本发明属于医学诊断领域，涉及用于诊断马凡综合征的基因突变。
背景技术：
马凡综合征(marfansyndrome，mfs)是一种常染色体显性遗传结缔组织病，主要表现为心血管、眼和骨骼症状，以心血管并发症最为严重，其中主动脉瘤和夹层是患者死亡的主要原因。mfs的诊断主要依据2010年修订版的ghent标准，此标准中基因检测具有重要意义。目前已发现8种mfs相关的基因，包括原纤维蛋白-1(fbn1)基因、原纤维蛋白-2(fbn2)基因、转化生长因子β受体1(tgfbr1)基因、转化生长因子β受体2(tgfbr2)基因等。
fbn1基因是最早发现，突变最多的mfs致病基因，目前报道的fbn1基因突变多达3000余种，约90％mfs中可检测到fbn1基因突变，多数是单个家庭所特有。fbn1基因突变导致mfs的病理机制目前有4种假说：(1)fbn1基因突变对微纤维发挥显性负效应作用，突变fbn1单体干扰原纤蛋白的聚合及微纤维的聚集。(2)fbn1在保持弹性纤维稳定性上有重要作用，fbn1基因突变破坏了弹性纤维的稳定性。(3)fbn1基因突变增加了fbn1对蛋白水解酶的敏感性，使fbn1蛋白变得易于被降解。(4)除上述机制外，近来研究热点集中于tgf-β信号转导通路，tgf-β是一种多向细胞调节因子，参与调节增殖、分化、迁移和凋亡等多种细胞反应，fbn1基因突变影响tgf-β在细胞外基质中的固定，使过量激活的tgf-β释放，通过其非经典信号传导通路导致mfs血管病变的发生和发展。
在mfs研究中，基因型-表型相关性一直是研究的热点，建立基因型和表型之间的联系，对于疾病的诊断、个体化治疗以及遗传咨询等具有非常重要的意义。以fbn1基因为例，mfs相关的突变随机分布于基因的各个区域，没有明显的突变热点，并且由于表型的变异性较大，尽管相关研究层出不穷，至今未建立广泛而可靠的基因型-表型联系。fbn1基因突变包括许多不同类型，错义突变最常见(大约占2/3)，这些突变通常会替代或产生新的半胱氨酸残基。小的插入、缺失或重复约占10-15％，其中大多数会导致终止密码子提前出现,使原纤维蛋白1的翻译终止，导致原纤维蛋白1分子截短。还有10-15％为各类的剪接错误，最常见的是影响外显子/内含子交界区的剪接序列。少数mfs患者报告了较大的重排，包括插入和缺失。在多数研究中，认为外显子24-32的突变常与新生儿mfs及严重表型相关，而晶体脱位与与错义突变(特别是那些影响半胱氨酸残基的突变)有关，截短和剪接突变在发生主动脉事件的mfs患者中更为常见。而在fbn1基因的3'端，外显子59-65的突变可能与轻度心血管表型相关，但差异并不显着。另有研究认为mfs表型的严重性与野生型fbn1等位基因合成的原纤维蛋白1水平有关。将所有的fbn1基因突变类型分为单倍剂量不足或显性负效应，发现单倍剂量不足患者的心血管事件风险更高。
和大多数疾病一样，mfs是遗传和环境共同作用的结果，其发病机制尚未完全清楚。随着遗传学和生物信息学技术的不断发展，从基因、蛋白、细胞、组织、环境等方面进行研究，有利于进一步确定mfs的发病机制和遗传特征。对mfs先证者家属及家系成员进行基因检测和分析，不仅可以提前诊断、早期干预，还可以为后续基因治疗、药物靶点治疗和组织工程修复等提供科学依据。
技术实现要素：
为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一种用于用于诊断马凡综合征的生物标志物，生物标志物是指fbn1基因上的移码突变，所述移码突变是c.5651_5664del:p.d1884fs。
进一步，所述生物标志物来源于血液。
更进一步，所述生物标志物来源于血液中的基因组dna。
本发明还提供了检测前面所述的突变位点基因型的试剂在制备诊断马凡综合征的产品中的应用。
可用于检测突变位点基因型的方法包括但不限于，taqman法、质谱法、dna微阵列法、测序法、微测序、杂交、限制性片段分析、寡核苷酸连接检测、等位基因特异性pcr-hrm。
进一步，所述试剂包括taqman法、质谱法、dna微阵列法、测序法、微测序、杂交、限制性片段分析、寡核苷酸连接检测、或等位基因特异性pcr-hrm方法检测突变位点基因型所需的试剂。
所述试剂包括特异性扩增前面所述的突变位点在内的核酸序列的引物。
本发明还提供了一种诊断马凡综合征的产品，所述试剂盒包括检测前面所述的突变位点基因型的试剂。
进一步，所述试剂包括taqman法、质谱法、dna微阵列法、测序法、微测序、杂交、限制性片段分析、寡核苷酸连接检测、或等位基因特异性pcr-hrm方法检测突变位点基因型所需的试剂。
进一步，所述试剂包括特异性扩增突变位点在内的核酸序列的引物。
虽然未在说明书中详尽记载哪些具体试剂可用于本发明，但是本领域技术人员应当知道，凡是能够有效检测突变位点基因型的方法中使用到的试剂均能用于本发明以精确的检测出前面所述的突变位点的基因型。
本发明所述的产品可以但不限于，试剂、试剂盒、芯片、试纸、高通量测序平台等。
本发明所述的试剂盒除了可以包括检测前面所述的突变位点基因型的试剂以外，还可以包括dna提取常用试剂，如苯酚、氯仿、异戊醇或乙醇等。
本发明所述的试剂盒除了可以包括检测前面所述的突变位点的试剂以外，还可以包括pcr反应体系试剂，如荧光染料、tap酶、dntp。
本发明还提供了一种诊断马凡综合征的的方法，所述方法包括检测前面所述的突变位点基因型。
进一步，所述方法包括以下步骤：
(1)收集受试者血液；
(2)检测血液基因组dna中前面所述的突变位点的基因型。
术语解释：
本文术语“核酸”，也可称为多核苷酸，是指任意长度的核苷酸的聚合物，并且包括dna和rna。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或是可以通过dna或rna聚合酶掺入到聚合物中的任意底物(substrate)。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。如果存在，可以在聚合物的组装之前或之后进行核苷酸结构的修饰。核苷酸序列可以由非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后进行进一步的修饰，诸如通过与标记组分缀合而修饰。其它类型的修饰包括，例如，“帽”，用类似物置换一个或多个天然存在的核苷酸，中间核苷酸修饰，诸如例如具有不带电的键(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺(phosphoamidates)、氨基甲酸酯等)的那些和具有带电荷的键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些，含有悬垂结构部分的那些，所述悬垂结构部分诸如例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-l-赖氨酸等)，具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的那些，含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化的金属等)的那些，含有烷化剂的那些，具有修饰的连接(例如，α异头核酸等)的那些，以及未修饰形式的多核苷酸。此外，在糖中通常存在的任一羟基可以被取代，例如，被磷酸酯基(phosphonategroups)、磷酸盐基(phosphategroups)取代，由标准的保护基团保护，或被活化以制备与另外的核苷酸的另外的键，或可以缀合到固体支持物上。5′和3′末端oh可以被磷酸化或者用具有1至20个碳原子的胺或有机加帽基团结构部分取代。其它羟基也可以被衍生成标准的保护基团。多核苷酸还可以包含本领域通常已知的核糖或脱氧核糖糖类的类似形式，包括，例如，2′-o-甲基-2′-o-烯丙基，2′-氟-或2′-叠氮基-核糖，碳环糖类似物，α-异头糖，差向异构糖，诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖，吡喃糖，呋喃糖，景天庚酮糖，无环类似物及无碱基核苷类似物，诸如甲基核苷。一个或多个磷酸二酯键可以被备选的连接基团所取代。这些备选连接基团包括，但不限于这样的实施方案：其中磷酸酯被p(o)s(“硫代酯”)、p(s)s(“二硫代酯”)、″(o)nr2(“酰胺化物”)、p(o)r、p(o)or′、co或ch2(“甲酰化物(formacetal)”)取代，其中每个r或r′独立地为h或取代的或未取代的烷基(1-20个c)，所述烷基任选含有醚(--o--)键、芳基、链烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。多核苷酸中的所有键不必都是相同的。
本文术语“引物”是指能够与核酸杂交并且允许互补核酸的聚合(通常通过提供一个游离的3′-oh基团)的单链多核苷酸核酸。
本文术语“基因”是指一种dna序列，其通过其模板或信使rna编码特定的肽、多肽或蛋白质特有的氨基酸序列。术语“基因”还指编码rna产物的dna序列。如本文中参照基因组dna所用，基因包括插入区、非编码区以及调控区，并且可以包括5′和3′末端。
本文术语“扩增”是指产生一个或多个拷贝的参比核酸序列或其互补序列的过程。扩增可以是线性的或指数的(例如，聚合酶链式反应(pcr))。“拷贝”不必意味着相对于模板序列的完美的序列互补性或同一性。例如，拷贝可以包括核苷酸类似物，如脱氧肌苷，在扩增过程中发生的故意的序列改变(诸如，通过包含可与模板杂交但是不与模板完全互补的序列的引物而引入的序列改变)和/或序列错误。
本文术语“诊断”用在本文中是指分子或病理学状态、疾病或病况的鉴定或分类。“诊断”还可以是指特定亚型的分类。
本发明提供的生物标志物作为诊断马凡综合征的标志物的优越性在于：突变是一种新型基因生物标志物，区别于传统生物标志物，稳定、微创、易于检测，将大大提高诊断的敏感性和特异性。
本发明的优势在于鉴定出可以有效诊断马凡综合征的生物标志物，使得临床上实现马凡综合征患者的精确诊断，降低误诊率。
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1马凡综合征患者及家系成员的基因突变筛查
男性，37岁，主因“间断胸闷、气短4月余，加重半月”入院。患者于4个月前感冒后出现胸闷、气短，伴夜间不能平卧，伴咳嗽、咳痰，伴发热，具体体温不详，伴纳差，伴尿量减少，无恶心、呕吐，无头晕、头痛，就诊于当地医院考虑“心力衰竭肺炎”，给予纠正心衰、抗感染等治疗，症状稍好转出院。出院后上述症状仍有间断发作，性质程度同前，分别于3个月前，半月前于当地医院输液治疗，出院后规律口服“地高辛氢氯噻嗪华法林”等药物，患者症状控制欠佳，遂就诊于医院急诊，给予利尿、活血等治疗，收入诊治。
既往史：1年前因主动脉夹层、主动脉瓣关闭不全于安贞医院行bentall+sun's+mvr+tvp术，术后口服华法林、地高辛治疗，地高辛于术后半年停药。否认高血压、糖尿病、高血脂病史。否认食物及药物过敏史。
家族史：父亲7年前因二尖瓣关闭不全，主动脉瓣关闭不全行二尖瓣置换及主动脉瓣成形术，3年前心脏彩超示主动脉窦部扩张，主动脉瓣重度关闭不全，3年前猝死(具体不详)。妹妹于1年前猝死(具体不详)。弟弟曾查心脏彩超示主动脉窦部增宽(内径46mm)，胸主动脉cta未见明显异常。
体格检查：t36.5℃p110次/分r21次/分bp106/72mmhg。身材瘦高，神清，双肺呼吸音粗，未闻及干湿性啰音。心率110次/分，律齐，主动脉瓣听诊区可闻及机械瓣工作音。腹软，无压痛。脊柱侧弯，手指细长。双下肢无水肿。
辅助检查：胸部ct：(1)胸骨及心脏呈术后改变，二尖瓣区、主动脉瓣区高密度，请结合病史；(2)主动脉病变，建议cta检查；(3)两侧少量胸腔积液伴邻近肺组织膨胀不全；(4)两肺尖、左肺下叶后基底段散在含气囊腔；(5)左肺上叶舌段、下叶膨胀不良；(6)右肺下叶小叶间隔增厚伴渗出，建议近期复查；(7)右肺下叶背侧胸膜下线；两侧叶间胸膜增厚。
心脏彩超：la41mm，lv75mm，ra38mm，rv19mm，ef33.33％主动脉夹层bentall+sun's+mvr+tvp术后功能大致正常；左心扩大，左室收缩、舒张功能减低；右室收缩功能减低；主动脉瓣人工机械瓣轻度关闭不全；三尖瓣轻度关闭不全。
心电图(入院)：窦性心动过速，心率104次/分，肢体导联t波低平，v1-3导联r波递增不良，左室高电压。bnp:4330pg/ml，ctni:0.03ng/ml，inr:1.83。
诊断:
1、慢性心力衰竭急性发作，心功能iv级，主动脉瓣关闭不全，主动脉瓣置换术后二尖瓣关闭不全，二尖瓣置换术后心脏瓣膜病。
2、主动脉夹层术后。患者有主动脉夹层病史，其父(曾查心脏彩超示主动脉窦部扩张，主动脉瓣关闭不全)及妹猝死，其弟筛查心脏彩超发现主动脉增宽，查体身材瘦高、臂展大于身高、脊柱侧弯、手指细长，高度怀疑此家系为马凡综合征家系。对该患者及全部健在家庭成员筛查心脏彩超发现其弟弟及大女儿存在主动脉增宽。
对患者及弟弟、女儿进行全外显子基因序列分析。测序流程如下：
(1)标本dna制备：采集患者外周血3-5ml，提取基因组dna。
(2)dna样品测试通过结合使用以下两种方法来验证分离的基因组dna的质量：a)dna降解和可疑的rna/蛋白质污染通过1％琼脂糖凝胶电泳进行验证。b)通过
(3)文库的准备和测序：使用(agilentsureselecthumanallexonv6)液体捕获系统从基因组dna中富集外显子组序列。首先，用covariss220超声仪将合格的基因组dna随机片段化为180-280bp的平均大小。剩余的突出端通过核酸外切酶聚合酶活性转化为平末端。其次，对dna片段进行末端修复和磷酸化，然后在3'末端进行a-tailing并与成对末端的衔接子连接(illumina)。在pcr反应中选择性富集两端连接了衔接子分子的dna片段。pcr反应后，文库与生物素标记的探针在液相中杂交，然后使用带有链霉素的磁珠捕获外显子。捕获的文库在pcr反应中富集以添加索引标签，以准备测序。产品使用ampurexp系统(beckmancoulter,beverly,usa))进行纯化，并使用agilentbioanalyzer2100系统进行定量。最后，在illumina平台上对dna文库进行测序。
(4)数据信息处理及突变分析参考dbsnp等数据库，及对照人类参考基因组grch37/hg19查找患者基因突变及其他异常。应用sift在线预测工具(http://sift.icvi.org/)和polyphen-2等软件预测突变对蛋白质功能的影响。
测序结果显示：患者及弟弟、女儿pcr产物进行全外显子测序均发现致病性突变位点(pathogenic)为：fbn1基因第46外显子编码区存在1个移码缺失c.5651_5664del，导致编码的第1884位的天冬氨酸发生移码突变(nm_000138:exon46:c.5651_5664del:p.d1884fs)。根据修订版ghent标准，三例受检者均可确诊马凡综合征。
另外使用前面所述的方法扩增招募的601名未患有马凡综合征的健康人群的fbn1基因c.5651_5664del:p.d1884fs，扩增完成后进行测序分析，测序结果显示，对照人群未见c.5651_5664del:p.d1884fs突变。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。