1.本发明涉及多肽合成领域，特别涉及利那洛肽的制备方法。
背景技术：2.利那洛肽是由美国ironwood公司研发的一种鸟苷酸环化酶c(gc-c)受体激动剂，其商品名为linzess，于2012年8月30日获美国fda批准上市，英文名为linaclotide。该药为胶囊制剂，用于治疗成人便秘型肠易激综合征(ibs-c)和慢性特发性便秘(cic)，它是首个具有此种作用机制的治疗便秘的药物。
3.利那洛肽的一级结构由14个氨基酸构成，序列中包含了6个半胱氨酸。其中半胱氨酸(1-6)、(2-10)、(5-13)分别形成了3对二硫键。利那洛肽口服进入人体后通过与肠道中的鸟苷酸环化酶c型受体(gc-c)结合，使细胞内和细胞外环鸟苷酸(cgmp)浓度升高，刺激肠液分泌，加快胃肠道的蠕动，从而增加排便频率。其结构如图1所示：
4.利那洛肽氨基酸序列中包含6个半胱氨酸，其中，半胱氨酸(1-6)、(2-10)、(5-13)分别形成了3对二硫键。因此，在合成该多肽过程中容易出现二硫键错配的现象。该化合物合成的关键也在于选择合适的策略使3对二硫键的形成过程具有高度选择性，避免二硫键的错配。关于利那洛肽的合成方法，分别采用了三种策略进行利那洛肽的合成：
5.策略一：肽序中的3对半胱氨酸全部采用trt作为侧链保护基，进行线性粗肽的固相合成，将肽树脂裂解得到的粗肽在液相中通过自然氧化的方式一步得到利那洛肽；
6.策略二：肽序中采用五种不同半胱氨酸侧链保护基，即采用(2stbu+2trt+2pmeobzl)、(2mmt+2acm+2trt)、(2acm+2trt+2pmeobzl)三种正交保护方式，进行固相合成线性粗肽，然后采用分步环化策略完成二硫键的合成；
7.策略三：肽序中的半胱氨酸侧链保护基采用2个stbu和4个trt，通过fmoc固相合成线性粗肽，然后采用分步环化策略进行利那洛肽的合成。
8.此外，现有技术也公开了一种合成利那洛肽的方法，其肽序中的6个半胱氨酸采用mmt作为侧链保护基，通过fmoc固相反应逐个偶联合成利那洛肽树脂，将裂解得到的利那洛肽线性粗肽在液相中采用gsh/gssh氧化体系进行氧化反应进行二硫键的环化，最终得到利那洛肽粗品。这些方法存在许多缺陷：即液相环化一般在较低的浓度下进行氧化反应，反应效率较低，且容易产生二硫键错配，出现异构体杂质产生大量杂质，不利于产物的纯化分离，所得利那洛肽的纯度和收率都较低，不利于工业放大生产。
技术实现要素：9.有鉴于此，本发明提供了利那洛肽的制备方法。该合成策略有助于提高产品纯度和收率，且原料价格低廉易得，易于放大生产。所得利那洛肽精肽纯度为99.8％，收率为41.6％。对比例其目标产物收率为26.9％，与之相比，在产物收率方面有显著性的提高。
10.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
11.本发明提供了利那洛肽的制备方法，包括如下步骤：
12.步骤a、合成利那洛肽5-14，脱除第5位和第13位cys侧链保护基，氧化形成第1对二硫键cys(5-13)；
13.步骤b、合成利那洛肽2-4全保护肽；
14.步骤c、将所述利那洛肽2-4全保护肽与步骤a的产物缩合，制得利那洛肽2-14，脱除第2位和第10位cys侧链保护基，氧化形成第2对二硫键cys(2-10)；
15.步骤d、取步骤c的产物偶联n末端的cys，裂解，沉淀；
16.步骤e、取步骤d的产物溶解后氧化形成第3对二硫键cys(1-6)；
17.其中，步骤a与步骤b的顺序不分先后。
18.在本发明的一些具体实施方案中，步骤a中所述脱除采用的侧链脱保护试剂为1～5％tfa/dcm溶液，脱除时间为1～5min。
19.在本发明的一些具体实施方案中，步骤a中所述氧化采用的氧化剂dmso浓度为10～20％(v/v)，所述氧化的时间为8～12h，所述氧化剂dmso的用量为合成规模的10eq。
20.在本发明的一些具体实施方案中，步骤b中，获得利那洛肽2-4全保护肽树脂的裂解液为三氟乙醇的二氯甲烷溶液，避免使用三氟乙酸的强酸体系，减少了对环境的污染和实验的安全性。
21.在本发明的一些具体实施方案中，步骤c中所述脱除与所述氧化采用3～8eq的i2，反应时间为2～8h，反应溶剂dmf用量为10～20eq。
22.在本发明的一些具体实施方案中，步骤d中，第6位fmoc-cys(stbu)-oh的侧链stbu保护基的脱保护试剂为20～80％β-巯基乙醇/dmf溶液，脱除时间为2～6h，所述脱保护试剂的用量为合成规模的5eq。
23.在本发明的一些具体实施方案中，脱除侧链stbu保护基后采用dmf清洗树脂次数为10～20次，所述裂解液包括edt、tis、间甲酚、苯酚、苯甲硫醚中的一种或多种的组合物。
24.在本发明的一些具体实施方案中，所述裂解液包括tfa:tis:h2o:edt＝87.5:5:5:2.5，tfa:苯酚:h2o:edt＝87.5:5:5:2.5，tfa:苯甲硫醚:间甲酚:h2o＝85:5:5:5；所述裂解液的用量为10eq。
25.在本发明的一些具体实施方案中，所述沉淀采用10eq的乙醚。
26.在本发明的一些具体实施方案中，步骤e中所述溶解采用水与所述步骤d的产物混合，以mg/ml计，所述步骤d的产物与水的质量体积比为1：(1～10)。
27.在本发明的一些具体实施方案中，步骤e中所述氧化采用的氧化剂为i2，所述氧化剂的用量为2～8eq，所述氧化的时间为30～90min；所述氧化采用维生素c结束反应，维生素c的用量为i2的5～15eq。
28.本发明采用片段缩合的合成策略，将3对二硫键的形成过程划分为3个阶段，先以固相方法合成利那洛肽5-14，利用dmso氧化形成第1对二硫键cys(5-13)；使用2-ctc树脂合成利那洛肽2-4全保护肽，将其与上述利那洛肽5-14进行片段缩合，然后通过i2氧化形成第2对二硫键cys(2-10)；最后在液相中通过i2氧化形成第3对二硫键cys(1-6)的形成。该方法能够使3对二硫键高效配对，降低错配率，且裂解利那洛肽2-4全保护肽树脂的裂解液为三氟乙醇的二氯甲烷溶液，避免使用三氟乙酸的强酸体系，减少了对环境的污染和实验的安全性。本发明的合成策略有助于提高产品纯度和收率，且原料价格低廉易得，易于放大生产。所得利那洛肽精肽纯度为99.8％，收率为41.6％。对比例其目标产物收率为26.9％，与
8eq的i2，反应时间为2-8小时，反应溶剂dmf用量为10-20eq。
45.所述步骤(6)含两对二硫键的利那洛肽的合成过程中，第6位fmoc-cys(stbu)-oh的侧链stbu保护基脱保护试剂为20％-80％β-巯基乙醇/dmf溶液，脱除时间为2-6小时。脱保护试剂β-巯基乙醇/dmf溶液的用量为合成规模的5当量。脱除侧链stbu保护基完毕用dmf清洗树脂次数为10-20次。裂解步骤(6)肽树脂的裂解液所用捕获剂为edt/tis/间甲酚/苯酚/苯甲硫醚/的一种或多种。
46.所述步骤(7)利那洛肽第3对二硫键cys(1-6)的形成过程中，使用的纯化水与粗肽溶解比例为1mg/ml-1mg/10ml，氧化剂i2用量为2-8eq反应30-90分钟，维生素c用量为i2的5-15eq。
47.现有的文献报道利那洛肽的合成方法基本都是先固相合成利那洛肽线性粗肽，然后在液相通过氧化进行半胱氨酸二硫键的环化，得到利那洛肽粗品。液相环化一般在较低的浓度下进行氧化反应，反应效率较低，且容易产生二硫键错配，出现异构体杂质产生大量杂质，不利于产物的纯化分离，所得利那洛肽的纯度和收率都较低，不利于工业放大生产；本发明采用片段缩合的方式，将利那洛肽3对二硫键的形成过程分为互不干扰的三个过程，真正意义上体现了正交的保护策略，极大地降低了利那洛肽中二硫键发生错配的现象，且本发明采用的半胱氨酸保护基脱除条件简便易于操作，原料价格低廉易得，能有效的降低物料成本，有利于工业化大规模生产。
48.缩写及英文含义
[0049][0050]
本发明提供的利那洛肽的制备方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
[0051]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0052]
实施例1:fmoc-tyr(tbu)-wang resin的合成
[0053]
称取替代度为0.81mmol/g的wang resin 6.713克，加入到固相反应柱中，用dmf洗涤2次，用dmf溶胀树脂30分钟。称取6.893克fmoc-tyr(tbu)-oh,2.432克hobt,0.220克dmap,用30ml dmf溶解后加入3.018克dic活化5min，将混合液加入反应柱中，室温反应2-3小时，反应过程用氮气做保护气体。反应结束后，抽掉反应液，dmf清洗树脂3次，按照摩尔比(1:1)加入乙酸酐和吡啶进行封闭反应6小时。将树脂用甲醇收缩后真空干燥，得到fmoc-tyr(tbu)-wang resin。使用紫外分光光度计测得fmoc-tyr(tbu)-wang resin替代度为0.47mmol/g。
[0054]
实施例2：利那洛肽(5-14)-wang resin的合成
[0055]
称取上述替代度为0.47mmol/g的fmoc-tyr(tbu)-wang resin6.383克，转入固相反应柱中，用dmf清洗2次，用dmf溶胀树脂30分钟，加入20％哌啶/dmf(v/v)溶液5+10分钟脱除肽树脂上的fmoc保护基，脱除完毕用dmf清洗树脂6次，茚三酮检测结果呈阳性，说明脱保护成功。称取5.542克fmoc-cys(mmt)-oh，1.459克hobt，用15ml dmf溶解，在冰水浴条件下加入1.688ml dic活化5分钟，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，反应过程用氮气做保护气体，茚三酮检测树脂无色透明说明缩合成功。
[0056]
反应结束，用dmf清洗树脂3次，加入20％哌啶/dmf(v/v)溶液5+7分钟脱除fmoc-cys(mmt)-oh的fmoc保护基，脱除完毕用dmf洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂阳性。称取2.676克fmoc-gly-oh，1.459克hobt，用15ml dmf溶解，在冰水浴条件下加入1.688ml dic活化5分钟，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，反应过程用氮气做保护气体，茚三酮检测树脂无色透明说明缩合成功。按照同样的方法依次偶联后续的氨基酸，直至合成
[0057]
fmoc-cys(mmt)-cys(stbu)-asn(trt)-pro-ala-cys(acm)-thr(tbu)-gly-cys(mmt)-tyr(tbu)-wang resin。将该肽树脂用甲醇收缩后真空干燥，得到利那洛肽(5-14)-wang resin。
[0058]
实施例3：利那洛肽第1对二硫键cys(5-13)的形成
[0059]
3.1、配制1％tfa/dcm溶液，加入上述实施例2的树脂中反应5分钟，脱除序列中两个cys的mmt保护基，重复该脱保护步骤20次，脱除完毕后用dcm清洗树脂3次，dmf清洗树脂6次，向反应柱中加入10％的dmso进行利那洛肽二硫键cys(5-13)的氧化连接。反应12小时后，用dmf洗涤树脂6次。
[0060]
3.2、配制5％tfa/dcm溶液，加入上述实施例2的树脂中反应1分钟，脱除序列中两个cys的mmt保护基，重复该脱保护步骤10次，脱除完毕后用dcm清洗树脂3次，dmf清洗树脂6次，向反应柱中加入20％的dmso进行利那洛肽二硫键cys(5-13)的氧化连接。反应8小时后，用dmf洗涤树脂6次。
[0061]
实施例4：利那洛肽(2-4)全保护肽的合成
[0062]
称取替代度为1.12mmol/g的2-ctc树脂2.679克，加入到固相反应柱中，用dmf洗涤2次，用dmf溶胀树脂30分钟。称取4.136克fmoc-tyr(tbu)-oh,用15ml dmf溶解后加入3.139ml dipea活化5min，将混合液加入反应柱中，室温反应2小时，反应过程用氮气做保护气体。反应结束后，向反应柱中加入甲醇进行封闭反应0.5小时。封闭完成后，抽掉反应液，dmf清洗树脂3次。称取3.830克fmoc-glu(otbu)-oh，1.459克hobt，用15ml dmf溶解，在冰水浴条件下加入1.688ml dic活化5分钟，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，反应过程用氮气做保护气体，茚三酮检测树脂无色透明说明缩合成功。按照同样的操作偶联fmoc-cys(acm)-oh。将树脂用甲醇收缩后真空干燥，加入20％tfe/dcm裂解液裂解该肽树脂2小时，将树脂过滤，滤液用旋转蒸发仪旋干得到利那洛肽(2-4)全保护肽。经hplc分析检测，所得全保护肽纯度为98.4％。
[0063]
实施例5：利那洛肽(2-14)-wang resin的合成
[0064]
称取实施例4中得到的全保护肽(2eq)、hoat、hatu，用dmf溶解后，在冰水浴条件下加入dipea活化5分钟，加入到上述已完成第1对二硫键cys(5-13)连接的利那洛肽(5-14)肽树脂中，室温反应2小时，反应过程用氮气做保护气体，茚三酮检测树脂无色透明说明缩合成功。再用dmf清洗3遍，得到利那洛肽(2-14)-wang resin。
[0065]
实施例6：利那洛肽第2对二硫键cys(2-10)的形成
[0066]
6.1、向上述实施例5的反应柱中加入3eq的i2，反应溶剂dmf用量为10eq，反应8小时。反应过程中i2既脱除了cys(2-10)的侧链acm保护基，同时又氧化促使利那洛肽第2对二硫键cys(2-10)的形成。
[0067]
6.2、向上述实施例5的反应柱中加入5eq的i2，反应溶剂dmf用量为15eq，反应6小时。反应过程中i2既脱除了cys(2-10)的侧链acm保护基，同时又氧化促使利那洛肽第2对二硫键cys(2-10)的形成。
[0068]
6.3、向上述实施例5的反应柱中加入8eq的i2，反应溶剂dmf用量为20eq，反应2小时。反应过程中i2既脱除了cys(2-10)的侧链acm保护基，同时又氧化促使利那洛肽第2对二硫键cys(2-10)的形成。
[0069]
实施例7：含两对二硫键的利那洛肽(1-14)的合成
[0070]
7.1、称取boc-cys(trt)-oh、hobt、用dmf溶解，在冰水浴条件下加入dic活化5分钟，将混合液加入到上述实施例6的反应柱中，室温反应2小时，反应过程用氮气做保护气体，茚三酮检测树脂无色透明说明缩合成功。加入30％β-巯基乙醇/dmf溶液6小时脱除利那洛肽第6位fmoc-cys(stbu)-oh的侧链stbu保护基，脱除完毕用dmf清洗树脂10次。将树脂用甲醇收缩后真空干燥，加入10倍量的裂解液(tfa:tis:h2o:edt＝87.5:5:5:2.5)裂解3小时，过滤树脂，将滤液用10倍量冰乙醚沉淀，再通过离心得到多肽沉淀，将沉淀用乙醚清洗3次，用氮气吹干后获得含两对二硫键的利那洛肽1-14。
[0071]
7.2、称取boc-cys(trt)-oh、hobt、用dmf溶解，在冰水浴条件下加入dic活化5分钟，将混合液加入到上述实施例6的反应柱中，室温反应2小时，反应过程用氮气做保护气体，茚三酮检测树脂无色透明说明缩合成功。加入50％β-巯基乙醇/dmf溶液4小时脱除利那洛肽第6位fmoc-cys(stbu)-oh的侧链stbu保护基，脱除完毕用dmf清洗树脂15次。将树脂用甲醇收缩后真空干燥，加入10倍量的裂解液(tfa:苯酚:h2o:edt＝87.5:5:5:2.5)裂解3小时，过滤树脂，将滤液用10倍量冰乙醚沉淀，再通过离心得到多肽沉淀，将沉淀用乙醚清洗3次，用氮气吹干后获得含两对二硫键的利那洛肽1-14。
[0072]
7.3、称取boc-cys(trt)-oh、hobt、用dmf溶解，在冰水浴条件下加入dic活化5分钟，将混合液加入到上述实施例6的反应柱中，室温反应2小时，反应过程用氮气做保护气体，茚三酮检测树脂无色透明说明缩合成功。加入80％β-巯基乙醇/dmf溶液2小时脱除利那洛肽第6位fmoc-cys(stbu)-oh的侧链stbu保护基，脱除完毕用dmf清洗树脂20次。将树脂用甲醇收缩后真空干燥，加入10倍量的裂解液(tfa:苯甲硫醚:间甲酚:h2o＝85:5:5:5)裂解3小时，过滤树脂，将滤液用10倍量冰乙醚沉淀，再通过离心得到多肽沉淀，将沉淀用乙醚清洗3次，用氮气吹干后获得含两对二硫键的利那洛肽1-14。
[0073]
实施例8：利那洛肽第3对二硫键cys(1-6)的形成
[0074]
8.1、取上述实施例7的含两对二硫键的利那洛肽1-14粗肽，用纯化水溶解(1mg/ml)后加入2eq的i2进行利那洛肽第3对二硫键cys(1-6)的氧化形成，反应90分钟后加入维生素c(用量为i2的5倍)终止反应，至此，已获得利那洛肽粗肽水溶液。经hplc分析，所得利那洛肽粗肽纯度为75.2％。
[0075]
8.2、取上述实施例7的含两对二硫键的利那洛肽1-14粗肽，用纯化水溶解(1mg/5ml)后加入5eq的i2进行利那洛肽第3对二硫键cys(1-6)的氧化形成，反应60分钟后加入维
生素c(用量为i2的10倍)终止反应，至此，已获得利那洛肽粗肽水溶液。经hplc分析，所得利那洛肽粗肽纯度为78.5％。
[0076]
8.3、取上述实施例7的含两对二硫键的利那洛肽1-14粗肽，用纯化水溶解(1mg/10ml)后加入8eq的i2进行利那洛肽第3对二硫键cys(1-6)的氧化形成，反应30分钟后加入维生素c(用量为i2的15倍)终止反应，至此，已获得利那洛肽粗肽水溶液。经hplc分析，所得利那洛肽粗肽纯度为76.3％。
[0077]
实施例9：利那洛肽粗肽的制备纯化
[0078]
取实施例8制备得到的利那洛肽粗肽水溶液，采用rp-hplc系统，波长220nm，色谱柱为反相c18柱，常规0.1％tfa/乙腈为流动相纯化，除盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到白色精肽固体。经hplc分析，利那洛肽精肽纯度为99.8％，收率为41.6％。
[0079]
对比例
[0080]
cn102875655b所述方法采用mmt保护基保护利那洛肽中的半胱氨酸侧链，再通过逐一偶联方式合成利那洛肽线性粗肽，最后采用gsh/gssh氧化体系氧化得到利那洛肽，hplc检测利那洛肽粗品纯度为60.8％，经hplc纯化后得利那洛肽精肽纯度为99.3％，收率为26.9％。
[0081]
于对比例相比，本发明通过片段法分3步逐步形成3对二硫键，避免了对比例在液相体系中采用一锅法自然氧化的非特异性二硫键配对，降低了3对二硫键的错配概率，使目标产物的收率提高至41.6％，与实施例目标产物收率26.9％相比，本发明有显著性的提升。
[0082]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。