一种不同菌种对石油烃降解能力的比较方法及其应用与流程

本发明涉及一种不同菌种对石油烃降解能力的比较方法及其应用，属于环境微生物领域。

背景技术：

微生物在环境中广泛存在，当环境受到石油烃类物质污染时，微生物为了生存会产生适应性变化，而不能适应环境变化的微生物被淘汰，从而留下能够降解石油的优势微生物。在未受污染的生态系统中，石油烃降解为生物所占比例不到0.1％，但在石油烃污染环境中，该比例会增加10-100倍。石油烃降解微生物被广泛地运用于石油污染物的治理和修复，包括细菌、真菌、放线菌以及藻类。其中细菌种类最多，也是最主要的降解活性物质，它们对石油烃组分的降解遵循优先降解顺序：正烷烃＞支链烷烃＞单方烃＞环烷烃＞芳香烃＞多环芳烃＞沥青烯烃等。

为了对比不同微生物对石油碳氢化合物的代谢能力，本发明提供一种关于不同菌种对石油烃降解能力的比较方法。本发明能够在短时间内比较多种不同菌种对石油烃的降解能力。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题：针对现有判别降解菌对石油烃降解能力差异耗时较长的问题，提供了一种不同菌种对石油烃降解能力的比较方法及其应用。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

(1)菌种的来源：已公布的石油烃降解菌。

(2)菌种的活化培养：选取至少2种菌种，分别投入100ml灭菌的lb液体培养基中，并添加1％的原油，富集培养3-7d。

(3)菌种的驯化培养：分别在以葡萄糖、十六烷、菲和石油烃混合物为单一碳源和能源的无机盐培养基中加入1％富集培养的菌液，36℃，120rpm，培养3-7d。

(4)菌悬液配制：取50ml菌液于灭菌的离心管，4000转，离心10min，弃去上清液，用灭菌的生理盐水50ml悬浮沉淀物后再次离心，如上所述洗涤3次后，用紫外分光光度计测定菌悬液浓度。

(5)菌种生长曲线：用酶标仪连续测定菌液的od600，绘制菌种的生长曲线，确定不同菌种对石油烃降解能力。

进一步的，所述的lb液体培养基，其特征在于，lb液体培养基的成分为胰蛋白胨：10g/l，酵母提取物：5g/l，nacl：10g/l，ph值：7.0-7.4。

进一步的，所述的无机盐培养基，其特征在于，无机盐培养基的成分为kh2po4：1.0g/l，k2hpo4：1.0g/l，nh4no3：1.0g/l，mgso4·7h2o：0.2g/l，fecl3：0.05g/l，cacl2·2h2o：0.02g/l，ph：6.8-7.2。

进一步的，所述的菌悬液配制，其特征在于，实验操作均在超净工作台内或酒精灯附近完成，确保无空气中的杂菌污染。洗涤所使用的生理盐水需灭菌，移取菌悬液的注射器需灭菌。测定菌悬液浓度所使用的具塞比色皿使用前浸泡于70％的乙醇溶液中。以无菌的生理盐水为空白参比，测定洗涤后的菌液浓度，将菌悬液的od600调至相一致。

进一步的，所述菌液od600的测定：在超净工作台内，用8道移液器分别移取5μl的葡萄糖、十六烷、菲和石油烃混合物于无菌96孔板，继续向上述96孔板中移取160μl的bh培养基、15μl的菌悬液和37.5μg/ml的2,6-dcpip试剂20μl。将96孔板置于恒温培养箱中培养，用酶标仪在0h，4h，8h，12h，16h，20h，24h，48h，60h和72h测od600。并观察对应时刻96孔板的颜色变化。

本发明方法应用于比较不同菌种对其他含碳有机物污染物降解能力。

本发明在获得石油烃降解微生物后，选取至少2种菌种，并选取葡萄糖、十六烷、菲和石油烃混合物4种有机物分别代表普通碳源、烷烃、芳香烃和复杂石油烃，通过菌液在不同碳源微环境中的吸光值绘制菌种的生长曲线，确定不同菌种对石油烃降解能力。

附图说明

图1为各菌种在葡萄糖微环境中的生长曲线。

图2为各菌种在十六烷微环境中的生长曲线。

图3为各菌种在菲的微环境中的生长曲线。

图4为各菌种在石油烃微环境中的生长曲线。

具体实施方式

本实施例以海源菌属(j1)、阿尔蒂杆菌属(j2)、盐单胞菌属(j3)为例，结合实施例及附图，对本发明进行进一步详细说明。

实施例1：

由图1可知，j1、j2和j3均能较好的利用葡萄糖。3株菌对葡萄糖的利用能力：j1>j3>j2，j1和j2在36h对葡萄糖代谢完全，j3在12h对葡萄糖代谢完全。

实施例2：

由图2可知，j1和j3均能较好的利用十六烷，而j2对十六烷环境耐受性较差。3株菌对十六烷的降解能力：j1>j3>j2，均在24h达到最大生物量，24h后开始减少，可能十六烷已经代谢完全。

实施例3：

由图3可知，j1、j2和j3均能较好的利用菲，其中j3对菲的利用能力最强，j1和j2对菲的利用能力相当。

实施例4：

由图4可知，j1、j2和j3在石油烃混合物环境中的耐受性比在十六烷和菲环境中要更弱。但明显可看出j3在4h-12h的生物量迅速增长，证明该菌能降解石油烃混合物质，是石油烃优势降解菌。

技术特征：

1.一种不同菌种对石油烃降解能力的比较方法，其特征在于，其步骤如下：

(1)菌种的活化培养：选取能降解石油烃的菌种，分别投入100ml灭菌的lb液体培养基中，并添加1％的原油，富集培养3-7d，制得富集培养的菌液；

(2)菌种的驯化培养：分别在以葡萄糖、十六烷、菲和石油烃混合物为单一碳源和能源的无机盐培养基中加入1％步骤(1)制得的富集培养的菌液，36℃，120rpm，培养3-7d；

(3)菌悬液配制：取50ml步骤(2)制得的菌液于灭菌的离心管，4000转，离心10min，弃去上清液，用灭菌的生理盐水50ml悬浮沉淀物后再次离心，如上所述洗涤3次后，用紫外分光光度计测定菌悬液浓度；

(4)菌种生长曲线：用酶标仪连续测定菌液的od600，绘制菌液的生长曲线，确定不同菌种对石油烃降解能力。

2.如权利要求1所述的一种不同菌种对石油烃降解能力的比较方法，其特征在于，所述步骤(1)中的lb液体培养基的成分为胰蛋白胨：10g/l，酵母提取物：5g/l，nacl：10g/l，ph值：7.0-7.4。

3.如权利要求1所述的一种不同菌种对石油烃降解能力的比较方法，其特征在于，所述步骤(2)中的无机盐培养基的成分为kh2po4：1.0g/l，k2hpo4：1.0g/l，nh4no3：1.0g/l，mgso4·7h2o：0.2g/l，fecl3：0.05g/l，cacl2·2h2o：0.02g/l，ph：6.8-7.2。

4.如权利要求1所述的一种不同菌种对石油烃降解能力的比较方法，其特征在于，所述步骤(3)中的菌悬液配制，其特征在于，实验操作均在超净工作台内或酒精灯附近完成，确保无空气中的杂菌污染，洗涤所使用的生理盐水需灭菌，移取菌悬液的注射器需灭菌，测定菌悬液浓度所使用的具塞比色皿使用前浸泡于70％的乙醇溶液中，以无菌的生理盐水为空白参比，测定洗涤后的菌液浓度，将菌悬液的od600调至相一致。

5.如权利要求1所述的一种不同菌种对石油烃降解能力的比较方法，其特征在于，所述步骤(4)中菌液od600的测定：在超净工作台内，用8道移液器分别移取5μl的葡萄糖、十六烷、菲和石油烃混合物于无菌96孔板，继续向上述96孔板中移取160μl的bh培养基、15μl的菌悬液和37.5μg/ml的2,6-dcpip试剂20μl，将96孔板置于恒温培养箱中培养，用酶标仪在0h，4h，8h，12h，16h，20h，24h，48h，60h和72h测od600，并观察对应时刻96孔板的颜色变化。

6.如权利要求1所述的一种不同菌种对石油烃降解能力的比较方法的应用，其特征在于，该方法应用于比较不同菌种对其他含碳有机物污染物降解能力。

技术总结
本发明公开了一种不同菌种对石油烃降解能力的比较方法及其应用，属于环境微生物领域。具体过程为：选取至少2种菌种，富集培养后，在以目标污染物为单一碳源和能源的无机盐培养驯化，利用2,6‑二氯酚靛酚生物试剂的颜色变化，连续监测菌液OD600，绘制菌种的生长曲线图，通过相同时段内菌种生长量来比较菌种对石油烃降解能力的强弱。本发明能够在短时间内比较多种不同菌种对石油烃的降解能力，以解决现有技术缺陷。具有实验操作简单，周期较短，有机溶剂用量少等优点。比较菌种石油烃降解能力的强弱，可以快速选取能最佳降解目标污染物的微生物，为石油污染的土壤修复提供尽可能多的菌种资源。

技术研发人员：彭芃;弓亮;袁林杰;王超北;解庆林;申泰铭
受保护的技术使用者：桂林理工大学
技术研发日：2020.07.23
技术公布日：2020.10.20