一种中黑盲蝽insulinreceptorsubstrate1基因及其应用的制作方法

本发明属于昆虫基因工程技术领域，具体涉及一种中黑盲蝽insulinreceptorsubstrate1基因及其应用。

背景技术：

中黑盲蝽(adelphocorissuturalis)原是棉花的一种次生害虫，但随着转基因苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis,bt)棉花的广泛应用，广谱杀虫剂的减少，使其成为我国棉花种植区的一个重大问题。中黑盲蝽和绿盲蝽是我国棉田两种主要的棉花害虫，中黑盲蝽不仅会危害棉花，对谷物、蔬菜、水果等也有重大危害，而且中黑盲蝽具有多食性和高度流动性的特点，对其防治方面增加了困难，并呈进一步蔓延和大面积灾变的发展趋势。当前我国棉区广泛使用防治中黑盲蝽的杀虫剂包括机磷类、菊酯类、烟碱类等。频繁、过度长期使用化学杀虫剂会降低害虫对药剂的敏感性，开发和利用符合环保、健康、持续发展理念的无公害防治措施成为了当前的防治热点。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种中黑盲蝽insulinreceptorsubstrate1基因，所述基因可对中黑盲蝽生殖过程产生作用，当抑制其表达会显著减弱中黑盲蝽的生殖能力，终身产卵量显著减少，最终导致种群发展的衰退，为控制中黑盲蝽种群的发展提供新思路，也为实现绿色防治中黑盲蝽及其他半翅目昆虫提供了基础。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种中黑盲蝽insulinreceptorsubstrate1基因，所述基因的cdna序列如seqidno.1所示。

优选的，所述基因的编码蛋白质序列如seqidno.2所示。

本发明还提供了一组扩增所述基因的特异性引物，所述特异性引物包括上游引物irs-f和下游引物irs-r；所述上游引物irs-f的核苷酸序列如seqidno.3所示；所述下游引物irs-r的核苷酸序列如seqidno.4所示。

本发明还提供了一种制备所述基因的干扰序列dsrna的方法，以中黑盲蝽全基因组cdna为模板，以干扰引物组为引物进行pcr；所述干扰引物组包括上游引物dsirs-f和下游引物dsirs-r；所述上游引物dsirs-f的核苷酸序列如seqidno.5所示；所述下游引物dsirs-r的核苷酸序列如seqidno.6所示。

本发明还提供了所述基因在防治盲蝽科昆虫中的应用。

本发明还提供了所述基因在中黑盲蝽转基因植物育种中的应用。

本发明还提供了所述方法制备得到的干扰序列dsrna在防治盲蝽科昆虫中的应用。

本发明还提供了所述方法制备得到的干扰序列dsrna在中黑盲蝽转基因植物育种中的应用。

本发明提供了一种中黑盲蝽insulinreceptorsubstrate1基因，按照如图1所示流程设计了所述基因的rna干扰序列dsrna，而后利用显微注射法将dsrna注射到中黑盲蝽体内，以绿色荧光蛋白(gfp)作为对照组，发现中黑盲蝽insulinreceptorsubstrate1基因表达量在整个生育期极显著降低，同时发现干扰该基因后，中黑盲蝽卵巢内卵的数量和终生产卵量显著减少。本发明首次发现insulinreceptorsubstrate1基因在中黑盲蝽生殖过程中的作用，抑制其表达会显著减弱中黑盲蝽的生殖能力，终身产卵量显著减少，最终导致种群发展的衰退，为控制中黑盲蝽种群的发展提供新思路，也为实现绿色防治中黑盲蝽及其他半翅目昆虫提供了基础；同时所述insulinreceptorsubstrate1基因还可作为抗中黑盲蝽转基因植物培育的备选基因。

附图说明

图1为insulinreceptorsubstrate1基因功能验证流程图；

图2为peasy-t1克隆载体结构示意图；

图3为注射insulinreceptorsubstrate1基因干扰序列的dsrna后，insulinreceptorsubstrate1基因的沉默效率；其中“**”表示p<0.01，“dsirs”表示注射insulinreceptorsubstrate1基因dsrna的处理组；“dsgfp”表示注射gfp基因dsrna的对照组；

图4为注射insulinreceptorsubstrate1基因干扰序列的dsrna对中黑盲蝽生殖能力的影响，其中a表示注射insulinreceptorsubstrate1基因干扰序列的dsrna对中黑盲蝽卵巢内卵数量的影响；b表示注射insulinreceptorsubstrate1基因干扰序列的dsrna对中黑盲蝽终生产卵量的影响；其中“**”表示差异极显著性：“**”p<0.01，“dsirs”表示注射insulinreceptorsubstrate1基因干扰序列dsrna的处理组；“dsgfp”表示注射gfp基因dsrna的对照组。

具体实施方式

本发明提供了一种中黑盲蝽insulinreceptorsubstrate1基因，所述基因的cdna序列如seqidno.1所示。

本发明所述中黑盲蝽insulinreceptorsubstrate1基因的开放阅读框架全长3786bp，编码1261个氨基酸残基，预测分子质量为139.0kda，理论等电点为6.91。本发明所述基因的编码蛋白质序列优选如seqidno.2所示。

本发明所述基因的制备方法，优选包括：提取中黑盲蝽基因组rna，以所述rna为模板反转录为cdna，而后以所述cdna为模板，设计特异性引物进行pcr，从而克隆得到所述基因。

本发明还提供了一组扩增所述基因的特异性引物，所述特异性引物包括上游引物irs-f和下游引物irs-r；所述上游引物irs-f的核苷酸序列如seqidno.3所示：5'-tttctaagagtgcggtgcgg-3'；所述下游引物irs-r的核苷酸序列如seqidno.4所示：5'-ggaggtgttttcggagaggg-3'。

本发明利用所述特异性引物扩增所述基因，所述扩增优选包括：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃复性延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，产物4℃保存。本发明将所述扩增得到的产物优选与peasy-t1载体进行连接(图2)，重组载体转化入北京全式金感受态细胞t1，氨苄抗性lb培养基过夜培养。培养过夜后，挑取阳性克隆进行pcr验证(体系和条件同上)，将菌落pcr扩增为阳性的克隆测序，测序正确即为本发明所述基因。

本发明还提供了一种制备所述基因的干扰序列dsrna的方法，以中黑盲蝽全基因组cdna为模板，以干扰引物组为引物进行pcr；所述干扰引物组包括上游引物dsirs-f和下游引物dsirs-r；所述上游引物dsirs-f的核苷酸序列如seqidno.5所示；所述下游引物dsirs-r的核苷酸序列如seqidno.6所示。

本发明所述干扰引物组优选利用sidirectversion2.0(http://sidirect2.rnai.jp/)预测所述基因的dsrna区域，并利用在线软件(http://primer3.ut.ee/)设计特异性扩增引物(5'-端加上t7启动子序列)，用于insulinreceptorsubstrate1基因的dsrna片段的扩增。本发明设计得到的所述上游引物dsirs-f的核苷酸序列如seqidno.5所示：gggccgaaagaactcaacag；设计得到的所述下游引物dsirs-r的核苷酸序列如seqidno.6所示：ggggccatttgagcatagtc。

本发明在制备所述干扰序列dsrna时，优选首先制备dsrna模板，然后将所述dsrna模板纯化后，最后再合成所述干扰序列dsrna。本发明制备所述dsrna模板时，优选以中黑盲蝽cdna为模板，利用所述引物dsirs-f和dsirs-r进行第一pcr扩增。本发明所述第一pcr扩增的反应程序优选包括：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃复性延伸30s，35个循环；72℃延伸10min，产物4℃保存。本发明将所述第一pcr扩增的产物优选连接到peasy-t1载体上，挑取菌落pcr检测为阳性的单菌落测序，对测序正确的单菌落，6mllb+amp培养基过夜摇菌培养；然后再提取含有目的片段的质粒，以该质粒为模板，使用所述引物dsirs-f和dsirs-r进行第二pcr扩增，所述第二pcr扩增的反应程序与第一pcr扩增优选相同，在此不再赘述。

本发明对所述dsrna模板纯化的方法并没有特殊限定，优选包括酚氯仿抽提法。

本发明利用纯化后的dsrna模板合成所述干扰序列dsrna，所述合成的体系优选为50μl体系，包括：

本发明所述合成的程序优选为37℃，4h。

本发明在得到所述合成的产物后，优选还包括dnasei消化和酚氯仿抽提。本发明对所述dnasei消化和酚氯仿抽提的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可。

本发明还提供了所述基因在防治盲蝽科昆虫中的应用。

本发明在抑制所述基因的表达后，可显著减少中黑盲蝽雌虫卵巢内卵的数量，并且抑制中黑盲蝽卵巢内卵的数量与雌虫生殖力，对中黑盲蝽的生殖能力和种群的发展产生了不利影响，可用于盲蝽科昆虫的防治。

本发明还提供了所述基因在中黑盲蝽转基因植物育种中的应用。

本发明还提供了所述方法制备得到的干扰序列dsrna在防治盲蝽科昆虫中的应用。

本发明所述干扰序列dsrna可降低insulinreceptorsubstrate1的全生育期表大量，显著抑制所述基因的表达。

本发明还提供了所述方法制备得到的干扰序列dsrna在中黑盲蝽转基因植物育种中的应用。

下面结合实施例对本发明提供的中黑盲蝽insulinreceptorsubstrate1基因及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

中黑盲蝽insulinreceptorsubstrate1基因的克隆与分析

1.trizol法提取rna

1)组织裂解：取30mg中黑盲蝽样品置于1.5ml无酶管中，液氮预冷，使用研磨棒研磨雌虫，直至研磨成粉状，向管内加入1000μlrnaisoplus裂解液，室温静置5min。

2)12000×g4℃离心5min。

3)将上清液移至取新的1.5mlrna无酶管内，加入200μl氯仿。剧烈振荡混匀。

4)室温静置5min。

5)12000×g4℃离心15min。

6)将上清液移至取新的1.5mlrna无酶管内，加入与上清液等体积异丙醇。上下颠倒混匀。

7)室温静置10min。

8)12000×g4℃离心10min。

9)弃上清，留沉淀。

10)750μl无水乙醇与250μl无rna酶的h2o现配75％酒精。加入管内。上下颠倒。

11)7900×g4℃离心5min。

12)弃上清，留沉淀。

13)打开离心管盖，超净工作台内室温干燥4min。

14)加入适量无rna酶的h2o水溶解，待其充分溶解后于-80℃保存。

2.cdna克隆

使用日本takara公司的primescripttmrtmastermix(perfectrealtime)试剂盒将上述步骤(1)中提取的总rna合成cdna模板(具体步骤按照试剂盒说明书)。

3.引物设计

根据转录组测序得到insulinreceptorsubstrate1基因核酸序列(见seqidno：1)，利用在线软件设计引物(http://primer3.ut.ee/)验证预测的开放阅读框。设计后合成的引物如下：

上游引物序列irs-f(seqidno.3)：tttctaagagtgcggtgcgg，

下游引物序列irs-r(seqidno.4)：ggaggtgttttcggagaggg。

引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

4.pcr扩增

以中黑盲蝽cdna为模板，利用上述引物irs-f和irs-r，进行pcr扩增，pcr体系根据日本takara公司的extaq酶说明书配制。pcr反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃复性延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，产物4℃保存。1％琼脂糖电泳检测pcr产物，溴化乙锭(eb)染色，紫外灯下观察电泳结果，检测正确的片段切胶并利用axygen公司的的dna凝胶回收试剂盒纯化回收目的片段。

5.pcr产物的克隆

回收的pcr产物根据北京全式金peasy-t1载体说明书，将其与peasy-t1载体进行连接(见图2)，重组载体转化入北京全式金感受态细胞t1，氨苄抗性lb培养基过夜培养。培养过夜后，挑取8个阳性克隆进行pcr验证(体系和条件同上)，将菌落pcr扩增为阳性的克隆取新鲜菌液送武汉擎科生物公司测序。

6.序列分析

将测序公司返回的insulinreceptorsubstrate1基因核苷酸序列与转录组测序所得的核苷酸序列利用ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行比对，验证其正确性，比对结果显示测序核苷酸序列与转录组核苷酸序列一致。利用expasy(http://web.expasy.org/translate/)预测并分析该基因的蛋白序列(seqidno.2)，insulinreceptorsubstrate1基因开放阅读框架全长3786bp，编码1261个氨基酸残基，预测分子质量为139.0kda，理论等电点为6.91，分离的蛋白具有典型的insulinreceptorsubstrate1蛋白特征。

实施例2

合成dsrna

1.制备dsrna模板

1)根据实施例1中得到的insulinreceptorsubstrate1基因序列，通过sidirectversion2.0(http://sidirect2.rnai.jp/)预测dsrna区域，并利用在线软件(http://primer3.ut.ee/)设计特异性扩增引物(5'-端加上t7启动子序列)，用于insulinreceptorsubstrate1基因的dsrna片段的扩增，设计的特异性引物如下：

上游引物序列dsirs-f(seqidno.5)：gggccgaaagaactcaacag，

下游引物序列dsirs-r(seqidno.6)：ggggccatttgagcatagtc。

2)以中黑盲蝽cdna为模板，利用上述引物dsirs-f和dsirs-r进行pcr扩增，pcr反应体系根据日本takara公司的extaq酶使用说明书配制。pcr反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃复性延伸30s，35个循环；72℃延伸10min，产物4℃保存。1％琼脂糖电泳检测pcr产物，溴化乙锭(eb)染色，紫外灯下观察电泳结果，切胶并利用axygen的dna凝胶回收试剂盒纯化回收目的片段,将pcr产物连接到peasy-t1载体(见图2)上。挑取菌落pcr检测为阳性的单菌落，送北京擎科生物公司测序，检测基因序列的正确性，对测序正确的单菌落，6mllb+amp培养基过夜摇菌培养。

用axyprep质粒提取试剂盒提取含有目的片段的质粒，以该质粒为模板，使用上述特异性引物dsirs-f和dsirs-r进行第二次pcr扩增，pcr体系和反应程序同上述(1)。

2.dsrna模板的纯化

将第二次pcr的产物利用酚氯仿抽提法纯化，具体操作方法如下：

1)将pcr产物移至新的1.5mlrna无酶管中，用无rna酶的h2o定容至300μl(可根据实际需要等比例扩大体系)，加入1/10体积(30μl)的3m乙酸钠(ph5.2)。

2)加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，充分震荡后，室温，12000r/min，离心10min。

3)移液枪吸取上层相(约300μl)，放于新的1.5mlrna无酶管中，再加入2倍体积(约600μl)的无水乙醇(提前放入-20℃预冷)，温和混匀后放于-20℃沉淀3h。

4)4℃，12000r/min，离心15min，弃上清液。

5)加入无rna酶的h2o配制，-20℃预冷后的75％乙醇，上下颠倒数次，洗涤沉淀。

6)4℃，7500r/min，离心5min。

7)移液枪吸尽上清液，超净工作台内风干沉淀，加入20μl无rna酶的h2o溶解沉淀。

8)取1μl产物原液10倍稀释。

9)用1％的琼脂糖凝胶电泳检测稀释10倍后的产物，并用nanodrop2000检测产物浓度和od值。

3.合成dsrna

1)dsrna合成反应体系

按以下比例配置dsrna合成反应体系

移液枪吸打混匀，瞬时离心。37℃，4小时。

2)dnasei消化dna模板

dnasei消化dna模板，按照比例加入如下所示试剂

充分混匀，瞬时离心，37℃，60min。

4.酚氯仿抽提dsrna

1)将反应产物转移至新的无rna酶1.5ml离心管中，无rna酶的h2o定容至300μl。加入1/10体积(30μl)的3m乙酸钠(ph5.2)。

2)加入150μl的水饱和酚与150μl氯仿，充分震荡，4℃，12000r/min，离心15min。

3)移液枪吸取上层相(约300μl)，放入新的无rna酶1.5ml离心管中，加入2.5倍体积(约750μl)无水乙醇(提前放入-20℃预冷)温和混匀后放于-20℃静置过夜。

4)4℃，12000r/min，离心30min，弃上清液。

5)加入无rna酶的h2o配制的75％乙醇(提前放入-20℃预冷)上下颠倒数次，洗涤沉淀。

6)4℃，7500r/min，离心5min。

7)弃上清液，风干沉淀，加入20μl无rna酶的h2o溶解沉淀。

8)取0.5μl产物原液20倍稀释。

9)用1％的琼脂糖凝胶电泳检测稀释产物质量，并用nanodrop2000检测产物浓度和od值。

10)将dsrna浓度稀释为10μg/μl备用。

实施例3

注射insulinreceptorsubstrate1基因dsrna后基因的沉默效率及其对雌虫卵巢内卵的数量和生殖力变化情况

以绿色荧光蛋白基因(gfp)双链dsrna作为对照，将insulinreceptorsubstrate1基因dsrna通过显微注射法从中黑盲蝽后胸与腹部节间膜的最外侧注射进入新羽化雌虫体内。

沉默效率检测：分别收集注射处理后4天、6天、8天、10天、12天、14天、16天和18天的中黑盲蝽全虫，提取rna并反转录为cdna后，使用日本takara公司的premixextaq^tmii和bio-raddetectioniq2system检测insulinreceptorsubstrate1基因的沉默效应。

结果如图3所示，与对照组相比，注射insulinreceptorsubstrate1基因的dsrna后，insulinreceptorsubstrate1基因表达量在整个生育期显著下降，说明该中黑盲蝽insulinreceptorsubstrate1基因的干扰序列可显著抑制insulinreceptorsubstrate1基因的表达

卵巢内卵数量统计：注射dsrna11天后，利用体式显微镜(型号smz—t4，重庆奥特光学仪器有限责任公司)解剖雌虫卵巢，每个处理解剖20头未交配雌虫，3个生物学重复，观察卵巢形态，统计并分析中黑盲蝽卵巢内卵的数量。

结果如图4所示，注射处理11天后，解剖雌虫卵巢，统计卵巢内卵的数量并观察卵巢形态，与对照组相比，注射insulinreceptorsubstrate1基因dsrna处理组的中黑盲蝽卵巢内卵的数量减少了65.14％(图4中a)。说明注射insulinreceptorsubstrate1基因的dsrna可显著减少了中黑盲蝽雌虫卵巢内卵的数量。

生殖力：雌虫注射dsrna后，与新羽化的雄虫一一配对，放入一次性塑料杯内(5cm×7cm)交配，若发现雄虫死亡，马上补充新的性成熟的雄虫，以40对虫子为一个处理组，3个生物学重复，统计终生产卵量，以此评价注射insulinreceptorsubstrate1基因dsrna对中黑盲蝽产卵量的影响。

结果如图4所示，新羽化雌虫注射dsrna处理后与雄虫交配，统计终生产卵量，与对照组相比，处理组的中黑盲蝽产卵量下降了70.56％(图4中b)。可见将insulinreceptorsubstrate1基因干扰后，显著抑制了中黑盲蝽卵巢内卵的数量与雌虫生殖力，对中黑盲蝽的生殖能力和种群的发展产生了不利影响。因此本发明提供的rna干扰序列可应用于转基因抗中黑盲蝽植物的开发。进一步开发其蛋白可应用于中黑盲蝽的生物防治。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>华中农业大学

<120>一种中黑盲蝽insulinreceptorsubstrate1基因及其应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>3786

<212>dna

<213>adelphocorissuturalis

<400>1

atgtttaggatgtcatcaagccgtgagctggttcccagagtggacaccggtgaaattatc60

aagcaaggctacctaaaaaagctcaagacgatgcgcaaaaagtactttgttcttcggggg120

gattcagctgaggcatccgcccgtttggagtactatgagtcggaaaagaaatggaaaacg180

acaacttgcaacccaaaaagaactattactctgaagaactgttttaacatcaacaaaaaa240

ctggacactcgacataaatgggtaattgctctttacactcgcaacgacaagttttgcatc300

gtttttgataatgaagaagaaatggaagactggctccaagcactcttagcacttcaacaa360

ggcgaaaaaattgaagaaggcggagttgtacgtcctaatttcgagcacgtctgggaggtt420

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ctcactgaccaagcggtcactcttgtgaggcaggaacaagacgagtcagctcctgaaacg540

tccctcgaatattcgcttcagaaaattcgatgttgcgggcacgtagatacatttttctac600

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aacaacattgccgaaaacatccacctcacgatcctgaaatacctccatggtaacggaatt720

cagccattgtggcccatctcccagccatggctcaaccatgccagacgtccagagcgatct780

tggagcttcatgtttctttggaagagagcctgtgggaaaaaccccaatagagaaatccag840

cagccaaggccacgtgcagtatctgtgactgatgctgaccggcggcctctcatgacaagg900

tggtcaactcacacagcatctagcgggagtggtggtggagggacgaaccatcagcgaact960

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gacacgatgcccactcaggcggtctctcgacccaggacctccagcgagtgtgcaactcac1140

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gagagctctaacagtggaaaggacacgagttacatgataatgactccagggtcaaacgtc1620

cccaaaacccaagccaaaagcagcatcaatcacagtcgggggagtagtctgactgaagaa1680

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tctactcggcatagagatcactaccaaagtggagatctttctgctggttctagctgctct1800

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atatcgtattttcccgatgaagaattggctgctgaacgtcaccctcgatcttattccgtt1920

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ctcgatctcgctcgctcaggttcggaaagtgaagagtccaacaagaccctgaaaactcaa3660

agctcacttacagaatcttcttctgcaagctctccttctcccaacccggctgacgctgcc3720

acctcctctttcacgtacgctgaaatagattttgccaaaactggttcctcctcacaaaat3780

ccgtaa3786

<210>2

<211>1261

<212>prt

<213>adelphocorissuturalis

<400>2

metpheargmetserserserarggluleuvalproargvalaspthr

151015

glygluileilelysglnglytyrleulyslysleulysthrmetarg

202530

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354045

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