcggccaca300

atgggactgagacacggcccatactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaat360

gggcgcaagcctgatggagcaacaccgcgtgagtgaagaagggtttcggctcgtaaagct420

ctgttgttaaagaagaacacgtatgagagtaactgttcatacgttgacggtatttaacca480

gaaagtcacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatc540

cggatttattgggcgtaaagagagtgcaggcggttttctaagtctgatgtgaaagccttc600

ggcttaaccggagaagtgcatcggaaactggataacttgagtgcagaagagggtagtgga660

actccatgtgtagcggtggaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggc720

tacctggtctgcaactgacgctgagactcgaaagcatgggtagcgaacaggattagatac780

cctggtagtccatgccgtaaacgatgagtgctaggtgttggagggtttccgcccttcagt840

gccggagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaa900

aggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagctgtggtttaattcgaagct953