检测外泌体miR-6774-3p或miR-6776-5p的试剂的新用途

检测外泌体mir-6774-3p或mir-6776-5p的试剂的新用途
技术领域
1.本发明属于癌症诊断领域。具体涉及检测外泌体mir-6774-3p和/或mir-6776-5p的试剂在制备甲状腺癌淋巴结转移检测试剂盒中的用途。


背景技术：

2.甲状腺乳头状癌是甲状腺癌最常见的病理亚型，近年来其患病人数在世界范围呈爆发式增长。由于多数甲状腺乳头状癌起病隐匿，常无明显阳性症状体征，多在体检时发现；且在明确诊断时，约30％-80％的患者已合并颈部淋巴结转移。颈部淋巴结转移不仅使手术难度增大，切口创面延长，增加手术并发症的发生率，并严重影响患者预后。
3.目前现有的术前诊断技术主要为颈部高分辨率彩超结合超声引导下穿刺活检，而超声检测受多种因素干扰，其准确度受到较大限制；而细针穿刺存在出血风险，且存在通过穿刺针道肿瘤种植转移的风险。因此，急需一种能在术前准确评估是否颈部淋巴结存在转移的辅助检查手段，这对甲状腺乳头状癌的精准治疗、预后评估具有重要意义。
4.外泌体是细胞分泌的直径约40～160nm的微小膜泡，其可作为细胞之间的通讯介质，通过传递细胞来源的“货物”(蛋白质、脂质、核酸等)促进受体细胞产生各种生理性或病理性变化。近年来研究表明，外泌体中mirnas是含量最丰富的核酸成分，其在肿瘤转移中发挥着重要作用，并可作为肿瘤早期诊断、淋巴结转移、远处转移的诊断标志物。如乳腺癌细胞外泌体mir-122可调控预转移部位葡萄糖代谢情况进而促进肿瘤转移；宫颈癌细胞外泌体mir-221-3p可靶向并沉默抑癌基因vash1进而促进瘤周淋巴管增生和淋巴结转移；结肠癌细胞可通过外泌体主动将抑癌性mir-193a转运出胞外，进而促进自身增殖和转移。
5.人类mir-6774-3p(mimat0027449)，是由人类第16号染色体编码的一种mirna，目前鲜有关于它的报道。
6.人类mir-6776-5p(mimat0027452)，是由人类第17号染色体编码的一种mirna。研究表明，肾细胞癌中，mir-6776-5p可降解trpm3基因(一种组织特异性的癌基因)，mirna-6776起到抑制肾细胞癌转移的作用(li w等.circprrc2a promotes angiogenesis and metastasis through epithelial-mesenchymal transition and upregulates trpm3 in renal cell carcinoma.theranostics.2020；10(10):4395-4409)。
7.目前还没有关于外泌体内mir-6774-3p与mir-6776-5p可作为甲状腺癌转移相关标志物的用途的报道。


技术实现要素：

8.本发明要解决的问题是：提供检测外泌体mir-6774-3p或mir-6776-5p的试剂在制备甲状腺癌转移检测试剂盒中的新用途。
9.本发明的技术方案如下：
10.检测外泌体mir-6774-3p和/或mir-6776-5p的试剂在制备甲状腺癌淋巴结转移检测试剂盒中的用途。
11.如前述的用途，所述外泌体为血浆中的外泌体。
12.如前述的用途，所述甲状腺癌为甲状腺乳头状癌。
13.如前述的用途，所述检测外泌体mir-6774-3p和/或mir-6776-5p的试剂为：基因芯片试剂、northern blot检测试剂、原位杂交试剂或pcr检测试剂。
14.如前述的用途，所述检测外泌体mir-6774-3p和/或mir-6776-5p的试剂为pcr检测试剂，包括逆转录引物和定量pcr引物；
15.mir-6774-3p的逆转录引物的序列如seq id no.1所示，定量pcr引物的序列如seq id no.2和seq id no.3所示；
16.mir-6776-5p的逆转录引物的序列如seq id no.7所示，定量pcr引物的序列如seq id no.8和seq id no.9所示。
17.一种甲状腺癌淋巴结转移检测试剂盒，所述试剂盒包括检测外泌体mir-6774-3p和/或mir-6776-5p的试剂。
18.如前述的试剂盒，所述外泌体为血浆中的外泌体。
19.如前述的试剂盒，所述甲状腺癌为甲状腺乳头状癌。
20.如前述的试剂盒，所述检测外泌体mir-6774-3p和/或mir-6776-5p的试剂为：基因芯片试剂、northern blot检测试剂、原位杂交试剂或pcr检测试剂。
21.如前述的试剂盒，所述检测外泌体mir-6774-3p和/或mir-6776-5p的试剂为pcr检测试剂，包括逆转录引物和定量pcr引物；
22.mir-6774-3p的逆转录引物的序列如seq id no.1所示，定量pcr引物的序列如seq id no.2和seq id no.3所示；
23.mir-6776-5p的逆转录引物的序列如seq id no.7所示，定量pcr引物的序列如seq id no.8和seq id no.9所示。
24.发明人通过研究发现，在甲状腺乳头状癌淋巴结转移的患者血浆外泌体中，mir-6774-3p以及mir-6776-5p的水平分别极显著地高于非淋巴结转移的患者。通过检测血浆外泌体mir-6774-3p或mir-6776-5p水平，可有效区分淋巴结转移和非转移的甲状腺乳头状癌患者，可同时使灵敏度和特异度之和达到180％以上，这在单一标记物用于疾病诊断的实践中，是极高的水平。尤其是mir-6776-5p可到100％的灵敏度和99.3％的特异度，这分别代表着0漏诊和几乎0误诊。若将检测mir-6774-3p以及mir-6776-5p的水平联合使用，能进一步提高诊断的准确率。
25.根据该发现，将检测外泌体mir-6774-3p和/或mir-6776-5p的试剂用于制备甲状腺癌淋巴结转移检测试剂盒，具有良好的应用前景。
26.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
27.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
28.图1：mir-6774-3p与甲状腺乳头状癌关系的roc曲线。
29.图2：mir-6776-5p与甲状腺乳头状癌关系的roc曲线。
具体实施方式
30.实施例1:mir-6774-3p检测试剂盒
31.本实施例以pcr检测试剂盒为例进行介绍。
32.1.试剂盒的组成
33.1.1逆转录试剂
34.(1)microrna stem-loop逆转录引物
35.mir-6774-3p的stem-loop逆转录引物序列(seq id no.1)为：
[0036]5’-
gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacctgtgg-3’。
[0037]
(2)逆转录所需其他常规试剂
[0038]
包括dntp、5
×
buffer、m-mlv逆转录酶；可以是本领域常规逆转录试剂。
[0039]
1.2实时荧光定量pcr试剂
[0040]
(1)定量pcr引物
[0041]
序列分别为：
[0042]
正向引物(seq id no.2)：5
’-
gcgctcgtgtccctcttg-3’；
[0043]
反向引物(seq id no.3)：5
’-
gtgcagggtccgaggt-3’。
[0044]
(2)实时荧光定量pcr预混液
[0045]
takara公司的tb green premix ex taq ii(tli rnaseh plus)。
[0046]
2.本发明试剂盒的使用方法
[0047]
2.1血浆外泌体rna提取
[0048]
采血不低于10ml至edta抗凝管，采用1800g、10min、4℃离心，将上清转移至另一edta管内，再行3000g、15min、4℃，取上清保存于冻存管内-80℃冷藏。需要检测时，采用本领域常规的超速离心法提取血浆外泌体，并用200ul pbs重悬。提取外泌体rna。
[0049]
2.2逆转录
[0050]
使用逆转录试剂进行mirna的逆转录。逆转录反应体系如表1所示。
[0051]
表1逆转录反应体系
[0052][0053]
反应程序：16℃10分钟，42℃55分钟，85℃5分钟，4℃保存。
[0054]
2.3实时荧光定量pcr
[0055]
使用实时荧光定量pcr试剂对逆转录得到的dna模板进行检测。pcr反应体系如表2
所示。
[0056]
表2 pcr反应体系
[0057][0058]
反应程序：95℃2分钟，(95℃15秒，72℃30秒)5个循环，(95度15秒，60度1分钟)40个循环采集荧光，10度10分钟。
[0059]
2.4初步判断
[0060]
当被检对象与已知未出现淋巴结转移的甲状腺乳头状癌患者相比，外泌体mir-6774-3p水平显著更高，则表明被检对象出现甲状腺乳头状癌淋巴结转移的风险高。
[0061]
2.5进一步判断
[0062]
(1)相对拷贝数计算
[0063]
实时荧光定量结束后，采用外参cel-mir-39对目标(包括实验组和对照组)mirnas进行定量，根据检测的ct值使用定量公式2
△△
ct
计算相对表达水平(相对拷贝数)。
[0064]
外参cel-mir-39通用序列：5
’-
ucaccggguguaaaucagcuug-3’(seq id no.4)；引物由qiagen公司合成(mircury lna mirna pcr starter kit，货号339320)，序列如下：
[0065]
fp(seq id no.5)：5
’-
gcgctcaccgggtgtaaa-3’[0066]
rp(seq id no.6)：5
’-
gtgcagggtccgaggt-3’[0067]
计算公式：
[0068]2-△△
ct
＝2-(
△
ct实验组
-△
ct对照组)
＝2-[(实验组基因ct-实验组外参基因ct)-(对照组基因ct-对照组外参基因ct)]
。
[0069]
(2)判读
[0070]
当被检对象相对于已知未出现淋巴结转移的甲状腺乳头状癌患者的外泌体mir-6774-3p相对拷贝数大于3.71时，则表明病人出现甲状腺乳头状癌的淋巴结转移；反之，病人未出现甲状腺乳头状癌的淋巴结转移。
[0071]
实施例2:mir-6776-5p检测试剂盒
[0072]
本实施例仍以pcr检测试剂盒为例进行介绍。
[0073]
1.试剂盒的组成
[0074]
1.1逆转录试剂
[0075]
(1)microrna stem-loop逆转录引物
[0076]
mir-6776-5p的stem-loop逆转录引物序列(seq id no.7)为：
[0077]5’-
gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacaacccc-3’。
[0078]
(2)逆转录所需其他常规试剂
[0079]
包括dntp、5
×
buffer、m-mlv逆转录酶；可以是本领域常规逆转录试剂。
[0080]
1.2实时荧光定量pcr试剂
[0081]
(1)定量pcr引物
[0082]
序列分别为：
[0083]
正向引物(seq id no.8)：5
’-
tcggcaggtctgggtgca-3’；
[0084]
反向引物(seq id no.9)：5
’-
gtgcagggtccgaggt-3’。
[0085]
(2)实时荧光定量pcr预混液
[0086]
takara公司的tb green premix ex taq ii(tli rnaseh plus)。
[0087]
2.试剂盒的使用方法
[0088]
2.1血浆外泌体rna提取
[0089]
同实施例1。
[0090]
2.2逆转录
[0091]
同实施例1。
[0092]
2.3实时荧光定量pcr
[0093]
同实施例1。
[0094]
2.4初步判断
[0095]
当被检对象与已知未出现淋巴结转移的甲状腺乳头状癌患者相比，外泌体mir-6776-5p水平显著更高，则表明被检对象出现甲状腺乳头状癌淋巴结转移的风险高。
[0096]
2.5进一步判断
[0097]
(1)相对拷贝数计算
[0098]
同实施例1。
[0099]
(2)判读
[0100]
当(被检对象相对于已知未出现淋巴结转移的甲状腺乳头状癌患者的)外泌体mir-6776-5p相对拷贝数大于3.71时，则表明病人出现甲状腺乳头状癌的淋巴结转移；反之，病人未出现甲状腺乳头状癌的淋巴结转移。
[0101]
为了进一步提高检测准确性，还可将实施例1和实施例2的试剂盒合并为一个试剂盒，即同时检测外泌体mir-6774-3p和mir-6776-5p的试剂盒。
[0102]
mirna的检测试剂还有很多，例如：基因芯片试剂、northern blot检测试剂、原位杂交试剂等，均为本发明试剂盒的常规替代形式。
[0103]
为了进一步说明本发明的有益效果，本发明还提供如下实验例。
[0104]
实验例1:临床验证
[0105]
1.方法
[0106]
随机选取120例甲状腺乳头状癌血浆样本，其中60例发生淋巴结转移(转移组)，60例未发生淋巴结转移(对照组)，提取外泌体rna，用实施例1和2的试剂盒和方法检测血浆外泌体mir-6774-3p、mir-6776-5p的水平；并将实施例1中的引物换成mir-4707-3p、mir-4749-5p和mir-8058的引物，检测血浆外泌体中mir-4707-3p、mir-4749-5p和mir-8058的水平。再采用外参cel-mir-39对前述mirnas进行定量。
[0107]
所述mir-4707-3p、mir-4749-5p和mir-8058的引物序列如表3所示。
[0108]
表3 mir-4707-3p、mir-4749-5p和mir-8058的引物序列
[0109][0110]
采用roc曲线和auc计算外泌体mir-6774-3p或mir-6776-5p对预测甲状腺乳头状癌淋巴结转移的灵敏度和特异度，并算出最佳阈值。
[0111]
2.结果
[0112]
如表4所示，mir-6774-3p或mir-6776-5p在转移组和对照组中的相对拷贝数有极显著性差别(p《0.001)，而mir-4707-3p、mir-4749-5p和mir-8058在两组中无显著性差别。
[0113]
表4实时荧光定量pcr显示外泌体mirnas的相对拷贝数
[0114][0115]
roc曲线(图1和图2)显示，mir-6774-3p和mir-6776-5p的auc值分别为0.944、0.990。当选择mir-6774-3p对cel-mir-39的相对拷贝数阈值为3.71时，预测淋巴结转移的灵敏度为93.3％，特异度为90.0％。当选择mir-6776-5p对cel-mir-39的相对拷贝数阈值为2.76时，预测淋巴结转移的灵敏度为100％，特异度为99.3％。联合使用mir-6774-3p和mir-6776-5p，能进一步提高特异性和灵敏度。
[0116]
综上，外泌体mir-6774-3p、mir-6776-5p与甲状腺乳头状癌淋巴结转移高度相关，检测血浆中外泌体mir-6774-3p或mir-6776-5p水平的试剂可用于制备检测甲状腺乳头状癌淋巴结转移的试剂盒。