抗CD123嵌合抗原受体(CAR)用于癌症治疗的制作方法

抗cd123嵌合抗原受体(car)用于癌症治疗
[0001]
本申请是中国专利申请201580056515.6的分案申请，原申请的申请日是2015 年8月19日，发明名称是“抗cd123嵌合抗原受体(car)用于癌症治疗”。
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相关申请
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本申请要求2014年8月19日的pct申请号pct/cn2014/084696和2014年11 月6日的pct申请号pct/cn2014/090508的优先权。这些申请的每个申请的完整 内容通过引用的方式并入本文。
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序列表
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本申请含有已经通过电子方式以ascii格式提交并因而通过引用的方式完 整并入的序列表。2015年8月18日创建的所述ascii副本命名为 n2067-7064wo5_sl.txt并且大小为625,588比特。
发明领域
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本发明总体上涉及经工程化以表达嵌合抗原受体(car)的免疫效应细胞(例 如，t细胞、nk细胞)的用途，用于治疗与表达分化抗原簇123蛋白(cd123)相关 的疾病。
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发明背景
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大多数急性髓性白血病(aml)患者使用标准疗法是不可治愈的(mrozek等 人,2012,j clin oncol,30:4515-23)并且那些复发性或难治性aml(rr-aml)患 者具有特别不良的预后(kern等人,2003,blood 2003,101:64-70；wheatley等人, 1999,br j haematol,107:69-79)。
[0009]
遗传工程可以向t细胞赋予针对选择目标的特异性。t细胞可以用编码抗体 单链可变片段(scfv)连同信号传导分子的遗传物质转导，因而利用互补决定区 (cdr)以非mhc限制方式识别细胞表面抗原。这些细胞称作嵌合抗原受体(car) t细胞。靶向多种恶性肿瘤中至少20种不同表面分子的临床前尝试和临床尝试已 经显示某种活性，然而这些尝试经常受输注的car t细胞产物的持久性低劣限 制(sadelain等人,2009,curr opin immunol 2009,21:215-23)。在晚期cll和all患者中采用抗cd19重定向的t细胞时取得的最近的成功(porter等人,2011, n engl j med,365:725-33；kalos等人,2011,science transl med,3:95ra73； grupp和kalos,2013,n engl j med,368:1509-18)显示，这些细胞可以在单次输 注后根除巨大肿瘤负荷，缓解作用迄今持续长达3年，从而强调了car t细胞疗 法的巨大潜力。已经存在动物模型中靶向aml的少数临床前尝试(marin等人, 2010,haematologica,95:2144-52；tettamanti等人,2013,br j haematol, 161:389-401)。尽管一项最近公开的小型临床试验显示，产生t细胞并将其输注 至侵袭性恶性肿瘤患者是可行的(ritchie等人,2013,mol ther,21:2122-9)。除基 因修饰的t细胞上的嵌合抗原受体识别和摧毁靶向细胞的能力外，成功的治疗性 t细胞疗法需要具有增殖和随时间推移持续存在的能力和进一步监测复发的能 力。由于失能、抑制或衰竭，t细胞的效率可以是可变的，然而熟练执业者此时 对这些性质仅具备有限的控制措施。为了有效，car转化的患者t细胞需要持 续存在并维持响应于抗原而增殖的能力。已经显示all患者的t细胞表现可以用 包
含鼠scfv的cart19做到这一点(参见，例如，grupp等人,nejm368:1509-1518(2013)。
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发明概述
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在第一方面，本发明表征了一种编码嵌合抗原受体(car)的分离核酸分子， 其中car包含cd123结合结构域(例如，人或人源化cd123结合结构域)、跨膜结 构域和胞内信号结构域(例如，包含共刺激结构域和/或初级信号结构域的胞内信 号结构域)。在一个实施方案中，car包含本文所述的cd123结合结构域(例如， 本文所述的人或人源化cd123结合结构域)、本文所述的跨膜结构域和本文所述 的胞内信号结构域(例如，包含共刺激结构域和/或初级信号结构域的胞内信号结 构域)。
[0012]
在一个实施方案中，编码的cd123结合结构域包含本文所述的cd123结合 结构域的一个或多个(例如，全部三个)轻链互补决定区1(lc cdr1)、轻链互补 决定区2(lc cdr2)和轻链互补决定区3(lc cdr3)、和/或本文所述的cd123 结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)重链互补决定区1(hc cdr1)、重链 互补决定区2(hc cdr2)和重链互补决定区3(hc cdr3)，例如，包含一个或多 个(例如，全部三个)lc cdr和一个或多个(例如，全部三个)hc cdr的cd123 结合结构域。在一个实施方案中，编码的cd123结合结构域(例如，人或人源化 cd123结合结构域)包含本文(例如，表2、6或表9中)所述的轻链可变区和/或本文 (例如，表2、6或表9中)所述的重链可变区。在一个实施方案中，编码的cd123 结合结构域是包含表2、6或表9的氨基酸序列的轻链和重链的scfv。在一个实施 方案中，编码的cd123结合结构域(例如，scfv)包含轻链可变区，所述轻链可变 区包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一个、两个或三个在表2、6 或表9中提供的轻链可变区的氨基酸序列的修饰(例如置换，例如，保守性置换)， 但不多于30、20或10个修饰(例如置换，例如，保守性置换)，或包含与表2、6 或表9的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，所述重链可 变区包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一个、两个或三个在表2、 6或表9中提供的重链可变区的氨基酸序列的修饰(例如置换，例如，保守性置换)， 但不多于30、20或10个修饰(例如置换，例如，保守性置换)，或包含与表2、6 或表9的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
[0013]
在其他实施方案中，编码的cd123结合结构域包含表2、6或表9中列出的任 何cd123重链结合结构域氨基酸序列的hc cdr1、hc cdr2和hc cdr3。在 实施方案中，cd123结合结构域还包含lc cdr1、lc cdr2和lc cdr3。在 实施方案中，cd123结合结构域包含表2、6或表9中列出的任何cd123轻链结合 结构域氨基酸序列的lc cdr1、lc cdr2和lc cdr3。
[0014]
在一些实施方案中，编码的cd123结合结构域包含表2或表9中列出的任何 cd123轻链结合结构域氨基酸序列的lc cdr1、lc cdr2和lc cdr3中的一 者、两者或全部以及表2、6或表9中列出的任何cd123重链结合结构域氨基酸序 列的hc cdr1、hc cdr2和hc cdr3中的一者、两者或全部。
[0015]
在一个实施方案中，编码的cd123结合结构域包含选自seq id no: 157-160、184-215、478、480、483和485的氨基酸序列。在一个实施方案中，编 码的cd123结合结构域(例如，scfv)包含了具有seq id no:157-160、184-215、 478、480、483和485的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例 如，保守性置换)、但不多于30、20或10个修饰(例如置换，例如，保守性置换) 的氨基酸序列或与seq id no:157-160、184-215、478、480、483和485的氨基 酸序列具有95-99％同一性的序列。
[0016]
在另一个实施方案中，编码的cd123结合结构域包含重链可变区，所述重 链可变区包含选自seq id no:216-219或243-274的氨基酸序列或seq idno:216-219或243-274的具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守 性置换)但不超过30、20或10个修饰(例如置换，例如保守性置换)的氨基酸 序列、或与seq id no:216-219或243-274具有95-99％同一性的序列。在另一个 实施方案中，编码的cd123结合结构域包含重链可变区，所述重链可变区包含 对应于seq id no:478、480、483或485的重链可变区的氨基酸序列、或seq idno:478、480、483或485的对应部分具有至少一个、两个或三个修饰(例如置 换，例如保守性置换)但不超过30、20或10个修饰(例如置换，例如保守性置 换)的氨基酸序列、或与seq id no:478、480、483或485的对应部分具有95-99％ 同一性的序列。
[0017]
在另一个实施方案中，编码的cd123结合结构域包含轻链可变区，所述轻 链可变区包含选自seq id no:275-278或302-333的氨基酸序列或seq id no: 275-278或302-333的具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守性置 换)但不超过30、20或10个修饰(例如置换，例如保守性置换)的氨基酸序列、 或与seq id no:275-278或302-333具有95-99％同一性的序列。在另一个实施方 案中，编码的cd123结合结构域包含轻链可变区，所述轻链可变区包含对应于 seq id no:478、480、483或485的轻链可变区的氨基酸序列、或seq idno:478、480、483或485的对应部分具有至少一个、两个或三个修饰(例如置 换，例如保守性置换)但不超过30、20或10个修饰(例如置换，例如保守性置 换)的氨基酸序列、或与seq id no:478、480、483或485的对应部分具有95-99％ 同一性的序列。
[0018]
在一个实施方案中，编码scfv的核酸分子包含选自seq id no：479、481、 482、484的核苷酸序列或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中， 核酸分子包含编码重链可变区和/或轻链可变区的核苷酸序列，其中所述核苷酸 序列包含选自seq id no：479、481、482和484的核苷酸序列的部分、或与其 具有95-99％同一性的序列，它们对应于重链可变区和/或轻链可变区。在一个实 施方案中，核酸分子包含编码重链可变区和/或轻链可变区的核苷酸序列，其中 编码的氨基酸序列选自seq id no：157-160、或与其具有95-99％同一性的序列。 在一个实施方案中，核酸分子编码scfv，其包含选自seq id no：184-215的氨 基酸序列、或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，核酸分子包 含编码重链可变区和/或轻链可变区的序列，其中编码的氨基酸序列选自seq idno：184-215或与其具有95-99％同一性的序列。
[0019]
在一个实施方案中，编码的cd123结合结构域包含(gly4-ser)n接头，其中n 是1、2、3、4、5或6、优选地3或4(seq id no:26)。scfv的轻链可变区和重链 可变区可以例如处于以下任何取向：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区
ꢀ-
接头-轻链可变区。
[0020]
在一个实施方案中，编码的car包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包含蛋 白质(例如，本文所述的蛋白质，例如选自t细胞受体的α、β或ζ链、cd28、cd3ε、 cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、 cd86、cd134、cd137和cd154的蛋白质)的跨膜结构域。在一个实施方案中， 编码的跨膜结构域包含seq id no:6的序列。在一个实施方案中，编码的跨膜 结构域包含了包含seq id no:6的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、 但不多于20、10或5个修饰的氨基酸序列、或与seq id no:6的氨基酸序列具有 95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，编码跨膜结构域的核酸序列包含 seq id no:17的核苷酸序列或与其具有95-99％同一性的序列。
[0021]
在一个实施方案中，编码的cd123结合结构域通过铰链区(例如，本文所述 的铰链区)与跨膜结构域连接。在一个实施方案中，编码的铰链区包含seq idno:2或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，编码铰链区的核 酸序列包含seq id no:13的核苷酸序列或与其具有95-99％同一性的序列。
[0022]
在一个实施方案中，分离的核酸分子还包含了编码共刺激结构域(例如，本 文所述的共刺激结构域)的序列。在实施方案中，胞内信号结构域包含共刺激结 构域。在实施方案中，胞内信号结构域包含初级信号结构域。在实施方案中， 胞内信号结构域包含共刺激结构域和初级信号结构域。
[0023]
在一个实施方案中，编码的共刺激结构域是来自例如本文所述的蛋白质， 例如选自以下的蛋白质的功能性信号结构域：mhc i类分子、tnf受体蛋白、 免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、淋巴细胞活化信号分子(slam 蛋白)、活化nk细胞受体、btla、toll配体受体、ox40、cd2、cd7、cd27、 cd28、cd30、cd40、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、4-1bb(cd137)、 b7-h3、cds、icam-1、icos(cd278)、gitr、baffr、light、hvem (lightr)、kirds2、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、 cd19、cd4、cd8α、cd8β、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga4、vla1、cd49a、 itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、 cd103、itgal、cd11a、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、 cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、nkg2d、nkg2c、tnfr2、 trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96 (tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100 (sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、ly108)、slam(slamf1、cd150、 ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、 pag/cbp、cd19a和与cd83特异性结合的配体。
[0024]
在一个实施方案中，编码的4-1bb共刺激结构域包含seq id no:7的氨基 酸序列。在一个实施方案中，编码的共刺激结构域包含了具有seq id no:7的 氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不多于20、10或5个修饰的氨基酸 序列或与seq id no:7的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方 案中，编码共刺激结构域的核酸序列包含seq id no:18的核苷酸序列或与其具 有95-99％同一性的序列。在另一个实施方案中，编码的cd28共刺激结构域包含 seq id no:43的氨基酸序列。在一个实施方案中，编码的共刺激结构域包含了 具有seq id no:43的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不多于20、 10或5个修饰的氨基酸序列或与seq id no:43的氨基酸序列具有95-99％同一 性的序列。在一个实施方案中，编码cd28共刺激结构域的核酸序列包含seq idno:44的核苷酸序列或与其具有95-99％同一性的序列。在另一个实施方案中， 编码的cd27共刺激结构域包含seq id no:8的氨基酸序列。在一个实施方案 中，编码的共刺激结构域包含了具有seq id no:8的氨基酸序列的至少一个、 两个或三个修饰、但不多于20、10或5个修饰的氨基酸序列或与seq id no:8 的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，编码cd27共刺激 结构域的核酸序列包含seq id no:19的核苷酸序列或与其具有95-99％同一性 的序列。在另一个实施方案中，编码的icos共刺激结构域包含seq id no:45 的氨基酸序列。在一个实施方案中，编码的icos共刺激结构域包含了具有seqid no:45的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不多于20、10或5个 修饰的氨基酸序列或与seq id no:45的氨基酸序列具有95-99％同一性的序 列。在一个实施方案中，编码icos共刺激结构域的核酸序列包含seq id no:46 的核苷酸序列或与其具有95-99％同一性的序列。
[0025]
在一个实施方案中，分离的核酸分子进一步包含编码胞内信号结构域的序 列，例如编码如文中所述的胞内信号结构域。
[0026]
在一些实施方案中，编码的初级信号结构域包含cd3ζ的功能性信号结构 域。在实施方案中，cd3ζ的功能性信号结构域包含seq id no:9(突变体cd3ζ) 或seq id no:10(野生型人cd3ζ)的氨基酸序列或与其具有95-99％同一性的序 列。
[0027]
在一个实施方案中，编码的胞内信号结构域包含4-1bb的功能性信号结构域 和/或cd3ζ的功能性信号结构域。在一个实施方案中，编码的4-1bb胞内信号结 构域包含seq id no:7的序列和/或seq id no:9或seq id no:10的cd3ζ氨 基酸序列。在一个实施方案中，胞内信号结构域包含了具有seq id no:7的氨 基酸序列和/或seq id no:9或seq id no:10的氨基酸序列至少一个、两个或 三个修饰、但不多于20、10或5个修饰的氨基酸序列或与seq id no:7的氨基酸 序列和/或seq id no:9或seq id no:10的氨基酸序列具有95-99％同一性的 序列。在一个实施方案中，编码的胞内信号结构域包含seq id no:7的序列和 seq id no:9或seq id no:10的序列，其中包含胞内信号结构域的序列在相 同读框中并作为单条多肽链表达。在一个实施方案中，编码胞内信号结构域的 核酸序列包含seq id no:18的核苷酸序列或与其具有95-99％同一性的序列、 和/或seq id no:20或seq id no:21的cd3ζ核苷酸序列或与其具有95-99％同 一性的序列。
[0028]
在一个实施方案中，编码的胞内信号结构域包含cd27的功能性信号结构域 和/或cd3ζ的功能性信号结构域。在一个实施方案中，编码的cd27胞内信号结 构域包含seq id no:8的氨基酸序列和/或seq id no:9或seq id no:10的 cd3ζ氨基酸序列。在一个实施方案中，胞内信号结构域包含了具有seq id no: 8的氨基酸序列和/或seq id no:9或seq id no:10的氨基酸序列至少一个、两 个或三个修饰、但不多于20、10或5个修饰的氨基酸序列或与seq id no:8的氨 基酸序列和/或seq id no:9或seq id no:10的氨基酸序列具有95-99％同一 性的序列。在一个实施方案中，编码的胞内信号结构域包含seq id no:8的序 列和seq id no:9或seq id no:10的序列，其中包含胞内信号结构域的序列 在相同读框中并作为单条多肽链表达。在一个实施方案中，编码cd27胞内信号 结构域的核酸序列包含seq id no:19的核苷酸序列或与其具有95-99％同一性 的序列、和/或seq id no:20或seq id no:21的cd3ζ核苷酸序列或与其具有 95-99％同一性的序列。
[0029]
在一个实施方案中，编码的胞内信号结构域包含cd28的功能性信号结构域 和/或cd3ζ的功能性信号结构域。在一个实施方案中，编码的cd28胞内信号结 构域包含seq id no:43的氨基酸序列和/或seq id no:9或seq id no:10的 cd3ζ氨基酸序列。在一个实施方案中，胞内信号结构域包含了具有seq id no: 43的氨基酸序列和/或seq id no:9或seq id no:10的氨基酸序列至少一个、 两个或三个修饰、但不多于20、10或5个修饰的氨基酸序列或与seq id no:43 的氨基酸序列和/或seq id no:9或seq id no:10的氨基酸序列具有95-99％ 同一性的序列。在一个实施方案中，编码的胞内信号结构域包含seq id no:43 的序列和seq id no:9或seq id no:10的序列，其中包含胞内信号结构域的 序列在相同读框中并作为单条多肽链表达。在一个实施方案中，编码cd28胞内 信号结构域的核酸序列包含seq id no:44的核苷酸序列或与其具有95-99％同 一性的序列、和/或seq id no:20或seq id no:21的cd3ζ核苷酸序列或与其 具有95-99％同一性的序列。
[0030]
在一个实施方案中，编码的胞内信号结构域包含icos的功能性信号结构域 和/或
cd3ζ的功能性信号结构域。在一个实施方案中，编码的icos胞内信号结 构域包含seq id no:45的氨基酸序列和/或seq id no:9或seq id no:10的 cd3ζ氨基酸序列。在一个实施方案中，胞内信号结构域包含了具有seq id no: 45的氨基酸序列和/或seq id no:9或seq id no:10的氨基酸序列至少一个、 两个或三个修饰、但不多于20、10或5个修饰的氨基酸序列或与seq id no:45 的氨基酸序列和/或seq id no:9或seq id no:10的氨基酸序列具有95-99％ 同一性的序列。在一个实施方案中，编码的胞内信号结构域包含seq id no:45 的序列和seq id no:9或seq id no:10的序列，其中包含胞内信号结构域的 序列在相同读框中并作为单条多肽链表达。在一个实施方案中，编码icos胞内 信号结构域的核酸序列包含seq id no:46的核苷酸序列或与其具有95-99％同 一性的序列、和/或seq id no:20或seq id no:21的cd3ζ核苷酸序列或与其 具有95-99％同一性的序列。
[0031]
在另一个方面，本发明涉及编码car构建体的分离核酸分子，所述car构 建体包含前导序列，例如，本文所述的前导序列，例如，seq id no:1的氨基 酸序列；本文所述的cd123结合结构域，例如，包含本文所述的lc cdr1、lc cdr2、lc cdr3、hc cdr1、hc cdr2和hc cdr3的cd123结合结构域， 例如，表2、6或表9中描述的人或人源化cd123结合结构域)，或与其具有95-99％ 同一性的序列；本文所述的铰链区，例如，包含seq id no:2的氨基酸序列的 铰链区；本文所述的跨膜结构域，例如，包含seq id no:6的氨基酸序列的跨 膜结构域；和胞内信号结构域，例如，本文所述的胞内信号结构域。在一个实 施方案中，编码的胞内信号结构域包含共刺激结构域，例如，本文所述的共刺 激结构域(例如，包含seq id no.:7的氨基酸序列的4-1bb共刺激结构域或包含 seq id no:8的氨基酸序列的cd27共刺激结构域)，和/或初级信号结构域，例 如，本文所述的初级信号结构域，(例如，包含seq id no:9或seq id no:10 的序列的cd3ζ刺激结构域)。在一个实施方案中，编码car构建体的分离核酸 分子包括由seq id no:12的核酸序列编码的前导序列或与其具有95-99％同一 性的序列。
[0032]
在一个实施方案中，分离的核酸分子包含这样的核酸(例如，由其组成)，所 述核酸编码seq id no:98,seq id no:99,seq id no:100,seq id no:101, seq id no:125,seq id no:126,seq id no:127,seq id no:128,seq idno:129,seq id no:130,seq id no:131,seq id no:132,seq id no:133, seq id no:134,seq id no:135,seq id no:136,seq id no:137,seq idno:138,seq id no:139,seq id no:140,seq id no:141,seq id no:142, seq id no:143,seq id no:144,seq id no:145,seq id no:146,seq idno:147,seq id no:148,seq id no:149,seq id no:150,seq id no:151, seq id no:152,seq id no:153,seq id no:154,seq id no:155或seqid no:156的car氨基酸序列；或具有seq id no:98,seq id no:99,seq idno:100,seq id no:101,seq id no:125,seq id no:126,seq id no:127, seq id no:128,seq id no:129,seq id no:130,seq id no:131,seq idno:132,seq id no:133,seq id no:134,seq id no:135,seq id no:136, seq id no:137,seq id no:138,seq id no:139,seq id no:140,seq idno:141,seq id no:142,seq id no:143,seq id no:144,seq id no:145, seq id no:146,seq id no:147,seq id no:148,seq id no:149,seq idno:150,seq id no:151,seq id no:152,seq id no:153,seq id no:154, seq id no:155或seq id no:156的一个、两个或三个修饰(例如置换，例如， 保守性置换)、但不多于30、20或10个修饰(例如置换，例如，保守性置换)的
氨 基酸；或与seq id no:98,seq id no:99,seq id no:100,seq id no:101, seq id no:125,seq id no:126,seq id no:127,seq id no:128,seq idno:129,seq id no:130,seq id no:131,seq id no:132,seq id no:133, seq id no:134,seq id no:135,seq id no:136,seq id no:137,seq idno:138,seq id no:139,seq id no:140,seq id no:141,seq id no:142, seq id no:143,seq id no:144,seq id no:145,seq id no:146,seq idno:147,seq id no:148,seq id no:149,seq id no:150,seq id no:151, seq id no:152,seq id no:153,seq id no:154,seq id no:155或seq id no:156的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同 一性的氨基酸序列。
[0033]
在一个实施方案中，分离的核酸分子包含(例如，由以下组成)seq id no:39, seq id no:40,seq id no:41,seq id no:42,seq id no:66,seq id no:67, seq id no:68,seq id no:69,seq id no:70,seq id no:71,seq id no:72, seq id no:73,seq id no:74,seq id no:75,seq id no:76,seq id no:77, seq id no:78,seq id no:79,seq id no:80,seq id no:81,seq id no:82, seq id no:83,seq id no:84,seq id no:85,seq id no:86,seq id no:87, seq id no:88,seq id no:89,seq id no:90,seq id no:91,seq id no:92, seq id no:93,seq id no:94,seq id no:95,seq id no:96或seq idno:97的核酸序列或与seq id no:39,seq id no:40,seq id no:41,seq idno:42,seq id no:66,seq id no:67,seq id no:68,seq id no:69,seqid no:70,seq id no:71,seq id no:72,seq id no:73,seq id no:74, seq id no:75,seq id no:76,seq id no:77,seq id no:78,seq id no:79, seq id no:80,seq id no:81,seq id no:82,seq id no:83,seq id no:84, seq id no:85,seq id no:86,seq id no:87,seq id no:88,seq id no:89, seq id no:90,seq id no:91,seq id no:92,seq id no:93,seq id no:94, seq id no:95,seq id no:96或seq id no:97的核酸序列具有85％、90％、 95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
[0034]
在一个方面，本发明涉及编码cd123结合结构域的分离核酸分子，其中 cd123结合结构域包含本文所述的cd123结合结构域的一个或多个(例如，全部 三个)轻链互补决定区1(lc cdr1)、轻链互补决定区2(lc cdr2)和轻链互补决 定区3(lc cdr3)、和/或本文所述的cd123结合结构域的一个或多个(例如，全 部三个)重链互补决定区1(hc cdr1)、重链互补决定区2(hc cdr2)和重链互 补决定区3(hc cdr3)，例如，包含一个或多个(例如，全部三个)lc cdr和一 个或多个(例如，全部三个)hc cdr的人或人源化cd123结合结构域。
[0035]
在其他实施方案中，编码的cd123结合结构域包含表2、6或表9中列出的任 何cd123重链结合结构域氨基酸序列的hc cdr1、hc cdr2和hc cdr3。在 实施方案中，cd123结合结构域还包含lc cdr1、lc cdr2和lc cdr3。在 实施方案中，cd123结合结构域包含表2、6或表9中列出的任何cd123轻链结合 结构域氨基酸序列的lc cdr1、lc cdr2和lc cdr3。
[0036]
在一些实施方案中，编码的cd123结合结构域包含了表2、6或表9中列出的 任何cd123轻链结合结构域氨基酸序列的lc cdr1、lc cdr2和lc cdr3中 的一者、两者或全部以及表2、6或表9中列出的任何cd123重链结合结构域氨基 酸序列的hc cdr1、hc cdr2和hc cdr3中的一者、两者或全部。
[0037]
在一个实施方案中，编码的cd123结合结构域包含本文(例如，seq id no: 275-278或302-333中)所述的轻链可变区和/或本文(例如，seq id no:216-219 或243-274中)
所述的重链可变区。在一个实施方案中，编码的cd123结合结构域 是包含seq id no:157-160、184-215、478、480、483或485的氨基酸序列的轻 链和重链的scfv。在一个实施方案中，cd123结合结构域(例如，scfv)包含：轻 链可变区，所述轻链可变区包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一 个、两个或三个在seq id no:275-278或302-333中提供的轻链可变区的氨基酸 序列的修饰(例如置换，例如，保守性置换)，但不多于30、20或10个修饰(例如 置换)，或包含与seq id no:275-278或302-333的氨基酸序列具有95-99％同一 性的序列；和/或重链可变区，所述重链可变区包含下述氨基酸序列，所述氨基 酸序列具有至少一个、两个或三个在seq id no:216-219或243-274中提供的重 链可变区的氨基酸序列的修饰(例如置换，例如，保守性置换)，但不多于30、20 或10个修饰(例如置换，例如，保守性置换)，或包含与seq id no:216-219或 243-274的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
[0038]
在一个实施方案中，编码的cd123结合结构域包含选自seq id no:157, seq id no:158,seq id no:159,seq id no:160,seq id no:184,seq idno:185,seq id no:186,seq id no:187,seq id no:188,seq id no:189, seq id no:190,seq id no:191,seq id no:192,seq id no:193,seq idno:194,seq id no:195,seq id no:196,seq id no:197,seq id no:198, seq id no:199,seq id no:200,seq id no:201,seq id no:202,seq idno:203,seq id no:204,seq id no:205,seq id no:206,seq id no:207, seq id no:208,seq id no:209,seq id no:210,seq id no:211,seq idno:212,seq id no:213,seq id no:214,seq id no:215,seq id no:478, seq id no:480,seq id no:483和seq id no:485的氨基酸序列或与其具有 95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，编码的cd123结合结构域是scfv， 并且包含本文(例如，表2、6或9中)所述的氨基酸序列的轻链可变区经接头(例如， 本文所述的接头)与包含本文(例如，表2、6或9中)所述的氨基酸序列的重链可变 区连接。在一个实施方案中，编码的cd123结合结构域包含(gly4-ser)n接头， 其中n是1、2、3、4、5或6、优选地4(seq id no:26)。scfv的轻链可变区和重 链可变区可以例如处于以下任何取向：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变 区-接头-轻链可变区。
[0039]
多肽
[0040]
在另一个方面，本发明涉及由核酸分子编码的分离的多肽分子。在一个实 施方案中，分离的多肽分子包含选自seq id no:98,seq id no:99,seq idno:100,seq id no:101,seq id no:125,seq id no:126,seq id no:127, seq id no:128,seq id no:129,seq id no:130,seq id no:131,seq idno:132,seq id no:133,seq id no:134,seq id no:135,seq id no:136, seq id no:137,seq id no:138,seq id no:139,seq id no:140,seq idno:141,seq id no:142,seq id no:143,seq id no:144,seq id no:145, seq id no:146,seq id no:147,seq id no:148,seq id no:149,seq idno:150,seq id no:151,seq id no:152,seq id no:153,seq id no:154, seq id no:155,和seq id no:156的序列、或任意上述序列的具有至少一个、 两个或三个修饰(例如置换，例如，保守性置换)但是不超过30、20、或10个 修饰(例如置换，例如，保守性置换)的氨基酸序列、或与任意上述序列具有 95-99％同一性的序列。
[0041]
在另一个方面，本发明涉及分离的嵌合抗原受体(car)分子(例如，多肽)， 其包含cd123结合结构域(例如，与cd123特异性结合的人或人源化抗体或抗体 片段)、跨膜结构域
和胞内信号结构域(例如，包含共刺激结构域和/或初级信号 结构域的胞内信号结构域)。在一个实施方案中，该car包含抗体或抗体片段， 所述抗体或抗体片段包括本文所述的cd123结合结构域(例如，如本文所述的与 cd123特异性结合的人或人源化抗体或抗体片段)、本文所述的跨膜结构域和本 文所述的胞内信号结构域(例如，包含本文所述的共刺激结构域和/或初级信号结 构域的胞内信号结构域)。
[0042]
在一个实施方案中，cd123结合结构域包含本文所述的cd123结合结构域 的一个或多个(例如，全部三个)轻链互补决定区1(lc cdr1)、轻链互补决定区 2(lc cdr2)和轻链互补决定区3(lc cdr3)、和/或本文所述的cd123结合结构 域的一个或多个(例如，全部三个)重链互补决定区1(hc cdr1)、重链互补决定 区2(hc cdr2)和重链互补决定区3(hc cdr3)，例如，包含一个或多个(例如， 全部三个)lc cdr和一个或多个(例如，全部三个)hc cdr的cd123结合结构 域。在一个实施方案中，cd123结合结构域包含本文(例如，表2、6或9中)所述 的轻链可变区和/或本文(例如，表2、6或表9中)所述的重链可变区。在一个实施 方案中，cd123结合结构域是包含表2、6或表9中列出的氨基酸序列的轻链和重 链的scfv。在一个实施方案中，cd123结合结构域(例如，scfv)包含：轻链可变 区，所述轻链可变区包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一个、两 个或三个在表2、6或表9中提供的轻链可变区的氨基酸序列的修饰(例如置换， 例如，保守性置换)，但不多于30、20或10个修饰(例如置换，例如，保守性置换)， 或包含与表2、6或表9中提供的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重 链可变区，所述重链可变区包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一 个、两个或三个在表2、6或表9中提供的重链可变区的氨基酸序列的修饰(例如 置换，例如，保守性置换)，但不多于30、20或10个修饰(例如置换，例如，保守 性置换)，或包含与表2、6或表9中提供的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
[0043]
在其他实施方案中，cd123结合结构域包含表2、6或表9中提供的任何 cd123重链结合结构域氨基酸序列的hc cdr1、hc cdr2和hc cdr3。在实 施方案中，cd123结合结构域还包含lc cdr1、lc cdr2和lc cdr3。在实 施方案中，cd123结合结构域包含表2、6或表9中列出的任何cd123轻链结合结 构域氨基酸序列的lc cdr1、lc cdr2和lc cdr3。
[0044]
在一些实施方案中，cd123结合结构域包含表2、6或表9中列出的任何 cd123轻链结合结构域氨基酸序列的lc cdr1、lc cdr2和lc cdr3中的一 者、两者或全部以及表2、6或表9中列出的任何cd123重链结合结构域氨基酸序 列的hc cdr1、hc cdr2和hc cdr3中的一者、两者或全部。
[0045]
在一个实施方案中，cd123结合结构域包含选自seq id no:157,seq idno:158,seq id no:159,seq id no:160,seq id no:184,seq id no:185, seq id no:186,seq id no:187,seq id no:188,seq id no:189,seq idno:190,seq id no:191,seq id no:192,seq id no:193,seq id no:194, seq id no:195,seq id no:196,seq id no:197,seq id no:198,seq idno:199,seq id no:200,seq id no:201,seq id no:202,seq id no:203, seq id no:204,seq id no:205,seq id no:206,seq id no:207,seq idno:208,seq id no:209,seq id no:210,seq id no:211,seq id no:212, seq id no:213,seq id no:214,seq id no:215,seq id no:478,seq idno:480,seq id no:483和seq id no:485的氨基酸序列；或相对于前述序列任 一者具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如，保守性置换)、但不多于 30、20或10个修饰(例如置换，例如，保守性置换)的氨基酸序列；或
与其具有 95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，cd123结合结构域是scfv，并且包 含本文(例如，表2、6或表9中)所述的氨基酸序列的轻链可变区经接头(例如，本 文所述的接头)与包含本文(例如，表2、6或表9中)所述的氨基酸序列的重链可变 区连接。在一个实施方案中，cd123结合结构域包含(gly4-ser)n接头，其中n是 1、2、3、4、5或6、优选地4(seq id no:26)。scfv的轻链可变区和重链可变 区可以例如处于以下任何取向：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接 头-轻链可变区。
[0046]
在一个实施方案中，分离的car分子包含蛋白质(例如本文所述的蛋白质， 例如选自t细胞受体的α、β或ζ链、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、 cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137 和cd154)的跨膜结构域。在一个实施方案中，跨膜结构域包含seq id no:6的 序列。在一个实施方案中，跨膜结构域包含具有seq id no:6的氨基酸序列的 至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如，保守性置换)、但不多于20、10 或5个修饰(例如置换，例如，保守性置换)的氨基酸序列或与seq id no:6的氨 基酸序列具有95-99％同一性的序列。
[0047]
在一个实施方案中，cd123结合结构域通过铰链区(例如，本文所述的铰链 区)与跨膜结构域连接。在一个实施方案中，编码的铰链区包含seq id no:2或 与其具有95-99％同一性的序列。
[0048]
在一个实施方案中，分离的car分子还包含编码共刺激结构域(例如，本文 所述的共刺激结构域)的序列。
[0049]
在一些实施方案中，分离的car分子的胞内信号结构域包含共刺激结构域。 在实施方案中，分离的car分子的胞内信号结构域包含初级信号结构域。在实 施方案中，分离的car分子的胞内信号结构域包含共刺激结构域和初级信号结 构域。
[0050]
在一个实施方案中，共刺激结构域包含蛋白质的功能性信号结构域，所述 蛋白质选自：mhc i类分子、tnf受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子 受体、整联蛋白、淋巴细胞活化信号分子(slam蛋白)、活化nk细胞受体、btla、 toll配体受体、ox40、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cds、icam-1、 lfa-1(cd11a/cd18)、4-1bb(cd137)、b7-h3、cds、icam-1、icos(cd278)、 gitr、baffr、light、hvem(lightr)、kirds2、slamf7、nkp80 (klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il2rβ、 il2rγ、il7rα、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、 vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11a、lfa-1、 itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、 itgb7、nkg2d、nkg2c、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、 slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9 (cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、 ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg (cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、cd19a和与cd83特异 性结合的配体。
[0051]
在一个实施方案中，4-1bb共刺激结构域包含seq id no:7的序列。在一 个实施方案中，共刺激结构域包含具有seq id no:7的氨基酸序列的至少一个、 两个或三个修饰(例如置换，例如，保守性置换)、但不多于20、10或5个修饰(例 如置换，例如，保守性置换)的氨基酸序列或与seq id no:7的氨基酸序列具有 95-99％同一性的序列。在另一个实施方案中，cd28共刺激结构域包含seq idno:43的氨基酸序列。在一个实施方案中，该共刺激结构域包含了具有seq idno:43的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不多于20、10或
5个修饰 的氨基酸序列或与seq id no:43的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在 另一个实施方案中，cd27共刺激结构域包含seq id no:8的氨基酸序列。在一 个实施方案中，该共刺激结构域包含了具有seq id no:8的氨基酸序列的至少 一个、两个或三个修饰、但不多于20、10或5个修饰的氨基酸序列或与seq id no: 8的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在另一个实施方案中，icos的共刺 激结构域包含seq id no:45的氨基酸序列。在一个实施方案中，该共刺激结构 域包含具有seq id no:45的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不多 于20、10或5个修饰的氨基酸序列或与seq id no:45的氨基酸序列具有95-99％ 同一性的序列。
[0052]
在实施方案中，初级信号结构域包含cd3ζ的功能性信号结构域。在实施方 案中，cd3ζ的功能性信号结构域包含seq id no:9(突变体cd3ζ)或seq id no: 10(野生型人cd3ζ)或与其具有95-99％同一性的序列。
[0053]
在一个实施方案中，胞内信号结构域包含4-1bb的功能性信号结构域和/或 cd3ζ的功能性信号结构域。在一个实施方案中，胞内信号结构域包含seq idno:7的氨基酸序列和/或seq id no:9或seq id no:10的氨基酸序列。在一个 实施方案中，胞内信号结构域包含具有seq id no:7的氨基酸序列和/或seqid no:9或seq id no:10的序列至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如， 保守性置换)、但不多于20、10或5个修饰(例如置换，例如，保守性置换)的氨基 酸序列或与seq id no:7的氨基酸序列和/或seq id no:9或seq id no:10 的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，胞内信号结构域 包含seq id no:7的氨基酸序列和/或seq id no:9或seq id no:10的氨基 酸序列，其中包含胞内信号结构域的序列在相同读框中并作为单条多肽链表达。
[0054]
在一个实施方案中，胞内信号结构域包含cd27的功能性信号结构域和/或 cd3ζ的功能性信号结构域。在一个实施方案中，cd27胞内信号结构域包含seqid no:8的氨基酸序列和/或seq id no:9或seq id no:10的cd3ζ氨基酸序 列。在一个实施方案中，胞内信号结构域包含具有seq id no:8的氨基酸序列 和/或seq id no:9或seq id no:10的氨基酸序列至少一个、两个或三个修饰、 但不多于20、10或5个修饰的氨基酸序列或与seq id no:8的氨基酸序列和/或 seq id no:9或seq id no:10的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一 个实施方案中，胞内信号结构域包含seq id no:8的序列和seq id no:9或 seq id no:10的序列，其中包含胞内信号结构域的序列在相同读框中并作为单 条多肽链表达。
[0055]
在一个实施方案中，胞内信号结构域包含cd28的功能性信号结构域和/或 cd3ζ的功能性信号结构域。在一个实施方案中，编码的cd28胞内信号结构域包 含seq id no:43的氨基酸序列和/或seq id no:9或seq id no:10的cd3ζ氨 基酸序列。在一个实施方案中，胞内信号结构域包含具有seq id no:43的氨基 酸序列和/或seq id no:9或seq id no:10的氨基酸序列至少一个、两个或三 个修饰、但不多于20、10或5个修饰的氨基酸序列或与seq id no:43的氨基酸 序列和/或seq id no:9或seq id no:10的氨基酸序列具有95-99％同一性的 序列。在一个实施方案中，胞内信号结构域包含seq id no:43的序列和seq idno:9或seq id no:10的序列，其中包含胞内信号结构域的序列在相同读框中 并作为单条多肽链表达。
[0056]
在一个实施方案中，胞内信号结构域包含icos的功能性信号结构域和/或 cd3ζ的功能性信号结构域。在一个实施方案中，icos胞内信号结构域包含seqid no:45的氨基酸
序列和/或seq id no:9或seq id no:10的cd3ζ氨基酸序 列。在一个实施方案中，胞内信号结构域包含了具有seq id no:45的氨基酸序 列和/或seq id no:9或seq id no:10的氨基酸序列至少一个、两个或三个修 饰、但不多于20、10或5个修饰的氨基酸序列或与seq id no:381的氨基酸序列 和/或seq id no:9或seq id no:10的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。 在一个实施方案中，编码的胞内信号结构域包含seq id no:45的序列和seqid no:9或seq id no:10的序列，其中包含胞内信号结构域的序列在相同读框 中并作为单条多肽链表达。
[0057]
在一个实施方案中，分离的car分子还包含前导序列(例如，本文所述的前 导序列)。在一个实施方案中，前导序列包含seq id no:1的氨基酸序列或与 seq id no:1的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
[0058]
在另一个方面，本发明涉及分离的car分子，所述分离的car分子包含前 导序列，例如，本文所述的前导序列(例如，seq id no:1的前导序列)或与其 具有95-99％同一性的前导序列；本文所述的cd123结合结构域，例如，包含本 文所述的lc cdr1、lc cdr2、lc cdr3、hc cdr1、hc cdr2和hc cdr3 的cd123结合结构域，例如，表2或6中描述的cd123结合结构域，或与其具有 95-99％同一性的序列的cd123结合结构域；铰链区，例如，本文所述的铰链区， 例如，seq id no:2的铰链区，或与其具有95-99％同一性的铰链区；跨膜结构 域，例如，本文所述的跨膜结构域，例如，具有seq id no:6的序列或与其具 有95-99％同一性的序列的跨膜结构域；胞内信号结构域，例如，本文所述的胞 内信号结构域(例如，包含共刺激结构域和/或初级信号结构域的胞内信号结构 域)。在一个实施方案中，胞内信号结构域包含共刺激结构域，例如，本文所述 的共刺激结构域，例如，具有seq id no:7的序列或与其具有95-99％同一性的 4-1bb共刺激结构域，和/或初级信号结构域(例如，本文所述的初级信号结构域， 例如，具有seq id no:9或seq id no:10的序列或与其具有95-99％同一性的 cd3ζ刺激结构域)。在一个实施方案中，胞内信号结构域包含共刺激结构域，例 如，本文所述的共刺激结构域，例如，具有seq id no:7的序列的4-1bb共刺 激结构域，和/或初级信号结构域(例如，本文所述的初级信号结构域，例如，具 有seq id no:9或seq id no:10的序列的cd3ζ刺激结构域)。
[0059]
在一个实施方案中，分离的car分子包含(例如，由以下组成)seq id no: 98,seq id no:99,seq id no:100,seq id no:101,seq id no:125,seqid no:126,seq id no:127,seq id no:128,seq id no:129,seq id no: 130,seq id no:131,seq id no:132,seq id no:133,seq id no:134, seq id no:135,seq id no:136,seq id no:137,seq id no:138,seq idno:139,seq id no:140,seq id no:141,seq id no:142,seq id no:143, seq id no:144,seq id no:145,seq id no:146,seq id no:147,seq idno:148,seq id no:149,seq id no:150,seq id no:151,seq id no:152, seq id no:153,seq id no:154,seq id no:155和seq id no:156的氨基 酸序列、或与seq id no:98,seq id no:99,seq id no:100,seq id no: 101,seq id no:125,seq id no:126,seq id no:127,seq id no:128, seq id no:129,seq id no:130,seq id no:131,seq id no:132,seq idno:133,seq id no:134,seq id no:135,seq id no:136,seq id no:137, seq id no:138,seq id no:139,seq id no:140,seq id no:141,seq idno:142,seq id no:143,seq id no:144,seq id no:145,seq id no:146, seq id no:147,seq id no:148,seq id no:
149,seq id no:150,seq idno:151,seq id no:152,seq id no:153,seq id no:154,seq id no:155 和seq id no:156的氨基酸序列具有至少1、2、3、4、5、10、15、20或30个修 饰(例如置换，例如，保守性置换)、但不多于60、50或40个修饰(例如置换，例 如，保守性置换)的氨基酸序列，或与seq id no:98,seq id no:99,seq idno:100,seq id no:101,seq id no:125,seq id no:126,seq id no:127, seq id no:128,seq id no:129,seq id no:130,seq id no:131,seq idno:132,seq id no:133,seq id no:134,seq id no:135,seq id no:136, seq id no:137,seq id no:138,seq id no:139,seq id no:140,seq idno:141,seq id no:142,seq id no:143,seq id no:144,seq id no:145, seq id no:146,seq id no:147,seq id no:148,seq id no:149,seq idno:150,seq id no:151,seq id no:152,seq id no:153,seq id no:154, seq id no:155和seq id no:156的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、 97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
[0060]
在一个方面，本发明涉及cd123结合结构域，所述cd123结合结构域包含 本文所述的cd123结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)轻链互补决定区1 (lc cdr1)、轻链互补决定区2(lc cdr2)和轻链互补决定区3(lc cdr3)、和 /或本文所述的cd123结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)重链互补决定 区1(hc cdr1)、重链互补决定区2(hc cdr2)和重链互补决定区3(hccdr3)，例如，包含一个或多个(例如，全部三个)lc cdr和一个或多个(例如， 全部三个)hc cdr(例如，根据表3、7、10或12的一个、两个或三个hc cdr； 和/或根据表4、8、11或13的一个、两个或三个lc cdr)的cd123结合结构域。
[0061]
在其他实施方案中，cd123结合结构域包含表2、6或表9中列出的任何 cd123重链结合结构域氨基酸序列的hc cdr1、hc cdr2和hc cdr3。在实 施方案中，cd123结合结构域还包含lc cdr1、lc cdr2和lc cdr3。在实 施方案中，cd123结合结构域包含表2、6或表9中列出的任何cd123轻链结合结 构域氨基酸序列的lc cdr1、lc cdr2和lc cdr3。
[0062]
在一些实施方案中，cd123结合结构域包含了表2、6或表9中列出的任何 cd123轻链结合结构域氨基酸序列的lc cdr1、lc cdr2和lc cdr3中的一 者、两者或全部以及表2、6或表9中列出的任何cd123重链结合结构域氨基酸序 列的hc cdr1、hc cdr2和hc cdr3中的一者、两者或全部。
[0063]
在一个实施方案中，cd123结合结构域包含本文(例如，seq id no:275-278 或302-333中)所述的轻链可变区和/或本文(例如，seq id no:216-219或243-274 中)所述的重链可变区。在一个实施方案中，cd123结合结构域是包含seq idno:157-160、184-215、478、480、483或485的氨基酸序列的轻链和重链的scfv。 在一个实施方案中，cd123结合结构域(例如，scfv)包含：轻链可变区，所述轻 链可变区包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一个、两个或三个在 seq id no:275-278或302-333中提供的轻链可变区的氨基酸序列的修饰(例如 置换，例如，保守性置换)，但不多于30、20或10个修饰(例如置换，例如，保守 性置换)，或包含与seq id no:275-278或302-333中的氨基酸序列具有95-99％ 同一性的序列；和/或重链可变区，所述重链可变区包含下述氨基酸序列，所述 氨基酸序列具有至少一个、两个或三个在seq id no:216-219或243-274中提供 的重链可变区的氨基酸序列的修饰(例如置换，例如，保守性置换)，但不多于30、20或10个修饰(例如置换，例如，保守性置换)，或包含与seq id no:216-219 或243-274的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
[0064]
在一个实施方案中，cd123结合结构域包含选自seq id no:157,seq idno:158,seq id no:159,seq id no:160,seq id no:184,seq id no:185, seq id no:186,seq id no:187,seq id no:188,seq id no:189,seq idno:190,seq id no:191,seq id no:192,seq id no:193,seq id no:194, seq id no:195,seq id no:196,seq id no:197,seq id no:198,seq idno:199,seq id no:200,seq id no:201,seq id no:202,seq id no:203, seq id no:204,seq id no:205,seq id no:206,seq id no:207,seq idno:208,seq id no:209,seq id no:210,seq id no:211,seq id no:212, seq id no:213,seq id no:214,seq id no:215,seq id no:478,seq idno:480,seq id no:483和seq id no:485的序列或与其具有95-99％同一性的 序列。在一个实施方案中，cd123结合结构域是scfv，并且包含本文(例如，表2、 6或表9中)所述的氨基酸序列的轻链可变区经接头(例如，本文所述的接头)与包 含本文(例如，表2、6或表9中)所述的氨基酸序列的重链可变区连接。在一个实 施方案中，cd123结合结构域包含(gly4-ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5或6、 优选地4(seq id no:26)。scfv的轻链可变区和重链可变区可以例如处于以下 任何取向：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。
[0065]
核酸、载体和细胞
[0066]
本文所述的核酸分子可以是dna分子、rna分子或其组合。在一个实施方 案中，核酸分子是编码如本文所述的car多肽的mrna。在其他实施方案中， 核酸分子是包括任何前述核酸分子的载体。
[0067]
在另一个方面，本发明涉及一种载体，所述载体包含本文所述的核酸分子， 例如，编码本文所述的car的核酸分子。在一个实施方案中，载体选自dna分 子或rna分子(例如质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体)。
[0068]
在一个实施方案中，该载体是慢病毒载体。在一个实施方案中，载体还包 含启动子。在一个实施方案中，启动子是ef-1启动子。在一个实施方案中，ef-1 启动子包含seq id no:11的序列。在另一个实施方案中，启动子是pgk启动 子，例如，如本文所述的截短的pgk启动子。
[0069]
在一个实施方案中，载体是体外转录的载体，例如，转录本文所述的核酸 分子的rna的载体。在一个实施方案中，载体中的核酸序列还包含聚腺苷酸尾， 例如，本文所述的聚腺苷酸尾，(例如，包含约150个腺苷碱基的聚腺苷酸尾(seqid no:705))。在一个实施方案中，载体中的核酸序列还包含3’utr，例如， 本文所述的3’utr，例如，包含至少一个衍生自人β-球蛋白的3’utr的重复序列 的3’utr。在一个实施方案中，载体中的核酸序列还包含启动子，例如，t2a 启动子。
[0070]
在另一个方面，本发明涉及一种细胞，所述细胞包含本文所述核酸分子或 载体、或表达car的多肽。在一个实施方案中，细胞是本文所述的细胞，例如， 免疫效应细胞(例如，人t细胞或nk细胞，例如，本文所述的人t细胞或nk细 胞，或其细胞群)。在一些实施方案中，人t细胞是cd8+t细胞。在一个实施 方案中，该细胞表达car核酸或多肽，或在某些点上表达car核酸或多肽(例 如，瞬时表达的car分子)。
[0071]
在一些实施方案中，本文所述的细胞(例如，表达car的细胞)还可以表 达另一种物质，例如，增强表达car的细胞活性的物质。例如，在一个实施方 案中，该物质可以是包含抑制性分子或其结构域的嵌合分子。抑制性分子的例 子包括pd1、pd-l1、pd-l2、ctla4、
tim3、ceacam(例如，ceacam-1、 ceacam-3和/或ceacam-5)、lag3、vista、btla、tigit、lair1、 cd160、2b4、cd80、cd86、b7-h3(cd276)、b7-h4(vtcn1)、hvem (tnfrsf14或cd270)、kir、a2ar、mhc i类、mhc ii类、gal9、腺苷 和tgfr(例如tgfrβ)，例如，如本文所述。在一个实施方案中，嵌合分子 包含第一多肽(例如，抑制性分子)，所述第一多肽与提供正向信号给细胞的第二 多肽(例如，本文所述的胞内信号结构域)缔合。在一个实施方案中，该物质包含 例如抑制性分子如pd1、pd-l1、pd-l2、ctla4、tim3、ceacam(例如， ceacam-1、ceacam-3和/或ceacam-5)、lag3、vista、btla、tigit、 lair1、cd160、2b4、cd80、cd86、b7-h3(cd276)、b7-h4(vtcn1)、hvem (tnfrsf14或cd270)、kir，a2ar、mhc i类、mhc ii类、gal9、腺苷 和tgfr(例如tgfrβ)或这些分子中任一者的片段(例如，这些分子中任一 者的胞外结构域的至少一部分)的第一多肽和作为本文所述的胞内信号结构域 (例如，包含共刺激结构域(例如，如本文所述的41bb、cd27或cd28)和/或初 级信号结构域(例如，本文所述的cd3ζ信号结构域)的第二多肽。在一个实施方 案中，该物质包含pd1或其片段(例如，pd1的胞外结构域的至少一部分)的第 一多肽和本文所述的胞内信号结构域(例如，本文所述的cd28信号结构域和/ 或本文所述的cd3ζ信号结构域)的第二多肽。
[0072]
在另一个方面，本发明涉及一种产生细胞、例如免疫效应细胞的方法，所 述方法包括用本文所述的核酸分子(例如，rna分子，例如mrna分子)，或 包含编码car(例如，本文所述的car)的核酸分子的载体引入，例如转导免疫 效应细胞。
[0073]
本发明还提供一种产生细胞群体的方法(例如，瞬时表达外源rna的rna 工程化细胞)。该方法包括将本文所述的rna(例如，体外转录的rna或合成 的rna；如本文所述编码car多肽的mrna序列)引入细胞中。在实施方案中， rna瞬时表达car多肽。在一个实施方案中，细胞是如本文所述的细胞，例如， 免疫效应细胞(例如，t细胞或nk细胞，或细胞群体)。
[0074]
治疗用途
[0075]
在另一个方面，本发明涉及一种在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫的方法，所 述方法包括向哺乳动物施用有效量的表达car分子的细胞，例如，表达本文所 述的car分子的细胞。在一个实施方案中，细胞是自体免疫效应细胞，例如， t细胞或nk细胞。在一个实施方案中，细胞是同种异体免疫效应细胞，例如， t细胞或nk细胞。在一个实施方案中，哺乳动物是人，例如，血液癌症患者。
[0076]
在另一方面，本发明涉及一种治疗患有与表达cd123相关的疾病(例如，增 生性疾病、癌前期疾病或与表达cd123相关的非癌症相关适应征)的哺乳动物的 方法。所述方法包括向哺乳动物施用有效量的表达car分子(例如，本文所述的 car分子)的细胞。在一个实施方案中，哺乳动物是人，例如，血液癌症患者。 在一个实施方案中，疾病是本文所述的疾病。在一个实施方案中，与表达cd123 相关的疾病是选自增生性疾病如癌症或恶性肿瘤；癌前期疾病如脊髓发育不良、 脊髓发育不良综合征或白血病前期；或是与表达cd123相关的非癌症相关适应 征。在一个实施方案中，疾病是血液癌症。在另一个实施方案中，所述疾病选 自一种或多种急性白血病，包括但不限于急性髓性白血病(aml)、急性淋巴 母细胞性白血病(all)、急性淋巴母细胞性b细胞白血病(b细胞急性淋巴细 胞性白血病，ball)和急性淋巴母细胞性t细胞白血病(t细胞急性淋巴细胞 性白血病(tall)；脊髓发育不良综合征；骨髓增生性肿瘤；组织细胞疾病(例 如，肥大细胞疾病或母细胞性浆细胞样树状细胞肿瘤)；肥大细胞疾病，例如 系统性肥大细胞增多症或肥大细胞白血病；慢性髓性白血病(cml)；和
浆母 细胞样树突细胞瘤。在其它实施方案中，与cd123表达相关的疾病包括但不限 于非典型性和/或非典型性癌症、恶性肿瘤、癌前病症或表达cd123的增殖性疾 病；及其组合。
[0077]
在一个实施方案中，所述疾病选自急性髓性白血病(aml)、急性淋巴母 细胞性白血病(all)、急性淋巴母细胞性b细胞白血病(b细胞急性淋巴细胞 性白血病，ball)、急性淋巴母细胞性t细胞白血病(t细胞急性淋巴细胞性 白血病，tall)、b细胞幼淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性 髓性白血病(cml)、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、肥大细胞疾病、组织细 胞疾病、脊髓发育不良综合征、骨髓增生性肿瘤、浆细胞性骨髓瘤、浆母细胞 样树突细胞瘤或其组合中的一种或多种。在一个实施方案中，所述疾病是白血 病，例如all(例如复发性和难治性all)或aml。在其他实施方案中，所述 疾病是cd19阴性癌症，例如cd19阴性复发性癌症。
[0078]
在任何前述方法的一些实施方案中，细胞，例如免疫效应细胞的群体包含 载体，例如慢病毒载体，其包含编码如本文所述的car多肽的核酸分子。
[0079]
在任何上述方法的其它实施方案中，细胞，例如免疫效应细胞的群体，包 含编码如本文所述的car多肽的mrna。在一个实施方案中，所述细胞是表达 car的rna-工程化细胞的群体，例如瞬时表达的细胞群体。
[0080]
在任何前述方法的一些实施方案中，所述方法还包括向哺乳动物(例如， 患有癌症，例如本文所述的血液癌症(例如，aml或all)的哺乳动物)施用 一个或多个剂量的细胞(例如，含有本文所述的car核酸或car多肽的免疫细 胞))。在一些实施方案中，一个或多个剂量的car细胞(例如，cd123 car 细胞)包含至少约1
×
106、5
×
106、1
×
107、2
×
107、5
×
107、1
×
108、2
×
108、 5
×
108、1
×
109、2
×
109或5
×
109个细胞。
[0081]
在一个实施方案中，施用高达10、9、8、7、6、5、4、3或2个剂量的细胞。 在其它实施方案中，向哺乳动物施用1、2、3、4、5或6个剂量的细胞，例如以 一周、两周、三周、四周或更多周的治疗间隔。在一个实施方案中，在两周内 施用多达6个剂量。剂量可以相同或不同。在一个实施方案中，开始施用较低剂 量，然后施用一个或多个较高剂量。在一个示例性实施方案中，较低剂量为约1
ꢀ×
105至1
×
109个细胞/kg、或1
×
106至1
×
108个细胞/kg；较高剂量为约2
×
105至2
ꢀ×
109个细胞/kg或2
×
106至2
×
108个细胞/kg，然后是约4
×
105至4
×
109个细胞 /kg、或4
×
106至4
×
108个细胞/kg的3-6个剂量。
[0082]
在一个实施方案中，在一种或多种淋巴细胞消耗疗法(例如淋巴细胞消耗 化疗)之后施用一个或多个剂量的细胞。在一个实施方案中，淋巴细胞消耗疗 法包括化疗(例如环磷酰胺)。
[0083]
在一个实施方案中，一个或多个剂量之后是细胞移植，例如同种异体造血 干细胞移植。例如，同种异体造血干细胞移植发生在约20至约35天之间，例如 约23至33天之间。
[0084]
在一些实施方案中，将细胞，例如免疫效应细胞的群体(例如，本文所述 的表达car分子的细胞)与如本文所述的一种或多种治疗剂或方法组合施用。
[0085]
在一个实施方案中，将细胞，例如免疫效应细胞的群体(例如，本文所述 的表达car分子的细胞)与增加表达car分子的细胞功效的试剂，例如本文所 述的试剂组合施用。
[0086]
在一个实施方案中，细胞，例如免疫效应细胞的群体(例如，本文所述的表 达car分子的细胞)与免疫增强性低剂量的mtor抑制剂组合施用。尽管不希望 受理论约束，据信用免疫增强性低剂量(例如，不足以完全抑制免疫系统，但足 以改善免疫功能的剂量)治疗
伴有pd-1阳性t细胞减少或pd-1阴性细胞增加。可 以通过与表达pd-1配体(例如，pd-l1或pd-l2)的细胞结合，消耗pd-1阳性t细 胞，但不消耗pd-1阴性t细胞。
[0087]
在一个实施方案中，这种方法可以用来优化本文所述的car细胞在受试者 中的表现。尽管不希望受理论约束，据信在一个实施方案中，改善了内源性未 修饰的免疫效应细胞(例如，t细胞)的表现。尽管不希望受理论约束，据信在一 个实施方案中，改善了表达cd123 car的细胞的表现。在其他实施方案中，可 以通过与下述量的mtor抑制剂接触，离体处理已经工程化或将会工程化以表 达car的细胞(例如，t细胞)，所述量增加pd1阴性免疫效应细胞(例如，t细胞 或nk细胞)的数目或增加pd1阴性免疫效应细胞(例如，t细胞或nk细胞)/pd1 阳性免疫效应细胞(例如，t细胞或nk细胞)的比率。
[0088]
在一个实施方案中，在施用本文所述的表达car的细胞(例如，t细胞或nk 细胞)之前，启动免疫增强性低剂量的mtor抑制剂(例如，变构抑制剂(例如， rad001)或催化性抑制剂)的施用。在一个实施方案中，在足够时间的mtor抑 制剂或充分给予mtor抑制剂后施用car细胞，从而pd1阴性免疫效应细胞(例 如，t细胞)的水平或pd1阴性免疫效应细胞(例如，t细胞或nk细胞)/pd1阳性免 疫效应细胞(例如，t细胞或nk细胞)的比率已经至少一过性增加。
[0089]
在一个实施方案中，在足够时间或在充分给予免疫增强性低剂量的mtor 抑制剂后收获待工程化以表达car的细胞，例如，免疫效应细胞(例如，t细胞 或nk细胞)，从而受试者中的或从受试者收获的pd1阴性免疫效应细胞(例如，t 细胞或nk细胞)的水平或pd1阴性免疫效应细胞(例如，t细胞或nk细胞)/pd1 阳性免疫效应细胞(例如，t细胞或nk细胞)的比率已经至少一过性增加。
[0090]
在一个实施方案中，本发明提供mtor抑制剂用于治疗受试者，其中所述 mtor抑制剂增强所述受试者的免疫应答，并且其中所述受试者已经接受、正 在接受或将要接受表达如本文所述的cd123 car的免疫效应细胞。
[0091]
在另一个实施方案中，细胞，例如免疫效应细胞的群体(例如表达本文所 述的car分子的细胞)与改善一种或多种副作用的物质(例如，本文所述的物质) 组合施用，其中所述副作用与施用表达car分子的细胞相关。
[0092]
在一个实施方案中，细胞，例如免疫效应细胞的群体(例如表达本文所述 的car分子的细胞)与治疗cd123相关疾病的物质(例如，本文所述的物质)组合 施用。
[0093]
在一个实施方案中，将细胞，例如免疫效应细胞的群体(例如，表达本文 所述的car分子的细胞)与选自以下的一种或多种第二治疗剂或方法组合施用： 化疗、靶向抗癌治疗、溶瘤药物、细胞毒性剂、细胞因子、外科手术、放射方 法、共刺激分子的激动剂、免疫检查点分子的抑制剂、疫苗或第二基于car的 免疫治疗。
[0094]
在一个实施方案中，将细胞，例如免疫效应细胞的群体(例如，表达本文 所述的car分子的细胞)与共刺激分子的激动剂组合施用，例如选自以下的一 种或多种的共刺激分子的激动剂：mhc i类分子、tnf受体蛋白、免疫球蛋白 样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、淋巴细胞活化信号分子(slam蛋白)、 活化nk细胞受体、btla、toll配体受体、ox40、cd2、cd7、cd27、cd28、 cd30、cd40、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、4-1bb(cd137)、b7-h3、 cds、icam-1、icos(cd278)、gitr、baffr、light、hvem(lightr)、 kirds2、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd19、cd4、 cd8α、cd8β、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga4、vla1、
cd49a、itga4、 ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、 itgal、cd11a、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、 itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、nkg2d、nkg2c、tnfr2、trance/rankl、 dnam1(cd226)、slamf4(cd244,2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、 crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、 slamf6(ntb-a,ly108)、slam(slamf1,cd150,ipo-3)、blame (slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、 cd19a和特异性地结合cd83的配体。
[0095]
在其他实施方案中，将细胞，例如免疫效应细胞的群体(例如，表达本文 所述的car分子的细胞)与免疫检查点分子的抑制剂组合施用，所述免疫检查 点分子的抑制剂选自pd1、pd-l1、pd-l2、ctla4、tim3、ceacam(例如, ceacam-1,ceacam-3和/或ceacam-5)、lag3、vista、btla、tigit、 lair1、cd160、2b4、cd80、cd86、b7-h3(cd276)、b7-h4(vtcn1)、hvem (tnfrsf14或cd270)、kir、a2ar、i类mhc、ii类mhc、gal9、腺苷、tgfr (例如tgfrβ)或其组合中的一种或多种。
[0096]
在一个实施方案中，免疫检查点分子的抑制剂或共刺激分子的激动剂是抗 体分子，例如单特异性抗体分子或双特异性抗体分子。例如，细胞，例如免疫 效应细胞的群体，可以与pd-1抑制剂、tim-3抑制剂、ceacam-1抑制剂或其 组合组合地施用。在一个实施方案中，pd-1抑制剂和tim-3抑制剂组合施用。 在其他实施方案中，tim-3抑制剂和ceacam-1抑制剂组合施用。
[0097]
在一些实施方案中，免疫检查点分子的抑制剂在施用细胞例如免疫效应细 胞的群体之后施用，例如在施用细胞(例如免疫效应细胞的群体)约3-7天后施 用。
[0098]
如本文实施例中所述，表达car123的免疫效应细胞已显示对cd19阴性复 发(例如cd19阴性b-all)的有效治疗。不受理论的束缚，car123和cd19 抑制的组合方法(例如表达car19的免疫效应细胞)可用于治疗cd19阳性疾病， 同时阻止或预防抗原缺失复发。
[0099]
因此，在任何上述方法的其他实施方案中，细胞，例如免疫效应细胞的群 体与cd19抑制剂(例如本文所述的cd19抑制剂)组合施用。
[0100]
在一些实施方案中，cd19抑制剂是cd19 car表达的细胞或抗cd19抗体分 子。在一个实施方案中，疾病是白血病，例如all(例如复发性和难治性all)。 在其他实施方案中，疾病是aml。在其他实施方案中，疾病是cd19阴性癌症， 例如cd19阴性复发性癌症。
[0101]
备选地或与任何上述方法组合，提供了在哺乳动物(例如人)中预防cd19 阴性复发的方法。该方法包括施用有效量的细胞，例如免疫效应细胞的群体(例 如，表达本文所述的car分子的细胞)。在一些实施方案中，方法还包括施用 cd19抑制剂，例如cd19 car表达的细胞。在一些实施方案中，疾病是白血病， 例如急性淋巴母细胞性白血病(例如复发性和难治性all)或aml。
[0102]
在一些实施方案中，在施用cd19抑制剂之前、同时或一同、或之后施用细 胞，例如免疫效应细胞的群体。在一个实施方案中，在施用cd19之后施用细胞， 例如免疫效应细胞的群体。在其他实施方案中，细胞(例如免疫效应细胞的群 体)与cd19抑制剂同时施用。
[0103]
在一些实施方案中，细胞(例如免疫效应细胞的群体)表达cd19 car和 cd123 car(例如本文所述的car)。
[0104]
不希望受理论束缚，已经发现某些白血病细胞(例如，b-all母细胞)共 表达cd19和cd123，而造血干细胞(hsc)通常是cd123阳性(cd123+)、 但cd19阴性的(cd19-)。为了靶
向共表达cd19和cd123的白血病细胞(例如， b-all母细胞)，同时不影响hsc，可以使用分拆的car，其中功能性胞内结 构域在car19和car123之间是分开的。当靶细胞共表达cd19和cd123(例如， b-all母细胞)时，与表达cd19或cd123之一的细胞(例如hsc)相反，这种 car分子将优先引起免疫细胞的完全激活。
[0105]
因此，在一些实施方案中，cd19 car或cd123 car包含分开的胞内信号 结构域，使得与cd19 car和cd123 car结合表达cd19或cd123之一的靶细胞 (例如，造血干细胞)时的活化相比，当cd19 car和cd123 car都结合靶细 胞时，发生细胞(例如免疫效应细胞的群体)的完全激活，例如靶cd19+cd123+ 细胞(例如，b-all母细胞)。在一个实施方案中，cd123 car包含共刺激结 构域，例如4-1bb信号结构域，并且cd19 car包含初级信号结构域，例如cd3 ζ信号结构域。在其他实施方案中，cd123 car包含包含初级信号结构域，例 如cd3ζ信号结构域，以及cd19 car包含共刺激结构域，例如4-1bb信号结构 域。cd123 car和cd19 car可以任选地连接到例如一个或多个肽切割位点， 例如p2a。
[0106]
在其他实施方案中，本文公开的方法还包括在用细胞(例如，如本文所述 的免疫效应细胞)治疗后施用t细胞消耗剂，从而减少(例如，消耗)car表 达细胞(例如，cd123 car表达细胞)。此类t细胞消耗剂可用于有效消耗car 表达细胞(例如，表达cd123car的细胞)以减轻毒性。
[0107]
例如，备选地或与本文公开的方法组合，公开了在car治疗(例如，本文 公开的car123治疗)后减少(例如，消耗)car表达细胞的方法。该方法包 括向哺乳动物施用减少(例如，消耗)car表达细胞的量的t细胞消耗剂。在 一些实施方案中，在用细胞例如免疫效应细胞的群体(例如，表达car的细胞 群体)处理哺乳动物后施用t细胞消耗剂，从而减少(例如消耗)细胞(例如， car-表达细胞)。
[0108]
在一些实施方案中，方法还包括将细胞例如造血干细胞或骨髓移植到哺乳 动物中。
[0109]
在一些实施方案中，哺乳动物患有白血病，例如急性淋巴母细胞性白血病。
[0110]
在一些实施方案中，在施用细胞(例如本文所述的免疫效应细胞的群体) 之后一、二、三、四或五周施用t细胞消耗剂。
[0111]
在一个实施方案中，t细胞消耗剂是例如通过诱导抗体依赖性细胞介导的细 胞毒性(adcc)和/或补体诱导的细胞死亡来消耗car表达细胞的物质。例如， 本文所述的car表达细胞还可以表达被能够诱导细胞死亡的分子(例如adcc 或补体诱导的细胞死亡)识别的抗原(例如，靶抗原)。例如，本文所述的car 表达细胞还可以表达能够被抗体或抗体片段靶向的靶蛋白(例如，受体)。这 种靶蛋白的实例包括但不限于epcam、vegfr、整联蛋白(例如，整联蛋白 αvβ3、α4、αι3/4β3、α4β7、α5β1、ανβ3、αν)，tnf受体超家族成员(例如， trail-r1，trail-r2)、pdgf受体、干扰素受体、叶酸受体、gpnmb、 icam-1、hla-dr、cea、ca-125、muc1、tag-72、il-6受体、5t4、gd2、 gd3、cd2、cd3、cd4、cd5、cd11、cd11a/lfa-1、cd15、cd18/itgb2、 cd19、cd20、cd22、cd23/ige受体、cd25、cd28、cd30、cd33、cd38、 cd40、cd41、cd62l、cd74、cd80、cd125、cd147/basigin、cd152/ctla-4、 cd154/cd40l、cd195/ccr5、cd319/slamf7和egfr和它们的截短形式(例 如保留一个或多个细胞外表位但缺乏一个或多个细胞质结构域内区域的形式)。
[0112]
在一些实施方案中，car表达细胞共表达car和靶蛋白，例如天然表达靶 蛋白或被
工程化以表达靶蛋白。例如，细胞，例如免疫效应细胞的群体，可以 包括包含car核酸(例如，如本文所述的car核酸)和编码靶蛋白的核酸的核 酸(例如载体)。
[0113]
在一个实施方案中，t细胞消耗剂是cd52抑制剂，例如抗cd52抗体分子， 例如阿仑单抗(alemtuzumab)。
[0114]
在其他实施方案中，细胞，例如免疫效应细胞的群体表达如本文所述的car 分子(例如cd123 car)和被t细胞消耗剂识别的靶蛋白。在一个实施方案中， 靶蛋白是cd20。在靶蛋白是cd20的实施方案中，t细胞消耗剂是抗cd20抗体， 例如利妥昔单抗。
[0115]
在任何上述方法的另外的实施方案中，方法还包括将细胞例如造血干细胞 或骨髓移植到哺乳动物中。
[0116]
在另一方面，本发明的特征在于在细胞移植之前调理哺乳动物的方法。该 方法包括对哺乳动物施用有效量的包含如本文所述的car核酸或如本文所述的 多肽的细胞。在一些实施方案中，细胞移植是干细胞移植，例如造血干细胞移 植或骨髓移植。在其他实施方案中，在细胞移植之前调理受试者，包括减少受 试者中表达cd123的细胞(例如表达cd123的正常细胞或表达cd123的癌细胞) 的数目。
[0117]
在另一个方面，本发明涉及编码本发明car的分离核酸分子、本发明car 的分离多肽分子、包含本发明car的载体，和包含本发明car的细胞，用作药 物，例如，如本文所述(例如，用于治疗与cd123表达相关的疾病)。
[0118]
在另一个方面，本发明涉及用于治疗表达cd123的疾病(例如，如本文所述 的表达cd123的疾病)的编码本发明car的分离核酸分子、本发明car的分离多 肽分子、包含本发明car的载体和包含本发明car的细胞，例如，如本文所述。 在某些实施方案中，所述疾病是血液癌症，例如，如本文所述。在一些实施方 案中，所述疾病选自：急性白血病，包括但不限于急性髓性白血病(aml)、 急性淋巴母细胞性白血病(all)、急性淋巴母细胞性b细胞白血病(b细胞急 性淋巴细胞性白血病，ball)、急性淋巴母细胞性t细胞白血病(t细胞急性 淋巴细胞性白血病，tall)、脊髓发育不良综合征、骨髓增生性肿瘤、组织细 胞性疾病(例如肥大细胞疾病或母细胞性浆细胞样树状细胞肿瘤)；肥大细胞 疾病，例如系统性肥大细胞增多症或肥大细胞白血病；慢性髓性白血病(cml)； 或母细胞性浆细胞样树状细胞瘤。
[0119]
前述组合物和方法的额外特征和实施方案包括以下一者或多者：
[0120]
在某些实施方案中，cd123 car分子(例如，如本文所述的cd123 car核 酸或cd123 car多肽)，或如本文所述的cd123结合结构域，包含表3中提供 的1、2或3个来自重链可变区的cdr(例如，hc cdr1、hc cdr2和/或hccdr3)；和/或表4中提供的1、2或3个来自轻链可变区的cdr(例如，lc cdr1、 lc cdr2和/或lc cdr3)例如，表3或4中提供的car123-1、car123-2、 car123-3、car123-4的1、2或3个hc cdr1、hc cdr2或hc cdr3,和 /或1、2或3个lc cdr1、lc cdr2或lc cdr3)；或与前述任何序列基本 上同一(例如，95-99％同一，或多至5、4、3、2或1个氨基酸变化，例如置换(例 如，保守性置换))的序列。
[0121]
在某些实施方案中，cd123 car分子(例如，如本文所述的cd123 car核 酸或cd123 car多肽)，或如本文所述的抗cd123抗原结合结构域，包含表 10中提供的1、2或3个来自重链可变区的cdr(例如，hc cdr1、hc cdr2 和/或hc cdr3)；和/或表11中提供的1、2或3个来自轻链可变区的cdr(例 如，表10或11中提供的car123-1、car123-2、car123-3、car123-4的1、 2或3个hc cdr1、hc cdr2或hc cdr3,和/或1、2或3个lc cdr1、 lc cdr2或lc cdr3)；或
no:512的lc cdr3；
[0141]
(iii)car123-3的seq id no:503的lc cdr1、seq id no:508的lc cdr2和seq id no:513的lc cdr3；
[0142]
(iv)car123-4的seq id no:504的lc cdr1、seq id no:509的lc cdr2和seq id no:514的lc cdr3；和/或
[0143]
(2)选自以下之一的一个、两个或三个重链(hc)cdr：
[0144]
(i)car123-1的seq id no:486的hc cdr1、seq id no:491的hc cdr2和seq id no:496的hc cdr3；
[0145]
(ii)car123-2的seq id no:487的hc cdr1、seq id no:492的hc cdr2和seq id no:497的hc cdr3；
[0146]
(iii)car123-3的seq id no:488的hc cdr1、seq id no:493的hc cdr2和seq id no:498的hc cdr3；
[0147]
(iv)car123-4的seq id no:489的hc cdr1、seq id no:494的hccdr2和seq id no:499的hc cdr3。
[0148]
在某些实施方案中，cd123 car分子(例如，如本文所述的cd123 car核 酸或cd123 car多肽)或如本文所述的抗cd123抗原结合结构域包括：
[0149]
(1)选自以下之一的一个、两个或三个轻链(lc)cdr：
[0150]
(i)car123-1的seq id no:531的lc cdr1、seq id no:536的lc cdr2 和seq id no:541的lc cdr3；
[0151]
(ii)car123-2的seq id no:532的lc cdr1、seq id no:537的lc cdr2和seq id no:542的lc cdr3；
[0152]
(iii)car123-3的seq id no:533的lc cdr1、seq id no:538的lc cdr2和seq id no:543的lc cdr3；
[0153]
(iv)car123-4的seq id no:534的lc cdr1、seq id no:539的lc cdr2和seq id no:544的lc cdr3；和/或
[0154]
(2)选自以下之一的一个、两个或三个重链(hc)cdr：
[0155]
(i)car123-1的seq id no:516的hc cdr1、seq id no:521的hc cdr2和seq id no:526的hc cdr3；
[0156]
(ii)car123-2的seq id no:517的hc cdr1、seq id no:522的hc cdr2和seq id no:527的hc cdr3；
[0157]
(iii)car123-3的seq id no:518的hc cdr1、seq id no:523的hc cdr2和seq id no:528的hc cdr3；
[0158]
(iv)car123-4的seq id no:519的hc cdr1、seq id no:524的hccdr2和seq id no:529的hc cdr3。
[0159]
除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属 领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的那些方法和材料 相似或等同的方法和材料可以用于实施或检验本发明，然而现在描述合适的方 法和材料。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引 用的方式完整地并入。此外，所述材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在 是限制性的。标题、副标题或编号或字母编号的
hdlm-2细胞系移植过表达人细胞因子包括il-3的nod-scid-γ链ko小鼠 (nsg-s小鼠)。静脉内注射后，肿瘤细胞逐渐形成弥散的软组织块。中和性 抗il3抗体的连续注射减缓了肿瘤的生长。
[0175]
图14显示了cd107a脱颗粒测定法。在抗cd28、抗cd49d抗体和莫能菌素 存在下，将未转染的t细胞(utd)或cart123与hdlm-2(cd123+hl细胞 系)以5个靶细胞对1个t细胞的比率孵育4小时。抗cd30 car t细胞用作另外 的对照。cart123但不是utd显示了增加的cd107a脱颗粒，如通过流式细胞 术检测到的。
[0176]
图15显示了图20所示的脱颗粒测定法的图示。
[0177]
图16证明表达cd123 car的t细胞显示了胞质内细胞因子产生(il-2， tnf)的显著增加。
[0178]
图17证明cart123而不是utd显示出剂量依赖性杀伤，如通过基于萤光素 酶的24小时杀伤测定法中生物发光发射的减少所示。t细胞与萤光素酶 +hdml-2细胞以不同比例(0.3:1-10:1)共孵育。
[0179]
图18显示了当在增殖测定法中与霍奇金淋巴瘤细胞系共培养时，cart123 和cart30细胞、而不是utd显示了稳健的增殖。在5天t细胞增殖测定法中，t 细胞与hl细胞系(cd123+)或对照(jurkat cd123-、molm-14 cd123+) 或pma/离子霉素(阳性对照)或细胞培养基(阴性对照)孵育。
[0180]
图19包括图19a、19b、19c和19d，显示了cart123诱导稳健产生ifng(图 19a)、il-2(图19b)、tnfα(图19c)和mip1b mfi(图19d)，显示了发 光mfi。
[0181]
图20显示了霍奇金淋巴瘤的体内模型的示意图。将1百万个萤光素酶+ hdlm-2细胞在第0天静脉内注射。然后进行所示的连续生物发光成像(bli) 以观察肿瘤水平。在第7天观察到低水平的肿瘤，随后在经过约6周肿瘤负荷逐 渐增加，再现了人疾病的惰性。在第43天，当肿瘤负荷高于基线20倍时，用150 万个cart123细胞或对照t细胞处理小鼠。
[0182]
图21显示了根据图28中的示意图，在注射cart123细胞、对照t细胞后的 小鼠或未处理的小鼠中、在天数下检测hdlm-2的bli。
[0183]
图22显示了根据图28所示的示意图处理的小鼠的存活，cart123在14天内 诱导完全和持久根除扩散的肿瘤，导致6个月时100％无复发和100％总体存活。
[0184]
图23显示了通过流式细胞术在连续外周血采血中检测到的肿瘤消除和广泛 的car t细胞扩增之间的关联。扩增的t细胞为约50％cd8和50％cd4细胞。随 着肿瘤负荷减小，t细胞数随时间而收缩。
[0185]
图24是条形图，包括图24a、24b和24c，显示了当与靶细胞molm13、pl21 和u87以指定比率培养时，表达car123构建体(cd123-2、cd123-3和cd123-4) 的t细胞产生的细胞因子。图24a显示il-2的产生；图24b显示ifn-γ的产生； 和图24c显示tnf-α的产生。
[0186]
图25是条形图，其显示了当存在靶细胞molm13(其表达cd123)、k562
-ꢀ
人cd123(其表达人cd123)或k562(其不表达cd123)时，培养慢病毒转导 的表达car123-2(lv car123-2)或对照抗gh的t细胞的增殖能力。
[0187]
图26包括图26a、26b和26c，显示了慢病毒转导的表达car123 car(lvcar123-2)或对照(抗gh)的t细胞或未转导的细胞(utd)在各种靶细胞： 效应细胞比率下杀死靶细胞的能力，其中靶细胞是表达cd123的molm13(图 26a)或pl21(图26b)细胞，或cd123阴性的
u87细胞(图26c)。
[0188]
图27是包括图27a和27b的图，显示了当在靶细胞molm13(其表达cd123) 和u87(其不表达cd123)存在下培养时，表达car123(lv car123-2)或对 照(抗gh)的慢病毒转导的t细胞产生的细胞因子的图。图27a显示ifnγ和tnfα 的细胞因子产生；图27b显示il-2的细胞因子产生。
[0189]
图28显示了霍奇金淋巴瘤的体内小鼠模型中的肿瘤负荷，其中对携带肿瘤 的小鼠施用表达各种car123构建体的t细胞：1172、1176、nvs2(本文也称 为car123-2)、nvs3(本文也称为car123-3)和nvs4(本文也称为car123-4)。 测量第6天、第14天、第20天和第27天的肿瘤负荷，并通过生物发光成像(bli) 测量和表示。
[0190]
图29显示了体内小鼠模型中的肿瘤负荷，其中对携带肿瘤的小鼠施用从慢 病毒载体(cart123 lv)转导的表达car123-2的t细胞、作为rna转导的 car123-2(cart123 rna(nvs))、和作为rna转导的工具car123 (cart123 rna(penn))。未转导的t细胞用作对照(utd)。肿瘤负荷由 生物发光成像(bli)单位表示。
[0191]
图30包括图30a、30b、30c和30d，显示了体内小鼠模型中肿瘤的生物发 光成像。图30a显示了施用未转导细胞的小鼠；图30b显示了施用表达rnacar123-2的t细胞的小鼠；图30c显示了施用慢病毒转导的表达car123-2的t 细胞的小鼠；图30d显示了施用表达rna工具car123的t细胞的小鼠。
[0192]
图31包括图31a、31b、31c、31d、31e和31f，显示了cart19治疗后cd123 在cd19阴性b细胞急性淋巴细胞性白血病复发发生中高度表达。图31a显示了 在42个复发/难治的all样品中cd123与cd19相比的表达。图31b显示了b-all 母细胞(blast)中cd123和cd19的共表达。在母细胞(ssc低、单峰、活、cd45 暗淡)上门控。图31c显示了白血病干细胞(lsc)的门控策略。cd123在该亚 群中高度表达。图32d显示了cd123和cd19共表达和来自fish分析的结果。图 31e和31f显示了在基线或复发后cd19和cd123表达的比较。
[0193]
图32包括图32a、32b、32c、32d、32e和32f，显示了使用表达cd19 car (car19)或cd123 car(car123)的t细胞的各种体外测定的结果。图32a 显示了cd19和cd123表达；图32b显示了cd107a脱颗粒测定；图32c显示了靶 细胞杀伤的能力；图32d和e显示增殖能力；图32f显示了指定细胞因子的细胞 因子产生。
[0194]
图33包括图33a、33b和33c，显示了表达cd19 car(car19)或cd123 car(car123)的cart细胞在体内小鼠模型中具有抗肿瘤效果。图33a显示 了由生物发光成像表示的肿瘤负荷；图33b显示了接受cart治疗的小鼠的总生 存曲线；图33c显示了外周血中cart123细胞的扩增。
[0195]
图34包括图34a、34b、34c、34d、34e和34f，显示了cart123在抗原缺 失复发的体内小鼠模型中是有活性的。图34a显示了实验方案；图34b显示了由 生物发光成像所表示的疾病进展，对于cd19表达的基线和复发疾病(上图)和 响应于cart19疗法治疗(下图)；图34c显示了施用未转导的t细胞或cart19 细胞的小鼠的生物发光图像；图34d显示了用cart19或cart123治疗的实验 方案；图34e显示了疾病进展；图34f显示了经治疗的小鼠的总体存活。
[0196]
图35包括图35a、35b和35c，显示了异种移植小鼠的颅骨骨髓中的 all-cart相互作用。图35a示出了实验方案；图35b显示了cart19细胞和 cart123细胞的代表性多光子xy
平面图像，所述细胞与被设计为表达cd19和 cd123或单独表达cd123的all肿瘤相互作用(可移动细胞用虚线圈表示，非 可移动细胞用箭头表示)；图35c是显微镜图像的图形表示。
[0197]
图36包括图36a、36b和36c，显示了使用cart19和cart123预防cd19 阴性的复发。图36a显示了实验方案；图36b显示了用未转导的t细胞(上图)、 cart19(中图)或cart19和cart123的组合(下图)治疗的小鼠的疾病进 展(由bli表示肿瘤负荷)；图36c显示了来自该实验的总体存活。
[0198]
图37包括图37a和37b，显示了表达car19和car123的t细胞(图37a)和 脱颗粒测定的结果(图37b)。
[0199]
图38包括图38a和38b，显示了all母细胞(blast)的特征。图38a显示了 各种标志物cd19、cd123、cd10、cd34和cd20的表达；图38b显示了用于分 选cd19-cd123+细胞的门控策略。
[0200]
图39包括图39a、39b、39c和39d，显示了cart123的抗白血病活性。图 39a显示cd19和cd123在nalm6细胞上的表达；图39b显示了响应cart19或 cart123治疗的肿瘤负荷(由bli表示)；图39c显示了施用cart19或 cart123的小鼠的总体存活；和图39d显示了施用不同剂量的cart123的小鼠 的总体存活。
[0201]
图40包括图40a和40b，显示了抗原缺失复发的体内模型的特征。图40a显 示了在cd19阴性复发疾病中cd123的表达；图40b显示当与基线或复发细胞体 外培养时cart19或cart123细胞的脱颗粒测定。
[0202]
图41包括图41a、41b和41c，显示了或在原代aml细胞上pd1l1的表达(图 41a)、和在t细胞上pd1的表达(图41b)和tim3的表达(图41c)。
[0203]
图42包括图42a、42b、42c和42d，显示了在cd8+t细胞上免疫检查点pd1 (图42a)、tim3(图42b)、lag3(图42c)和ctla4(图42d)的表达。
[0204]
图43显示了aml基线(左)和复发(右)样品上的tim3表达的流式细胞 术分析。
[0205]
图44显示了cart123治疗后与用未转导(utd)细胞处理相比的肿瘤负荷 (由生物发光成像表示，光子/秒)。
[0206]
图45显示了在cd123治疗后缓解或在复发后异种移植中t细胞上的tim3和 pd1的表达。
[0207]
图46包括图46a和46b，显示了与检查点抑制剂(例如pd1、tim3的抑制剂， 以及pd1和tim3的抑制剂组合或tim3和ceacam-1的抑制剂的组合)共培养 后来自复发小鼠的骨髓的特征。在pma/iono不存在(图46a)或存在(图46b) 的情况下检测的表达gmcsf、ifng、ki67和mip1b的t细胞的百分比。
[0208]
图47显示了用未转导的细胞和pd1抑制剂或tim3抑制剂治疗的aml异种 移植的实验方案。
[0209]
图48显示了图47所示实验的肿瘤负荷(由bli表示，光子/秒)。
[0210]
图49显示了用cart123组合tim3和/或pd1抑制剂治疗aml异种移植的实 验方案。
[0211]
图50包括图50a、50b、50c和50d，显示了图49中所示的实验的肿瘤负荷 (由bli表示，光子/秒)。图50a将cart123与cart123和pd1抑制剂的组合 进行了比较；图50b比较了cart123与cart123和pd1抑制剂和tim3抑制剂的 组合；图50c比较了cart123与cart123和tim3抑制剂的组合，图50d显示了 图50a-c中呈现的数据的代表性曲线。
[0212]
图51包括51a、51b、51c、51d和51e，显示了单个载体上的各种布局，例 如，其中u6调节的shrna位于ef1α调节的car编码元件上游或下游。在图51a 和图51b绘制的示例性构建体中，通过处于相同方向的u6和ef1α启动子发生转 录。在图51c和图51d绘制的示例性构建体中，通过处于不同方向的u6和ef1α 启动子发生转录。在图51e中，shrna(和相应u6启动子)在第一载体上，并且 car(和相应的ef1α启动子)在第二载体上。
[0213]
图52描述了两个示例性rcar布局的结构。抗原结合构件包含抗原结合结 构域、跨膜结构域和开关结构域。胞内结合构件包含开关结构域、共刺激信号 结构域和初级信号结构域。这两个布局显示，本文所述的第一和第二开关结构 域可以相对于抗原结合构件和胞内结合构件处于不同取向。本文进一步描述了 其他rcar布局。
[0214]
图53显示，在细胞培养系统中通过低剂量rad001增强表达car的转导的t 细胞增殖。将cart与nalm-6细胞在不同浓度的rad001存在下共培养。在共培 养4天后评估car阳性cd3阳性t细胞(黑色)和总t细胞(灰色)的数目。
[0215]
图54描述了每日按0.3、1、3和10mg/kg(mpk)给予rad001或给予运载体时 nalm6-luc细胞的肿瘤生长量值。圆圈表示运载体；方块表示rad001的10 mg/kg剂量；三角形表示rad001的3mg/kg剂量，倒三角形表示rad001的1 mg/kg剂量；并且菱形表示rad001的0.3mg/kg剂量。
[0216]
图55包括图55a和图55b，显示药代动力学曲线，所述曲线显示携有nalm6 肿瘤的nsg小鼠的血液中的rad001量。图55a显示首剂rad001后的第0日pk。 图55b显示末剂rad001后的第14日pk。菱形表示rad001的10mg/kg剂量；方 块表示rad001的1mg/kg剂量；三角形表示rad001的3mg/kg剂量；并且x表示 rad001的10mg/kg剂量。
[0217]
图56包括图56a和图56b，显示在给予或不给予rad001的情况下，人源化 cd19 cart细胞的体内增殖。每日低剂量的rad001(0.003mg/kg)导致car t 细胞增殖增强，高于hucar19增殖的正常水平。图56a显示cd4+car t细胞； 图56b显示cd8+car t细胞。圆圈表示pbs；方块表示huctl019；三角形表 示rad001为3mg/kg的huctl019；倒三角形表示rad001为0.3mg/kg的 huctl019；菱形表示rad001为0.03mg/kg的huctl019；并且圆圈表示rad001 为0.003mg/kg的huctl019。
[0218]
图57是用于在终止cart123活性的策略中表达car123和cd20的慢病毒 载体的载体图，其中car123序列和cd20序列通过p2a序列连接。
[0219]
图58显示了与cart123 p2a cd20细胞相比的cart123细胞的cd107脱 颗粒测定的结果。
[0220]
图59包括图59a、59b、59c和59d，显示了与cart123 p2a cd20细胞相 比的cart123细胞产生的gm-csf(图59a)、tnfα(图59b)、ifnγ(图59c) 和il-2(图59d)。
[0221]
图60显示了当以所示的效应细胞:靶细胞比率孵育时，cart123细胞与 cart123 p2a cd20细胞相比的细胞毒性能力(由％特异性裂解表示)。
[0222]
图61包括图61a和61b，显示在cart123细胞(图61a)和cart123 p2acd20细胞(图61b)上用指定剂量的利妥昔单抗处理后的t细胞消耗。
[0223]
图62显示在15％补体存在下用指定剂量的利妥昔单抗对cart123 p2acd20细胞处理后的t细胞消耗。
[0224]
图63包括图63a和63b，证明了表达car19和car123的双cart细胞的策 略。图63a是
包含通过p2a序列连接的car19和car123的载体图。图63b显示 了表达car19、car123(q3)和表达car19(q1)和car123(q2)二者的 细胞百分比。
[0225]
图64包括图64a和64b，证明了表达car19和car123的分拆的cart细胞 策略。图64a是含有通过p2a序列连接的car19和car123的载体图。car19包 括cd3ζ结构域，而car123包括4-1bb结构域。图64b显示了表达car19、 car123(q3)和表达car19(q1)和car123(q2)二者的细胞百分比。
[0226]
图65显示在原代hsc、aml和bpdcn样品上的cd123表达。
[0227]
图66包括图66a和66b，显示了当在表达cd123的靶细胞存在下以所示的效 应细胞：靶比率孵育时，cart123克隆32716(图66a)和26292(图66a)的细 胞毒性测定。
[0228]
图67显示了当与hsc孵育时，相比于bpdcn，cart123细胞的cd107脱颗 粒测定。
[0229]
图68包括图68a和68b，显示了来自患有肥大细胞白血病/系统性肥大细胞增 多症的患者血液的单个核细胞上的cd123表达，如通过同种型抗体作为对照(图 68a)或cd123抗体(图68b)染色所检测的。
[0230]
图69包括图69a和69b，显示了cd107脱颗粒测定，其中cart123细胞单独 与pma和离子霉素培养(图69a)或与来自患有肥大细胞白血病/系统性肥大细 胞增多症的患者血液的单个核细胞培养(图69b)。
[0231]
图70显示了在患有难治性或复发性aml的受试者中施用rna cart123的 临床研究中，受试者组1的实验方案。
[0232]
图71显示了在患有难治性或复发性aml的受试者中施用rna cart123的 临床研究中，受试者组2的实验方案。除了cart治疗之外，这些患者还接受一 定剂量的淋巴减少的化疗。
[0233]
图72包括图72a、72b和72c，显示了在molm14异种移植模型中用慢病毒 转导的cart123细胞治疗后，使用抗cd52抗体阿仑单抗(alemtuzumab)的t 细胞消除的结果。在第1周给小鼠施用cart123细胞或未转导(utd)的细胞。 在第2周、第3周或第4周给接受cart123细胞的小鼠施用阿仑单抗，并评估肿 瘤负荷，持续24周。在12周时引入“molm14”再攻击。图72a显示通过生物 发光成像(光子/秒)检测的肿瘤负荷；图72b显示在外周血中检测到的cart 细胞的百分比；图72c显示了总体生存。
[0234]
图73包括图73a和73b，显示了在儿科aml异种移植模型中用慢病毒转导的 cart123细胞治疗后，使用阿仑单抗的t细胞消除的结果。在原代aml细胞植 入(第0周)后6周，将cart123细胞或未转导(utd)的细胞施用于小鼠。在 第4周对接受cart123治疗的小鼠施用阿仑单抗。图73a显示通过生物发光成像 (光子/秒)检测的肿瘤负荷；图73b显示在外周血中检测到的cart细胞的百分 比。
[0235]
图74包括图74a和74b，显示了如图73中所进行的在cart123和阿仑单抗治 疗后脾脏(图74a)和骨髓(图74b)中的aml细胞分析。
[0236]
图75显示了三种终止策略的比较：(1)通过阿仑单抗治疗的cart细胞消 除；(2)t细胞中的car/cd20共表达和用利妥昔单抗消除；和(3)对aml 异种移植模型的肿瘤负荷，用rna电穿孔的cart细胞(由生物发光成像表示； 光子/秒)。
[0237]
发明详述
[0238]
定义
[0239]
除非另外规定，否则本文中所用的全部术语及科学术语具有与本发明相关 领域的技术人员通常理解的相同意义。
[0240]
术语“一个”和“一种”指该冠词的一个或多于一个(即，指至少一个)的语法对 象。例如，“一个要素”意指一个要素或多于一个要素。
[0241]
当指可度量值如数量、时间持续期等时，术语“约”意在涵盖距指定值
±
20％ 的变动或在一些情况下
±
10％的变动或在一些情况下
±
5％的变动或在一些情况 下
±
1％的变动或在一些情况下
±
0.1％的变动，因为这类变动适于开展所公开的 方法。
[0242]
术语“嵌合抗原受体”或备选地“car”指至少包含胞外抗原结合结构域、跨 膜结构域和胞质信号结构域(本文也称作“胞内信号结构域”)的重组多肽构建体， 所述胞质信号结构域包含从如下文定义的刺激分子衍生的功能性信号结构域。 在一些实施方案中，car多肽构建体中的结构域处于相同的多肽链中，例如， 包括嵌合融合蛋白。在一些实施方案中，car多肽构建体中的结构域彼此不邻 接，例如，处于不同的多肽链中，例如，如在如本文所述的rcar中提供。
[0243]
在一个方面，car的刺激分子是与t细胞受体复合物缔合的ζ链。在一个方 面，胞质信号结构域包含初级信号结构域(例如，cd3-ζ的初级信号结构域)。在 一个方面，胞质信号结构域还包含从至少一种如下文定义的共刺激分子衍生的 一个或多个功能性信号结构域。在一个方面，共刺激分子选自4-1bb(即， cd137)、cd27、icos和/或cd28。在一个方面，car包含这样的嵌合融合蛋 白，所述嵌合融合蛋白包含胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和胞内信号结构 域，所述胞内信号结构域包含从刺激分子衍生的功能性信号结构域。在一个方 面，car包含这样的嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含胞外抗原识别结构 域、跨膜结构域和胞内信号结构域，所述胞内信号结构域包含从共刺激分子衍 生的功能性信号结构域和从刺激分子衍生的功能性信号结构域。在一个方面， car包含这样的嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含胞外抗原识别结构域、 跨膜结构域和胞内信号结构域，所述胞内信号结构域包含两个从一种或多种共 刺激分子衍生的功能性信号结构域和从刺激分子衍生的功能性信号结构域。在 一个方面，car包含这样的嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含胞外抗原识 别结构域、跨膜结构域和胞内信号结构域，所述胞内信号结构域包含至少两个 从一种或多种共刺激分子衍生的功能性信号结构域和从刺激分子衍生的功能性 信号结构域。在一个方面，car在car融合蛋白的氨基端(n-ter)包含任选的前 导序列。在一个方面，car还在胞外抗原识别结构域的n末端包含前导序列， 其中前导序列任选地在细胞加工和car定位至细胞膜期间从抗原识别结构域 (例如，scfv)切下。
[0244]
包含抗原结合结构域(例如，scfv、单结构域抗体或tcr(例如，tcrα结合 结构域或tcrβ结合结构域))的car也称作xcar，所述抗原结合结构域特异性 结合特异性肿瘤标志物x，其中x可以是如本文所述的肿瘤标志物。例如，包含 特异性结合cd123的抗原结合结构域的car称作cd123 car。该car可以在任 何细胞(例如，如本文所述的免疫效应细胞(例如，t细胞或nk细胞))中表达。
[0245]
术语“信号结构域”指蛋白质的功能性部分，所述的功能性部分通过在细胞 内部传输信息而发挥以下作用：通过产生第二信使或通过响应于这类信使作为 效应子发挥功能，借助限定的信号传导途径调节细胞活性。
[0246]
如本文所用，术语“il-3受体的α亚基”、“il3rα”、“cd123”、“il3rα链
”ꢀ
和“il3rα亚
基”可互换地指已知在白血病前体细胞上可检出的抗原决定簇。 可以在公共数据库(如genbank、uniprot和swiss-prot)中找到人和鼠氨基酸序列 和核酸序列。例如，人il3rα的氨基酸序列可以在登录号np 002174找到，并 且编码人il3rα的核苷酸序列可以按登录号nm_005191找到。在一个方面，car 的抗原结合部分识别并结合在cd123蛋白的胞外结构域内部的表位。在一个方 面，cd123蛋白在癌细胞上表达。如本文所用，“cd123”包括这样的蛋白质， 所述蛋白质包含全长野生型cd123的突变(例如，点突变)、片段、插入、缺失和 剪接变体。
[0247]
如本文所用，术语“抗体”指衍生自与抗原特异性结合的免疫球蛋白分 子的蛋白质或多肽序列。抗体可以是多克隆或单克隆、多链或单链或完整 的免疫球蛋白并且可以衍生自天然来源或衍生自重组来源。抗体可以是免 疫球蛋白分子的四聚体。
[0248]
术语“抗体片段”指完整抗体或其重组变体的至少一个部分，并且指足以引 起抗体片段对靶(如抗原)的识别和特异性结合的抗原结合结构域，例如，完整抗 体的抗原确定性可变区。抗体片段的例子包括但不限于fab、fab'、f(ab')2和fv 片段、scfv抗体片段、线性抗体、单结构域抗体如sdab(vl或vh)、驼类 (camelid)vhh结构域、和从抗体片段形成的多特异性抗体，如包含在铰链区由 二硫键连接的两个fab片段的双价片段，和抗体的分离的cdr或其他表位结合 片段。也可以将抗原结合片段并入单结构域抗体、大抗体(maxibody)、微型抗 体、纳米体、胞内抗体、双体抗体、三体抗体、四体抗体、v-nar和双-scfv(参 见，例如，hollinger和hudson,2005,nature biotechnology,23:1126-1136,2005)。 也可以将抗原结合片段移植至基于多肽如纤连蛋白iii型(fn3)的支架中(参见美 国专利号6,703,199，其描述纤连蛋白多肽微型抗体)。
[0249]
术语“scfv”指一种融合蛋白，其包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段 和至少一个包含重链可变区的抗体片段，其中轻链可变区和重链可变区借助柔 性短多肽接头连续地连接，并且能够表达为单链多肽，并且其中scfv保留衍生 它的完整抗体的特异性。除非另外指出，否则如本文所用，scfv可以具有按任 何顺序(例如，相对于多肽的n末端和c末端)的vl可变区和vh可变区，scfv可 以包含vl-接头-vh或可以包含vh-接头-vl。
[0250]
如本文所用，术语“互补决定区”或“cdr”指在抗体可变区内部赋予抗原特 异性和结合亲和力的氨基酸序列。例如，在每个重链可变区中存在三种cdr (hcdr1、hcdr2和hcdr3)并且在每个轻链可变区中存在三种cdr(lcdr1、 lcdr2和lcdr3)。可以使用多种熟知方案的任一者确定给定cdr的精确氨基 酸序列界限，所述熟知方案包括由kabat等人(1991),”sequences of proteins ofimmunological interest”,第5版,public health service,national institutes ofhealth,bethesda,md(“kabat”编号方案)；al-lazikani等人,(1997)jmb 273,927-948(“chothia”编号方案)描述的那些或其组合。根据kabat编号方案， 在一些实施方案中，将重链可变结构域(vh)中的cdr氨基酸残基编号为31-35 (hcdr1)、50-65(hcdr2)和95-102(hcdr3)；并且将在轻链可变结构域(vl) 中的cdr氨基酸残基编号为24-34(lcdr1)、50-56(lcdr2)和89-97(lcdr3)。 根据chothia编号方案，在一些实施方案中，将vh中的cdr氨基酸编号为 26-32(hcdr1)、52-56(hcdr2)和95-102(hcdr3)；并且将vl中的cdr 氨基酸残基编号为26-32(lcdr1)、50-52(lcdr2)和91-96(lcdr3)。在组 合的kabat和chothia编号方案中，在一些实施方案中，cdr对应于作为 kabat cdr、chothia cdr或二者的部分的氨基酸残基。例如，在一些实 施方案中，cdr对应
于vh(例如，哺乳动物vh，例如，人vh)中的氨基酸 残基26-35(hcdr1)、50-65(hcdr2)和99-102(hcdr3)以及vl(例如，哺乳 动物vl，例如，人vl)中的氨基酸残基24-34(lcdr1)、50-56(lcdr2)和 89-97(lcdr3)。
[0251]
包含抗体或其抗体片段的本发明car组合物的部分可以以多种形式存在， 其中将抗原结合结构域表达为连续多肽链的部分，例如包括单结构域抗体片段 (sdab)、单链抗体(scfv)、和人源化或人抗体(harlow等人,1999,引自：usingantibodies:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press,ny； harlow等人,1989,引自：antibodies:a laboratory manual,cold springharbor,new york；houston等人,1988,proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883；bird等人,1988,science 242:423-426)。在一个方面，本发明car 组合物的抗原结合结构域包含抗体片段。在又一个方面，car包含了包含scfv 的抗体片段。
[0252]
如本文所用，术语“结合结构域”或“抗体分子”(本文中也称为“抗靶(例如 cd123)结合结构域”)指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质， 例如，免疫球蛋白链或其片段。术语“结合结构域”或“抗体分子”涵盖抗体和抗 体片段。在一个实施方案中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如，它包含多 个免疫球蛋白可变结构域序列，其中多个免疫球蛋白可变结构域序列的第一免 疫球蛋白可变结构域序列具有针对第一表位的结合特异性并且多个免疫球蛋白 可变结构域序列的第二免疫球蛋白可变结构域序列具有针对第二表位的结合特 异性。在一个实施方案中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性 抗体对不多于两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子以针对第一表位具有结 合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和针对第二表位具有结合特异性的 第二免疫球蛋白可变结构域序列为特征。
[0253]
术语“抗体重链”指以其天然存在构象在抗体分子中存在的两种类型多肽链 中的较大者，其在正常情况下决定抗体所属的类别。
[0254]
术语“抗体轻链”指以其天然存在构象在抗体分子中存在的两种类型多肽链 中的较小者。κ(κ)轻链和λ(λ)轻链指两个主要的抗体轻链同种型。
[0255]
术语“重组抗体”指使用重组dna技术生成的抗体，例如，通过噬菌体或酵 母表达系统表达的抗体。本术语应当还解释为意指已经通过合成编码抗体并且 表达抗体蛋白的dna分子或通过合成特定抗体的氨基酸序列而产生的抗体，其 中已经使用本领域可获得的和熟知的重组dna或氨基酸序列技术获得dna或 氨基酸序列。
[0256]
术语“抗原”或“ag”指激发免疫应答的分子。这种免疫应答可以涉及抗体产 生、或特异性免疫活性细胞的活化、或这两者。技术人员将会理解，任何大分 子，实际上包括全部蛋白质或肽，均能充当抗原。另外，抗原可以衍生自重组 dna或基因组dna。技术人员将会理解，包含编码蛋白质的核苷酸序列或部分 核苷酸序列的任何dna因此编码如本文所用本术语那样的“抗原”，其中所述蛋 白质激发免疫应答。另外，本领域技术人员将会理解，抗原不必完全由基因的 全长核苷酸序列编码。轻易显而易见的是，本发明包括但不限于使用多于一种 基因的部分核苷酸序列并且这些核苷酸序列按多种组合布置以编码激发所需免 疫应答的多肽。另外，技术人员将会理解，抗原完全不必要由“基因”编码。轻 易显而易见的是，抗原可以合成生成或可以衍生自生物样品、或除多肽外还可 能是大分子。这种生物样品可以包括但不限于具有其他生物学组分的组织样品、 肿瘤样品、细胞或流体。
[0257]
术语“抗肿瘤作用”指可以通过多种手段展示的生物学效果，包括但不限于， 例如，肿瘤体积减小、肿瘤细胞数目减少、转移灶数目减少、预期寿命增加、 肿瘤细胞增殖减少、肿瘤细胞存活减少或与癌状况相关的多种生理症状改善。
ꢀ“
抗肿瘤作用”也可以通过本发明的肽、多核苷酸、细胞和抗体防止肿瘤在首发 位置出现的能力展示。
[0258]
术语“抗癌作用”指可以通过多种手段展示的生物学效果，包括但不限于， 例如，肿瘤体积减小、癌细胞数目减少、转移灶数目减少、预期寿命增加、癌 细胞增殖减少、癌细胞存活减少或与癌状况相关的多种生理症状改善。“抗癌作 用”也可以通过肽、多核苷酸、细胞和抗体防止癌在首发位置出现的能力展示。
[0259]
术语“抗肿瘤作用”指可以通过多种手段展示的生物学效果，包括但不限于， 例如，肿瘤体积减小、肿瘤细胞数目减少、肿瘤细胞增殖减少或肿瘤细胞存活 减少。
[0260]
术语“自体的”指这样的任何物质，所述物质从稍后将向个体再次引入所述 物质的相同个体衍生。
[0261]
术语“同种异体的”指这样的任何物质，所述物质从与引入所述物质的个体 相同的物种的不同动物衍生。当一个或多个基因座处的基因不相同时，两位或 更多位个体据称彼此是同种异体的。在一些方面，来自相同物种的个体的同种 异体物质可以在遗传上足够地不相似以发生抗原性相互作用。
[0262]
术语“异种的”指从不同物种的动物衍生的移植物。
[0263]
如本文所用的术语“单采血液成分术”指本领域认可的体外方法，借助所述 方法，供体或患者的血液从供体或患者取出并且穿过这样的装置，所述装置分 离选择的特定组分并将剩余部分返回供体或患者的循环，例如，通过再输血。 因此，在“单采样品”的语境中，指使用单采血液成分术获得的样品。
[0264]
术语“组合”指在一个剂量单位形式中的固定组合或联合施用，其中本发明 的化合物和组合配偶体(例如另一种如下解释的药物，也称作“治疗剂”或“辅剂”) 可以在相同时间独立地施用或在各时间间隔内部分别施用，特别地其中这些时 间区间允许联合配偶物显示合作性例如协同效应。单一组分可以在试剂盒中包 装或独立包装。可以将组分中一者或两者(例如，粉末或液体)在施用之前重构或 稀释到所需的剂量。如本文中所用的术语“共施用”或“组合施用”等意在涵盖施 用选择的组合配偶体至有需要它的单一受试者(例如患者)，并且是意在包括其中 药物不必然地通过相同施用途径或同时施用的治疗方案。如本文所用的术语“药 物组合”意指因混合或合并多于一种有效成分产生的产品并且包括有效成分的 固定组合和非固定组合。术语“固定组合”意指有效成分，例如本发明的化合物 和组合配偶体，均以单一实体或剂量同时地施用至患者。术语“非固定组合”意 指有效成分，例如本发明的化合物和组合配偶体，均作为独立实体同时、同步 或无特定时间限制下依次施用至患者，其中这类施用在患者身体内提供治疗有 效水平的两种化合物。后者还适用于鸡尾酒治疗，例如施用三种或更多种有效 成分。
[0265]
术语“癌症”指异常细胞快速且失控生长为特征的疾病。癌细胞可以局部地 或通过血流和淋巴系统扩散到身体其他部分。本文中描述了多种癌症的例子并 且它们包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、 结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。术语“肿瘤”和“癌症
”ꢀ
在本文中互换地使用，例如，两种术语涵盖实体瘤和液体肿瘤，例如，弥散型 或循环型肿瘤。如本文所用，术语“癌症”或“肿瘤”包括恶变
前以及恶性癌症和 肿瘤。
[0266]“从
…
衍生”如该术语在本文中所用那样，表示第一分子和第二分子之间的 关系。它通常指在第一分子和第二分子之间的结构相似性并且不暗示或不包括 对衍生自第二分子的第一分子的过程限制或来源限制。例如，在衍生自cd3ζ分 子的胞内信号结构域情况下，胞内信号结构域保留足够的cd3ζ结构，从而具有 需要的功能，即，在适宜条件下产生信号的能力。它不暗示或不包括限制产生 胞内信号结构域的特定过程，例如，它不意指，为了提供胞内信号结构域，必 须始于cd3ζ序列并删除不想要的序列，或赋予突变，以实现胞内信号结构域。
[0267]
如本文所用的短语“与表达cd123相关的疾病”包括但不限于与表达cd123 相关的疾病或与表达cd123(例如，野生型或突变cd123)的细胞相关的病状，包 括例如增生性疾病，如癌症或恶性肿瘤；癌前期疾病如脊髓发育不良、脊髓发 育不良综合征或白血病前期；或与表达cd123(例如，野生型或突变cd123)的细 胞相关的非癌症相关适应征。在一个方面，与cd123(例如，野生型或突变cd123) 表达相关的癌症是血液癌症。在一个方面，疾病包括aml、all、毛细胞白血 病、幼淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病(cml)、霍奇金淋巴瘤、母细胞性 浆细胞样树突细胞肿瘤、淋巴细胞性b细胞白血病(b细胞急性淋巴细胞性白血 病，ball)、急性淋巴母细胞性t细胞白血病(t细胞急性淋巴细胞性白血病，tall)、脊髓发育不良综合征、骨髓增生性肿瘤、组织细胞性病状(例如肥大 细胞疾病或母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤)、肥大细胞疾病，例如，系统性 肥大细胞增多症或肥大细胞白血病，等等。与cd123表达相关的其它疾病包括 但不限于例如非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前病症或与cd123表达相 关的增殖性疾病。还可以包括与cd123表达相关的非癌相关适应症。
[0268]
在一些实施方案中，表达肿瘤抗原(例如，cd123-或cd19-)的细胞表达 或在任何时间表达过编码肿瘤抗原的mrna。在一个实施方案中，表达肿瘤抗 原(例如，cd123-或cd19-)的细胞产生肿瘤抗原蛋白(例如，野生型或突变体)， 并且肿瘤抗原蛋白可以按正常水平或减低的水平存在。在一个实施方案中，表 达肿瘤抗原(例如，cd123-或cd19-)的细胞在一个时间点产生可检测水平的 肿瘤抗原蛋白并且随后基本上不产生可检测的肿瘤抗原蛋白。
[0269]
术语“保守序列修饰”指未显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体或抗体片 段的结合特征的氨基酸修饰。这类种保守修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。 可以通过本领域已知的标准技术，如位点定向诱变和pcr介导的诱变向本发明 的抗体或抗体片段引入修饰。保守性置换是氨基酸残基由具有相似侧链的氨基 酸残基替换的氨基酸置换。已经在本领域中定义了具有相似侧链的氨基酸残基 的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧 链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、 谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如， 丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、β-侧链(例 如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、 组氨酸)的氨基酸。因而，可以将本发明car内部的一个或多个氨基酸残基替换 为来自相同侧链家族的其他氨基酸残基，并且可以使用本文所述的功能测定法 测试改变的car。
[0270]
术语“刺激”指由刺激分子(例如，tcr/cd3复合体)与其相应配体的结合所 诱导的初次应答，所述初次应答因而介导信号转导事件，如，但不限于借助 tcr/cd3复合体的信号
转导。刺激可以介导某些分子改变的表达，如下调tgf-β 和/或细胞骨架结构的再组织等。
[0271]
术语“刺激分子”指由提供初级胞质信号传导序列的t细胞表达的分子，所述 的初级胞质信号传导序列在t细胞信号传导途径的至少某个方面以刺激性方式 调节tcr复合体的初级活化。在一个方面，初级信号例如通过tcr/cd3复合体 与载有肽的mhc分子的结合引发并且导致介导t细胞反应，包括但不限于增殖、 活化、分化等。以刺激性方式发挥作用的初级胞质信号传导序列(也称作“初级 信号结构域”)可以含有称作基于免疫受体酪氨酸的活化基序或itam的信号传 导基序。含有在本发明中特别有用的itam的初级胞质信号传导序列的例子包 括，但不限于衍生自tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、 cd79a、cd79b、cd278(也称作“icos”)、fcεri、cd66d、dap10和dap12 的那些。在本发明的具体car中，本发明的任一种或多种car中的胞内信号结 构域包含胞内信号传导序列，例如，cd3-ζ的初级信号传导序列。在本发明的具 体car中，cd3-ζ的初级信号传导序列是作为seq id no:9提供的序列或来自 非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在本发明的具体car 中，cd3-ζ的初级信号传导序列是在seq id no:10中提供的序列或来自非人类 物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。
[0272]
术语“抗原呈递细胞”或“apc”指在其表面上呈递与主要组织相容性复合体 (mhc)复合的外来抗原的免疫系统细胞如佐细胞(例如，b细胞、树状细胞等)。 t细胞可以使用其t细胞受体(tcr)识别这些复合物。apc加工抗原并将它们呈 递至t细胞。
[0273]
如本文中所用那样，术语“胞内信号结构域”指分子的胞内部分。胞内信号 结构域可以产生促进含car细胞(例如cart细胞或表达car的nk细胞)的免 疫效应子功能的信号。例如在cart细胞或表达car的nk细胞中，免疫效应子 功能的实例包括溶细胞活性和辅助活性，包括分泌细胞因子。在实施方案中， 胞内信号结构域转导效应子功能信号并且指导细胞执行特化功能。尽管可以使 用完整的胞内信号结构域，但在许多情况下不需要使用完整链。使用胞内信号 结构域的截短部分到这样的程度，从而可以使用这种截短的部分替代完整链， 只要它传导效应子功能信号即可。术语“胞内信号结构域”因此意在包括胞内信 号结构域的足以传导效应子功能信号的任何截短部分。
[0274]
在一个实施方案中，胞内信号结构域可以包含初级胞内信号结构域。 示例性初级胞内信号结构域包括从应答初级刺激或抗原依赖性刺激的分子 衍生的那些结构域。在一个实施方案中，胞内信号结构域可以包含共刺激 胞内结构域。示例性共刺激胞内信号结构域包括从应答共刺激信号或抗原 非依赖性刺激的分子衍生的那些。例如，在表达car的免疫效应细胞(例如， cart细胞或表达car的nk细胞)的情况下，初级胞内信号结构域可以包 含t细胞受体的胞质序列，并且共刺激胞内信号结构域可以包含来自共同受 体或共刺激分子的胞质序列。
[0275]
初级胞内信号结构域可以包含称作基于免疫受体酪氨酸的活化基序或 itam的信号传导基序。含有itam的初级胞质信号传导序列的例子包括但不限 于衍生自cd3ζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、 cd79b、cd278(也称作“icos”)、fcεri、cd66d、dap10和dap12的那些。
[0276]
术语“ζ”或备选地“ζ链”、“cd3-ζ”或“tcr-ζ”定义为作为genban登录号 bag36664.1提供的蛋白质或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等) 的等同残基，并且“ζ刺激结构域”或备选地“cd3-ζ刺激结构域”或“tcr-ζ刺激结 构域”定义为来自ζ链胞
质结构域的氨基酸残基，所述氨基酸残基足以在功能上 传播t细胞活化必需的初始信号。在一个方面，ζ的胞质结构域包含genbank登 录号bag36664.1的残基52至残基164或作为其功能直向同源物的来自非人类物 种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在一个方面，“ζ刺激结构域
”ꢀ
或“cd3-ζ刺激结构域”是作为seq id no:9提供的序列。在一个方面，“ζ刺激结 构域”或“cd3-ζ刺激结构域”是作为seq id no:10提供的序列。
[0277]
术语“共刺激分子”指t细胞上与共刺激配体特异性结合，因而由t细胞介导 共刺激反应(如但不限于增殖)的相应结合配偶体。共刺激分子是高效免疫应答要 求的除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于： mhc i类分子、tnf受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整联蛋 白、淋巴细胞活化信号分子(slam蛋白)、活化nk细胞受体、btla、toll配体 受体、ox40、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cds、icam-1、 lfa-1(cd11a/cd18)、4-1bb(cd137)、b7-h3、cds、icam-1、icos(cd278)、gitr、baffr、light、hvem(lightr)、kirds2、slamf7、nkp80 (klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il2rβ、 il2rγ、il7rα、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、 vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11a、lfa-1、 itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、 itgb7、nkg2d、nkg2c、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、 slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9 (cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、 ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg (cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、cd19a和与cd83特异 性结合的配体。
[0278]
共刺激胞内信号结构域指共刺激分子的胞内部分。
[0279]
胞内信号结构域可以包含衍生它的分子的完整胞内部分或完整天然胞内信 号结构域或其功能性片段。
[0280]
术语“4-1bb”指tnfr超家族成员，所述成员具有作为genbank登录号 aaa62478.2提供的氨基酸序列或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿 等)的等同残基；并且“4-1bb共刺激结构域”定义为genbank登录号aaa62478.2 的氨基酸残基214-255或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等 同残基。在一个方面，“4-1bb共刺激结构域”是作为seq id no:7提供的序列 或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。
[0281]
如该术语在本文中所用那样，术语“免疫效应细胞”指参与免疫应答，例如 参与促进免疫效应子反应的细胞。免疫效应细胞的例子包括t细胞，例如，α/βt 细胞和γ/δt细胞、b细胞、天然杀伤(nk)细胞、天然杀伤t(nkt)细胞、肥大细 胞、和髓细胞衍生的吞噬细胞。
[0282]
如该术语在本文中所用那样，“免疫效应子功能或免疫效应子反应”指例如 免疫效应细胞的增强或促进免疫攻击靶细胞的功能或应答。例如，免疫效应子 功能或应答指促进杀伤靶细胞或抑制靶细胞生长或增殖的t细胞或nk细胞特 性。在t细胞的情况下，初级刺激和共刺激是免疫效应子功能或应答的例子。
[0283]
术语“效应子功能”指细胞的特化功能。t细胞的效应子功能例如可以是溶细 胞活性或辅助活性，包括分泌细胞因子。
[0284]
术语“编码”指多核苷酸如基因、cdna或mrna中特定核苷酸序列在生 物学过程中充当合成具有定义的核苷酸序列(例如，rrna、trna和mrna) 或定义的氨基酸序列的其他聚合物和大分子的模板的内在特性和因其产生 的生物学特性。因此，如果与该基因相对应的
mrna的转录和翻译在细胞 或其他生物系统中产生某蛋白质，则基因、cdna或rna编码该蛋白质。其 核苷酸序列与mrna序列相同并且通常在序列表中提供的编码链和作为基 因或cdna转录的模板使用的非编码链均可以称为编码该基因或cdna的蛋 白质或其他产物。
[0285]
除非另外说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此作为简并形式并 编码相同氨基酸序列的全部核苷酸序列。短语编码蛋白质或rna的“核苷酸序 列”还可以包括内含子到这样的程度，从而编码蛋白质的核苷酸序列可以在某个 形式中含有内含子。
[0286]
术语“有效量”或“治疗有效量”在本文中互换地使用并且指化合物、制剂、 材料或组合物如本文所述那样有效实现特定生物学结果的量。
[0287]
术语”内源”指来自生物、细胞、组织或系统或在其内部产生的任何物质。
[0288]
术语”外源”指从生物、细胞、组织或系统外部引入或在其外部产生的任何 物质。
[0289]
术语“表达”指受启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
[0290]
术语“转移载体”指物质组合物，所述物质组合物包含分离的核酸并且可以 用来向细胞的内部递送分离的核酸。众多载体是本领域已知的，包括但不限于 线性多核苷酸、与离子或两性化合物缔和的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术 语“转移载体”包括自主复制型质粒或病毒。该术语还应当解释成进一步包括促 进核酸转移入细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如，聚赖氨酸化合物、脂质 体等。病毒转移载体的例子包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转 录病毒载体、慢病毒载体等。
[0291]
术语“表达载体”指一种包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含 与待表达的核苷酸序列有效连接的表达控制序列。表达载体包含用于表达的足 够顺式作用元件；其他表达用元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中供应。 表达载体包括本领域已知的全部那些表达载体，包括并入重组多核苷酸的粘粒、 质粒(例如，裸露或含于脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒 和腺相关病毒)。
[0292]
本文所用的术语“载体”是指可用于递送和/或表达核酸分子的任何载体。 其可以是如本文所述的转移载体或表达载体。
[0293]
术语“慢病毒”指逆转录病毒科(retroviridae)的一个属。慢病毒在逆转录病 毒当中的独特之处在于能够感染非分裂性细胞；它们可以递送显著量的遗传信 息至宿主细胞的dna，从而它们是基因递送载体的最高效方法之一。hiv、siv 和fiv均是慢病毒的例子。
[0294]
术语“慢病毒载体”指从慢病毒基因组的至少一部分衍生的载体，尤其包括 如milone等人,mol.ther.17(8):1453
–
1464(2009)中提供的自我失活慢病毒载 体。可以在临床使用的慢病毒载体的其他例子例如包括但不限于来自oxfordbiomedica的基因递送技术、来自lentigen的lentimax
tm
载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也是可获得的并且是本领域技术人员已 知的。
[0295]
术语“同源的”或“同一性”指两个聚合物分子之间(例如，在两个核酸分子 (如，两个dna分子或两个rna分子之间)或在两个多肽分子之间)的亚单位序列 同一性。当这两个分子中的亚单位位置被相同单体性亚单位占据时，例如，若 两个dna分子的每个分子中的某位置被腺嘌呤占据，则它们在该位置是同源或 同一的。两个序列之间的同一性直接随匹配位置或同源位置的数目而变化，例 如，如果两个序列中一半位置(例如长度为10个亚单位的聚合物中的5个位置)是 同源的，则这两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如10个位置中9个位 置)是匹配或同源的，则这两个序列是90％同源的。
[0296]
非人类(例如，小鼠)抗体的“人源化”形式是含有从非人免疫球蛋白衍生的最 少序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如抗体的fv、fab、fab'、f(ab')2或其他抗原结合子序列)。对大部分情况而言，人源化抗体及其抗体片段 是这样的人免疫球蛋白(受者抗体或抗体片段)，其中来自所述受者的互补决定区 (cdr)中的残基替换为来自非人类物种(供者抗体)如小鼠、大鼠或兔的具有所需 特异性、亲和力和能力的cdr中的残基。在一些情况下，人免疫球蛋白的fv构 架区(fr)残基被相应的非人残基替换。另外，人源化抗体/抗体片段可以包含既 不在受者抗体中又不在输入的cdr或构架序列中存在的残基。这些修饰可以进 一步修正并优化抗体或抗体片段性能。通常，人源化抗体或其抗体片段基本上 包含至少1个、并且一般2个可变结构域的全部，其中全部或基本上全部的cdr 区与非人类免疫球蛋白的那些cdr区对应并且全部或显著部分的fr区是人免 疫球蛋白序列的那些fr区。人源化抗体或抗体片段还可以包含至少部分免疫球 蛋白恒定区(fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。对于进一步细节，参见jones 等人,nature,321:522-525,1986；reichmann等人,nature,332:323-329,1988； presta,curr.op.struct.biol.,2:593-596,1992。
[0297]“完全人(fully human)”指免疫球蛋白，如抗体或抗体片段，其中整个 分子是人来源的或由与抗体或免疫球蛋白的人类形式相同的氨基酸序列组 成。
[0298]
术语“分离的”意指从天然状态改变或取出。例如，天然存在于活动物中的 核酸或肽不是“分离的”，但是部分或完全与其天然状态的共存物质分离的相同 核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以按基本上纯化的形式存在，或 可以存在于非天然环境(例如宿主细胞)中。
[0299]
在本发明的上下文中，对常见的核酸碱基使用以下缩写。“a”指腺苷，“c
”ꢀ
指胞嘧啶，“g”指鸟苷，“t”指胸苷和“u”指尿苷。
[0300]
术语“有效连接”或“转录性控制”指调节序列和异源核酸序列之间导致异源 核酸序列表达的功能性连接。例如，当第一核酸序列置于与第二核酸序列的功 能性关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列有效连接。例如，如果启动子影 响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列有效连接。有效连接的dna序 列可以彼此邻接并且，例如，在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，处于相 同的可读框中。
[0301]
术语免疫原性组合物的“肠胃外”施用例如包括皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌 内(i.m.)或胸骨内注射、瘤内或输注技术。
[0302]
术语“核酸”、“多核苷酸”或“核酸分子”指脱氧核糖核酸(dna)或核糖核 酸(rna)，或其dna或rna的组合，及其单链形式或双链形式的聚合物。术语
ꢀ“
核酸”包括基因、cdna或mrna。在一个实施方案中，核酸分子是合成的(例 如化学合成的)或重组的。除非特别限制，否则该术语包括含有天然核苷酸的 类似物或衍生物的核酸，所述核酸具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天 然存在核苷酸相似的方式代谢。除非另外说明，特定核酸序列也内在包括其保 守方式修饰的变体(例如简并密码子置换)、等位基因、直向同源物、snp和互补 序列，以及明确指出的序列。具体而言，可以通过产生其中一个或多个选择的(或 全部)密码子的第三位置用混合型碱基和/或脱氧肌苷残基置换的序列，实现简并 密码子置换(batzer等人,nucleic acid res.19:5081,(1991)；ohtsuka等人,j.biol. chem.260:2605-2608,(1985)；和rossolini等人,mol.cell.probes 8:91-98, (1994))。
[0303]
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”互换使用并且指由通过肽键共价连接的氨基 酸残
基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸并且不限制可以构 成蛋白质或肽的序列的最大氨基酸数。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个 或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，本术语指短链，例如，所述 短链还常见地在本领域称为肽、寡肽和寡聚体，并且还指较长链，所述较长链 通常在本领域称为蛋白质，所述蛋白质存在许多类型。“多肽”例如包括多肽的 生物学活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽变体、 修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重组肽或其 组合。
[0304]
术语“启动子”指由细胞合成装置或引入的合成装置识别、为启动多核苷酸 序列特异性转录所需要的dna序列。
[0305]
术语“启动子/调节序列”指表达与启动子/调节序列有效连接的基因产物所 需要的核酸序列。在一些情况下，这个序列可以是核心启动子序列，并且在其 他情况下，这个序列还可以包括对表达基因产物所需要的增强子序列和其他调 节元件。启动子/调节序列可以例如是以组织特异性方式表达基因产物的那种。
[0306]
术语“组成型”启动子指与编码或规定基因产物的多核苷酸有效连接时，引 起基因产物在细胞中在细胞的大部分或全部生理状况下产生的核苷酸序列。
[0307]
术语“诱导型”启动子指与编码或规定基因产物的多核苷酸有效连接时，引 起基因产物在细胞中基本上仅当细胞中存在对应于该启动子的诱导物时才产生 的核苷酸序列。
[0308]
术语“组织特异性”启动子指与基因编码或规定的多核苷酸有效连接时，引 起基因产物在细胞中基本上只有细胞是与该启动子相对应的组织型的细胞才产 生的核苷酸序列。
[0309]
术语“癌相关抗原”或“肿瘤抗原”可互换地指这样的分子(一般是蛋白质、糖 或脂质)，所述分子在癌细胞表面上完整表达或作为片段表达(例如，mhc/肽) 并且可用于偏好地导引药剂至癌细胞。在一些实施方案中，肿瘤抗原是由正常 细胞和癌细胞均表达的标志物，例如，谱系标志物，例如，b细胞上的cd19或 cd123。在一些实施方案中，肿瘤抗原是与正常细胞相比在癌细胞中过量表达(例 如，与正常细胞相比1倍过量表达、2倍过量表达、3倍或更多倍过量表达)的细 胞表面分子。在一些实施方案中，肿瘤抗原是在癌细胞中不适宜合成的细胞表 面分子，例如，与正常细胞上表达的分子相比含有缺失、添加或突变的分子。 在一些实施方案中，肿瘤抗原将在癌细胞表面上完整地或作为片段(例如，mhc/ 肽)排他性表达并且在正常细胞表面上不合成或不表达。在一些实施方案中，本 发明的car包括了包含与mhc呈递的肽结合的抗原结合结构域(例如，抗体或 抗体片段)的car。通常地，衍生自内源蛋白的肽充填主要组织相容性复合物 (mhc)i类分子的凹陷，并且由cd8+t淋巴细胞上的t细胞受体(tcr)识别。 mhc i类复合物由全部有核细胞组成型表达。在癌中，病毒特异性和/或肿瘤特 异性肽/mhc复合物代表独特类别的免疫疗法用细胞表面靶。已经描述了在人白 细胞抗原(hla)-a1或hla-a2的背景下靶向从病毒或肿瘤抗原衍生的肽的tcr 样抗体(参见，例如，sastry等人,j virol.2011 85(5):1935-1942；sergeeva等人, blood,2011 117(16):4262-4272；verma等人,j immunol 2010 184(4):2156-2165；willemsen等人,gene ther 2001 8(21):1601-1608；dao等人,sci transl med2013 5(176):176ra33；tassev等人,cancer gene ther 2012 19(2):84-100)。例如， 可以从筛选文库，如人scfv
噬菌体展示文库鉴定tcr样抗体。
[0310]
如scfv的上下文中所用的术语“柔性多肽接头”或“接头”指由氨基酸如甘氨 酸和/或丝氨酸残基组成的肽接头，其中单独或组合使用所述肽接头以将可变重 链区和可变轻链区连接在一起。在一个实施方案中，柔性多肽接头是gly/ser接 头并且包含氨基酸序列(gly-gly-gly-ser)n(seq id no:38)，其中n是等于或大 于1的正整数。例如，n＝1，n＝2，n＝3，n＝4，n＝5和n＝6，n＝7，n＝8，n＝9及n＝10。 在一个实施方案中，柔性多肽接头包括但不限于(gly4ser)4(seq id no:27) 或(gly4ser)3(seq id no:28)。在另一个实施方案中，接头包括(gly2ser)、 (glyser)或(gly3ser)(seq id no:29)的多个重复。本发明的范围内还包括通过 引用的方式并入本文的wo 2012/138475中描述的接头。
[0311]
如本文所用，5'帽(也称作rna帽、rna 7-甲基鸟苷帽或rna m7g帽)是紧 接在转录起始后添加至真核信使rna“前端”或5'末端的修饰的鸟嘌呤核苷酸。 5'帽由与第一个转录的核苷酸连接的端基组成。其存在对核糖体识别并保护免遭 rna酶作用至关重要。帽添加与转录偶联并且以共转录方式出现，从而每一者 影响另一者。在转录起始后不久，正在合成的mrna的5'末端被结合于rna聚 合酶的帽合成复合物结合。这种酶促复合物催化mrna加帽需要的化学反应。 合成过程作为多步骤生物化学反应推进。可以修饰加帽部分以调节mrna的功 能，如其稳定性或翻译效率。
[0312]
如本文所用，“体外转录的rna”指已经在体外合成的rna，优选地mrna。 通常，体外转录的rna从体外转录载体产生。体外转录载体包含用来产生体外 转录的rna的模板。
[0313]
如本文所用，“聚腺苷酸”是通过多聚腺苷化与mrna连接的一系列腺苷。 在瞬时表达构建体的优选实施方案中，聚腺苷酸数在50和5000之间(seq id no: 30)、优选地大于64、更优选地大于100、最优选地大于300或400。可以化学或 酶促地修饰聚腺苷酸序列以调节mrna功能如定位、稳定性或翻译效率。
[0314]
如本文所用，“多聚腺苷化”指聚腺苷酰基部分或其修饰变体与信使rna分 子的共价连接。在真核生物中，大部分信使rna(mrna)分子在3'末端聚腺苷酸 化。3'聚腺苷酸尾是通过酶(聚腺苷酸聚合酶)的作用添加至前mrna的长腺嘌呤 核苷酸序列(经常几百个)。在高等真核生物中，聚腺苷酸尾添加到含有特定序列 (多聚腺苷化信号)的转录物上。聚腺苷酸尾和与之结合的蛋白质协助保护mrna 免遭核酸外切酶降解。多聚腺苷化还对转录终止、mrna从胞核输出和翻译重 要。多聚腺苷化在dna转录成rna后立即在胞核中发生，但额外地还可以稍后 在细胞质中发生。在转录已经终止后，通过与rna聚合酶结合的核酸内切酶复 合体的作用而切割mrna链。剪切位点通常以剪切位点附近存在碱基序列 aauaaa为特征。在已经剪切mrna后，腺苷残基添加至剪切位点处的游离3
’ꢀ
末端。
[0315]
如本文所用，“瞬时”指非整合的转基因表达数小时、数天或数周时间，其 中表达时间段小于如果基因在宿主细胞中整合至基因组中或含于稳定质粒复制 子内部时该基因表达的时间段。
[0316]
如本文所用，术语“治疗”、“疗法”和“治疗着”指减少或减轻增殖性疾病的 进展、严重程度和/或持续时间或改善增殖性疾病的一种或多种症状(优选地，一 种或多种可察觉症状)，其原因在于施用一种或多种疗法(例如，一个或多个治疗 药，如本发明的car)。在具体实施方案中，术语“治疗”、“疗法”和“治疗着”指 改善增殖性疾病的至少一个可度量的身体参数，如肿瘤生长，所述身体参数不 必然地由患者可辨识。在其他实施方案中，术语
“
治疗”、“疗法”和“治疗着”指 在身体上(例如通过稳定可察觉症状)、生理上(例如通过稳定身体参数)或这两方 抑制增殖性疾病的进展。在其他实施方案中，术语“治疗”、“疗法”和“治疗着
”ꢀ
指减少或稳定肿瘤尺寸或癌细胞计数。
[0317]
术语“信号转导途径”指在从细胞一个部分传播信号至细胞的另一个部分中 发挥作用的多种信号转导分子之间的生物化学关系。短语“细胞表面受体”包括 能够接收信号和跨细胞膜传输信号的分子和分子复合物。
[0318]
术语“受试者”意在包括其中可以激发免疫应答的活生物(例如，哺乳动物、 人)。
[0319]
术语“基本上纯化的”细胞指基本上不含其他细胞类型的细胞。基本上纯化 的细胞还指已经与其天然存在状态下通常与之结合的其他细胞类型分离的细 胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群体指均一的细胞群体。在其他情况下， 这个术语单纯地指已经与其天然状态下天然与它们结合的细胞分离的细胞。在 一些方面，细胞是体外培养的。在其他方面，细胞不是体外培养的。
[0320]
如本文所用的术语“治疗性”意指治疗。通过获得减少、抑制、缓解或根除 疾病状态获得治疗效果。
[0321]
如本文所用的术语“预防”意指预防或保护性治疗疾病或疾病状态。
[0322]
在本发明的上下文中，“肿瘤抗原”或“过度增殖性疾病抗原”或“与过度增殖 性疾病相关的抗原”指具体过度增殖性疾病共有的抗原。在某些方面，本发明的 过度增殖性疾病抗原衍生自癌，所述癌包括但不限于原发性或转移性黑素瘤、 胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、白 血病、子宫癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌和腺癌如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、 胰腺癌等。
[0323]
术语“转染”或“转化”或“转导”指借以将外源核酸转移或引入宿主细胞的过 程。“转染”或“转化”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细 胞。细胞包括原代主题细胞和其后代。
[0324]
术语“特异性结合”指识别样品中存在的相应结合配偶体(例如，t细胞上存 在的刺激分子和/或共刺激分子)蛋白质并与之结合的抗体或配体、但是所述抗体 或配体基本上不识别或结合样品中其他分子。
[0325]
如本文所用，“可调节的嵌合抗原受体(rcar)”指一组多肽，最简单的实施 方案中一般指两种多肽，在免疫效应细胞中时，所述多肽为细胞提供针对靶细 胞(一般是癌细胞)的特异性及提供可调节的胞内信号生成。在一些实施方案中， rcar至少包含胞外抗原结合结构域、跨膜和胞质信号结构域(本文也称作“胞内 信号结构域”)，所述胞质信号结构域包含从如本文在car分子背景下定义的刺 激分子和/或共刺激分子衍生的功能性信号结构域。在一些实施方案中，rcar 中的该组多肽彼此不邻接，例如，处于不同的多肽链中。在一些实施方案中， rcar包括二聚化开关，其中存在二聚化分子时，所述二聚化开关可以使多肽 彼此偶联，例如，可以使抗原结合结构域与胞内信号结构域偶联。在一些实施 方案中，rcar在如本文所述的细胞(例如，免疫效应细胞)(例如，表达rcar 的细胞(本文也称作“rcarx细胞”)中表达。在一个实施方案中，rcarx细胞 是t细胞并且称作rcart细胞。在一个实施方案中，rcarx细胞是nk细胞并 且称作rcarn细胞。rcar可以为表达rcar的细胞提供针对靶细胞(一般是癌 细胞)的特异性及提供可调节性胞内信号生成或增殖，所述多肽可以优化表达 rcar的细胞的免疫效应子特性。在实施方案中，rcar细胞至少部分地依赖抗 原
结合结构域以提供针对靶细胞的特异性，所述靶细胞包含抗原结合结构域结 合的抗原。
[0326]
如该术语在本文中所用那样，“膜锚定物”或“膜束缚结构域”指足以锚定胞 外或胞内结构域至质膜的多肽或部分，例如，肉豆蔻酰基。
[0327]
如该术语在本文中所用那样，例如指rcar时，“开关结构域”指存在 二聚化分子时与另一个开关结构域缔合的实体，一般是基于多肽的实体。 缔合导致与第一开关结构域连接(例如，融合)的第一实体和与第二开关结构 域连接(例如，融合)的第二实体功能性偶联。第一开关结构域和第二开关结 构域统称为二聚化开关。在实施方案中，第一开关结构域和第二开关结构 域彼此相同，例如，它们是具有相同一级氨基酸序列的多肽并统称为同二 聚化开关。在实施方案中，第一开关结构域和第二开关结构域彼此不同， 例如，它们是具有不同一级氨基酸序列的多肽并统称为异二聚化开关。在 实施方案中，开关是胞内的。在实施方案中，开关是胞外的。在实施方案 中，开关结构域是基于多肽(例如，基于fkbp或frb)的实体，并且二聚化 分子是小分子，例如，雷帕霉素类似物(rapalogue)。在实施方案中，开关 结构域是基于多肽的实体，例如，结合myc肽的scfv，并且二聚化分子是多 肽、其片段、或多肽多聚体，例如，myc配体或与一个或多个myc scfv结合 的myc配体多聚体。在实施方案中，开关结构域是基于多肽的实体，例如， myc受体，并且二聚化分子是抗体或其片段，例如，myc抗体。
[0328]
如该术语在本文中所用那样，例如谈及rcar时，“二聚化分子”指促 进第一开关结构域与第二开关结构域缔合的实体。在实施方案中，二聚化 分子不天然地出现在受试者中或不以将导致明显二聚化的浓度出现。在实施方 案中，二聚化分子是小分子，例如，雷帕霉素或雷帕霉素类似物，例如rad001。
[0329]
术语“生物等效的”指为产生与参比化合物的参比剂量或参比量(例如， rad001)产生的效果等同的效果所需要的除参比化合物(例如，rad001)之外的 药剂量。在一个实施方案中，效果是mtor抑制水平，例如，如通过p70s6激 酶抑制作用所测量，例如，如在体内或体外测定法中评价，例如，如通过本文 所述的测定法(例如，boulay测定法)所测量、或通过蛋白质印迹法测量磷酸化s6 水平。在一个实施方案中，效果是pd-1阳性/pd-1阴性免疫效应细胞(例如，t细 胞或nk细胞)的比率改变，如通过细胞分选法所测量。在一个实施方案中， mtor抑制剂的生物等效量或剂量是实现与参比化合物的参比剂量或参比量相 同的p70s6激酶抑制水平的量或剂量。在一个实施方案中，mtor抑制剂的生 物等效量或剂量是实现与参比化合物的参比剂量或参比量相同的pd-1阳性 /pd-1阴性免疫效应细胞(例如，t细胞或nk细胞)比率改变水平的量或剂量。
[0330]
联系mtor抑制剂(例如，变构性mtor抑制剂，例如，rad001或雷帕霉 素、或催化性mtor抑制剂)使用时，术语“免疫增强性低剂量”指(例如，如通过 抑制p70s6激酶活性所测量)部分地但非完全抑制mtor活性的mtor抑制剂剂 量。本文中讨论了用于(例如，通过抑制p70s6激酶)评价mtor活性的方法。该 剂量不足以导致完全的免疫抑制，但是足以增强免疫应答。在一个实施方案中， mtor抑制剂的免疫增强性低剂量导致pd-1阳性免疫效应细胞(例如，t细胞或 nk细胞)的数目减少和/或pd-1阴性免疫效应细胞(例如，t细胞或nk细胞)的数 目增加、或pd-1阴性t细胞/pd-1阳性免疫效应细胞，例如，t细胞或nk细胞) 的比率增加。
[0331]
在一个实施方案中，mtor抑制剂的免疫增强性低剂量导致原初免疫效应 细胞，例
如t细胞或nk细胞的数目增加。在一个实施方案中，mtor抑制剂的 免疫增强性低剂量导致以下一种或多种情况：
[0332]
以下一种或多种标志物的表达增加：例如，在记忆t细胞(例如，记忆t细胞 前体)上的cd62l
高
、cd127
高
、cd27
+
和bcl2；
[0333]
例如记忆t细胞(例如，记忆t细胞前体)上klrg1的表达减少；和
[0334]
记忆t细胞前体的数目增加，所述记忆t细胞前体例如是具有以下特征 的任一个特征或组合特征的细胞：cd62l
高
增加、cd127
高
增加、cd27
+
增 加、klrg1减少和bcl2增加；
[0335]
其中例如，如与未处理的受试者相比，上文描述的任何变化出现，例 如，至少暂时出现。
[0336]
如本文所用的“难治性”，指不响应于治疗的疾病，例如，癌症。在实 施方案中，难治性癌症可以在治疗开始前或在治疗开始时抵抗治疗。在其 他实施方案中，难治性癌症可以在治疗期间变得耐药。难治性癌症也称作 耐药性癌症。
[0337]
如本文所用的“复发的”或“复发”指在改善或反应阶段后，例如，在某 疗法(例如，癌疗法)的既往治疗后，疾病(例如，癌症)或疾病(如癌症)的体 征和症状返回或复现。初始反应阶段可以涉及癌细胞水平降到某个阈值以 下，例如，低于20％、1％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。复现可以 涉及癌细胞水平升高到某个阈值以上，例如，高于20％、1％、10％、5％、 4％、3％、2％或1％。例如，例如在b-all的情况下，复现可能涉及例如 在完全反应后血液、骨髓中的母细胞再现(>5％)或任何髓外部位中的母 细胞再现。在这种情况下，完全反应可能涉及<5％bm母细胞。更一般地， 在一个实施方案中，反应(例如，完全反应或部分反应)可以涉及不存在 可检测的mrd(最小残留疾病)。在一个实施方案中，初始反应阶段持续 至少1、2、3、4、5或6天；至少1周、2周、3周或4周；至少1、2、3、4、6、 8、10或12个月；或至少1年、2年、3年、4年或5年。
[0338]
在一些实施方案中，包括cd19抑制剂(例如cd19 car疗法)的疗法 可能复发或难以治疗。复发或抗性可由cd19缺失(例如，抗原缺失突变) 或降低cd19水平的其它cd19改变引起(例如，由cd19阴性克隆的克隆选 择引起)。包含此类cd19缺失或改变的癌症在本文中称为“cd19阴性癌 症”或“cd19阴性复发性癌症”)。应当理解，cd19阴性癌症不需要cd19 的100％缺失，而是足以降低cd19疗法有效性的减少，使得癌症复发或变 得难治。在一些实施方案中，cd19阴性癌症源自cd19 car疗法。
[0339]
范围：在本公开各处，本发明的多个方面可以按范围样式展示。应当理解， 以范围样式描述仅出于方便和简洁目的并且不应当解释为刚性限制本发明的范 围。因此，范围的描述应当视为具有具体公开的全部可能子范围以及该范围内 部的各个数值。例如，范围如从1至6的描述应当视为具有具体公开的如下子 范围，如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以 及该范围内部的各个数值，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。作为另一个 例子，范围(如95-99％同一性)包括具有95％、96％、97％、98％或99％同一性 的范围，并且包括子范围如96-99％、96-98％、96-97％、97-99％、97-98％和 98-99％同一性。无论范围的宽度多大，这均适用。
[0340]
发明描述
[0341]
本文中提供了使用cd123嵌合抗原受体(car)治疗或预防疾病(如癌症)的 物质组合物和使用方法。
[0342]
在一个方面，本发明提供众多嵌合抗原受体(car)，所述嵌合抗原受体包 含经工程化与cd123蛋白或其片段特异性结合的抗体或抗体片段。在一个方面， 本发明提供经工程化以表达car的细胞(例如，免疫效应细胞，例如，t细胞或 nk细胞)，其中表达car的细胞(例如，“cart”或表达car的nk细胞)显示出 抗肿瘤特性。在一个方面，细胞用car转化并且car的至少一部分在细胞表面 上表达。在一些实施方案中，细胞(例如，免疫效应细胞，例如，t细胞或nk细 胞)用编码car的病毒载体转导。在一些实施方案中，病毒载体是逆转录病毒载 体。在一些实施方案中，病毒载体是慢病毒载体。在一些此类实施方案中，细 胞可以稳定表达car。在另一个实施方案中，细胞(例如，免疫效应细胞，例如， t细胞或nk细胞)用编码car的核酸例如mrna、cdna、dna转染。在一些此 类实施方案中，细胞可以瞬时表达car。
[0343]
在一个方面，car的cd123结合结构域(例如，人或人源化cd123结合结构 域)是scfv抗体片段。在一个方面，这类抗体片段是有功能的，因为它们保留等 价的结合亲和力，例如，它们以可比的功效结合相同的抗原，它们是例如具有 相同重链可变区和轻链可变区的igg抗体。在一个方面，这类抗体片段是有功能 的，因为它们提供生物学应答，所述生物学应答可以包括但不限于激活免 疫应答、抑制源自其靶抗原的信号转导、抑制激酶活性等，如技术人员将 会理解。
[0344]
在一些方面，本发明的抗体并入嵌合抗原受体(car)中。在一个方面， car包含本文中作为seq id nos:98-101和125-156提供的多肽序列。
[0345]
在一个方面，本发明car的cd123结合结构域(例如，人源化或人 cd123结合结构域)部分由其序列已经过密码子优化以便在哺乳动物细胞中 表达的转基因编码。在一个方面，本发明的完整car构建体由其整个序列 已经过密码子优化以便在哺乳动物细胞中表达的转基因编码。密码子优化 指以下发现：编码性dna中同义密码子(即，编码相同氨基酸的密码子)出 现的频率在不同物种中偏倚。这种密码子简并性允许相同多肽由多种核苷 酸序列编码。多种密码子优化方法是本领域已知的，并且包括例如至少在 美国专利号5,786,464和6,114,148中公开的方法。
[0346]
在一个方面，car的抗原结合结构域包含人cd123抗体或抗体片段。 在一个方面，car的抗原结合结构域包含人源化cd123抗体或抗体片段。 在一个方面，car的抗原结合结构域包含人cd123抗体片段，所述抗体片 段包含scfv。在一个方面，car的抗原结合结构域是人cd123 scfv。在一 个方面，car的抗原结合结构域包含人源化的cd123抗体片段，所述人源 化的cd123抗体片段包含scfv。在一个方面，car的抗原结合结构域是人 源化的cd123 scfv。
[0347]
在一个方面，car123结合结构域包含seq id no：157-160和184-215 中提供的scfv部分。在一个方面，scfv部分是人的。在一个方面，人car123 结合结构域包含seq id no：157-160中提供的scfv部分。在一个方面，人 cd123结合结构域包含seq id no：157中提供的scfv部分。在一个方面， 人cd123结合结构域包含seq id no：158中提供的scfv部分。在一个方面， 人cd123结合结构域包含seq id no：159中提供的scfv部分。在一个方面， 人cd123结合结构域包含seq id no：160中提供的scfv部分。在一个方面， 人cd123结合结构域包含seq id no：478中提供的scfv部分。在一个方面， 人cd123结合结构域包含seq id no：480中提供的scfv部分。在一个方面，人 cd123结合结构域包含seq id no：483中提供的scfv部分。在一个方面，人 cd123结合结构域包含seq id no：485中提供的scfv部分。
[0348]
在一个方面，scfv部分是人源化的。在一个方面，人源化car123结合结构 域包含seq id no：184-215中提供的scfv部分。在一个方面，人源化cd123结 合结构域包含seq id no：184中提供的scfv部分。在一个方面，人源化cd123 结合结构域包含seq id no：185中提供的scfv部分。在一个方面，人源化cd123 结合结构域包含seq id no：186中提供的scfv部分。在一个方面，人源化cd123 结合结构域包含seq id no：187中提供的scfv部分。在一个方面，人源化cd123 结合结构域包含seq id no：188中提供的scfv部分。在一个方面，人源化cd123 结合结构域包含seq id no：189中提供的scfv部分。在一个方面，人源化cd123 结合结构域包含seq id no：190中提供的scfv部分。在一个方面，人源化cd123 结合结构域包含seq id no：191中提供的scfv部分。在一个方面，人源化cd123 结合结构域包含seq id no：192中提供的scfv部分。在一个方面，人源化cd123 结合结构域包含seq id no：193中提供的scfv部分。在一个方面，人源化cd123 结合结构域包含seq id no：194中提供的scfv部分。在一个方面，人源化cd123 结合结构域包含seq id no：195中提供的scfv部分。在一个方面，人源化cd123 结合结构域包含seq id no：196中提供的scfv部分。在一个方面，人源化cd123 结合结构域包含seq id no：197中提供的scfv部分。在一个方面，人源化cd123 结合结构域包含seq id no：198中提供的scfv部分。在一个方面，人源化cd123 结合结构域包含seq id no：199中提供的scfv部分。在一个方面，人源化cd123 结合结构域包含seq id no：200中提供的scfv部分。在一个方面，人源化cd123 结合结构域包含seq id no：201中提供的scfv部分。在一个方面，人源化cd123 结合结构域包含seq id no：202中提供的scfv部分。在一个方面，人源化cd123 结合结构域包含seq id no：203中提供的scfv部分。在一个方面，人源化cd123 结合结构域包含seq id no：204中提供的scfv部分。在一个方面，人源化cd123 结合结构域包含seq id no：205中提供的scfv部分。在一个方面，人源化cd123 结合结构域包含seq id no：206中提供的scfv部分。在一个方面，人源化cd123 结合结构域包含seq id no：207中提供的scfv部分。在一个方面，人源化 cd123结合结构域包含seq id no：208中提供的scfv部分。在一个方面， 人源化cd123结合结构域包含seq id no：209中提供的scfv部分。在一个 方面，人源化cd123结合结构域包含seq id no：210中提供的scfv部分。 在一个方面，人源化cd123结合结构域包含seq id no：211中提供的scfv 部分。在一个方面，人源化cd123结合结构域包含seq id no：212中提供 的scfv部分。在一个方面，人源化cd123结合结构域包含seq id no：213 中提供的scfv部分。在一个方面，人源化cd123结合结构域包含seq idno：214中提供的scfv部分。在一个方面，人源化cd123结合结构域包含 seq id no：215中提供的scfv部分。在一个方面，人源化cd123结合结构 域包含seq id no：556-587中提供的scfv部分。
[0349]
另外，本发明提供cd123 car组合物和它们在治疗涉及表达cd123的 细胞或组织的癌症或任何恶性肿瘤或自身免疫疾病等疾病的药物或方法中 的用途。
[0350]
在一个方面，本发明car可以用来根除表达cd123的正常细胞，因而 适于作为细胞移植之前的细胞整备疗法使用。在一个方面，表达cd123的 正常细胞是表达cd123的髓样祖先细胞并且细胞移植是干细胞移植。
[0351]
在一个方面，本发明提供经工程化以表达本发明嵌合抗原受体(例如， 表达car的免疫效应细胞，例如，cart或表达car的nk细胞)的细胞(例 如，免疫效应细胞，例如，t细胞或nk细胞)，其中细胞(例如，“cart”) 显示出抗肿瘤特性。因此，本发明提供了包含cd123结
合结构域并经工程 化入免疫效应细胞，例如，t细胞或nk细胞中的cd123-car和它们用于过 继疗法的方法。
[0352]
在一个方面，cd123-car包含至少一个胞内结构域，例如，本文所述的胞 内结构域，例如，选自cd137(4-1bb)信号结构域、cd28信号结构域、cd3ζ 信号结构域及其任意组合的胞内结构域。在一个方面，cd123-car包含来自除 cd137(4-1bb)或cd28之外的一个或多个共刺激分子的至少一个胞内信号结构 域。
[0353]
嵌合抗原受体(car)
[0354]
本发明包括重组dna构建体，所述重组dna构建体包含编码car的序 列，其中car包含特异性结合cd123或其片段，例如特异性结合人cd123的 抗原结合结构域(例如抗体，抗体片段)，其中cd123结合结构域(例如，抗 体或抗体片段)的序列是，例如与编码胞内信号结构域的核酸序列邻接并在相 同的阅读框中。胞内信号结构域可以包含共刺激信号结构域和/或初级信号结构 域，例如ζ链。共刺激信号结构域是指car的一部分，所述car的一部分包 含共刺激分子的胞内结构域的至少一部分。
[0355]
在具体方面，本发明的car构建体包含了选自seq id no:157-160、 184-215、478、480、483、485和556-587的scfv结构域，其中scfv可以前置有如 seq id no:1中提供的任选前导序列并后跟有如seq id no:2或seq id no: 3或seq id no:4或seq id no:5中提供的任选铰链序列、如seq id no:6中 提供的跨膜区、包含seq id no:7或seq id no:8的胞内信号结构域和包含 seq id no:9或seq id no:10的cd3ζ序列，例如，其中各结构域彼此邻接并 处于相同的可读框以形成单个融合蛋白。在一些实施方案中，scfv结构域是选 自seq id no：157-160、478、480、483和485的人scfv结构域。在一些实施方 案中，scfv结构域是选自seq id no：184-215和556-587的人源化scfv结构域。 本发明中还包括这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码选自seq id no: 157-160、184-215、478、480、483、485和556-587的scfv片段每者的多肽。本 发明中还包括这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码选自seq id no: 157-160、184-215、478、480、483、485和556-587的scfv片段每一者和seq id no: 1、2和6-9的结构域每一者的多肽，外加所编码的本发明cd123 car。
[0356]
在一个方面，示例性cd123 car构建体包含任选的前导序列、胞外抗原结 合结构域、铰链、跨膜结构域和胞内刺激结构域。在一个方面，示例性cd123 car构建体包含任选的前导序列、胞外抗原结合结构域、铰链、跨膜结构域、 胞内共刺激结构域和胞内刺激结构域。
[0357]
在一些实施方案中，本文还将全长cd123 car序列作为seq id no: 98-101和125-156提供，如表2或6中所示。
[0358]
将示例性前导序列作为seq id no:1提供。将示例性铰链/间隔序列作为 seq id no:2或seq id no:3或seq id no:4或seq id no:5提供。将示例性 跨膜结构域序列作为seq id no:6提供。将4-1bb蛋白的胞内信号结构域的示 例性序列作为seq id no:7提供。将cd27的胞内信号结构域的示例性序列作为 seq id no:8提供。将示例性cd3ζ结构域序列作为seq id no:9或seq id no: 10提供。将cd28的胞内信号结构域的示例性序列作为seq id no:43提供。将 icos的胞内信号结构域的示例性序列作为seq id no:45提供。
[0359]
在一个方面，本发明涵盖一种重组核酸构建体，其包含编码car的核酸分 子，其中核酸分子包含编码(例如，本文所述的)cd123结合结构域的核酸序列， 例如，所述核酸序列
与编码胞内信号结构域的核酸序列邻接并处于与之相同的 可读框内。在一个方面，人cd123结合结构域选自seq id no:157-160、184-215、 478、480、483、485和556-587的一者或多者。在一些实施方案中，cd123结合 结构域是选自seq id nos:157-160、478、480、483和485的人cd123结合结构 域。在一些实施方案中，cd123结合结构域是选自seq id nos:184-215和 556-587的人源化cd123结合结构域。在一个方面，cd123结合结构域是seq idno:157。在一个方面，cd123结合结构域是seq id no:158。在一个方面， cd123结合结构域是seq id no:159。在一个方面，cd123结合结构域是seqid no:160。在一个方面，cd123结合结构域是seq id no:184。在一个方面， cd123结合结构域是seq id no:185。在一个方面，cd123结合结构域是seqid no:186。在一个方面，cd123结合结构域是seq id no:187。在一个方面， cd123结合结构域是seq id no:188。在一个方面，cd123结合结构域是seqid no:189。在一个方面，cd123结合结构域是seq id no:190。在一个方面， cd123结合结构域是seq id no:191。在一个方面，cd123结合结构域是seqid no:192。在一个方面，cd123结合结构域是seq id no:193。在一个方面， cd123结合结构域是seq id no:194。在一个方面，cd123结合结构域是seqid no:195。在一个方面，cd123结合结构域是seq id no:196。在一个方面， cd123结合结构域是seq id no:197。在一个方面，cd123结合结构域是seqid no:198。在一个方面，cd123结合结构域是seq id no:199。在一个方面， cd123结合结构域是seq id no:200。在一个方面，cd123结合结构域是seq id no:201。在一个方面，cd123结合结构域是seq id no:202。在一个方面， cd123结合结构域是seq id no:203。在一个方面，cd123结合结构域是seqid no:204。在一个方面，cd123结合结构域是seq id no:205。在一个方面， cd123结合结构域是seq id no:206。在一个方面，cd123结合结构域是seqid no:207。在一个方面，cd123结合结构域是seq id no:208。在一个方面， cd123结合结构域是seq id no:209。在一个方面，cd123结合结构域是seqid no:210。在一个方面，cd123结合结构域是seq id no:211。在一个方面， cd123结合结构域是seq id no:212。在一个方面，cd123结合结构域是seqid no:213。在一个方面，cd123结合结构域是seq id no:213。在一个方面， cd123结合结构域是seq id no:215。在一个方面，cd123结合结构域是seqid no:478。在一个方面，cd123结合结构域是seq id no:480。在一个方面， cd123结合结构域是seq id no:483。在一个方面，cd123结合结构域是seqid no:485。
[0360]
在一个方面，本发明涵盖一种重组核酸构建体，其包含编码car的核酸分 子，其中核酸分子包含编码cd123结合结构域的核酸序列，其中该序列与编码 胞内信号结构域的核酸序列邻接并处于与之相同的可读框内。可以在car中使 用的示例性胞内信号结构域包括但不限于例如cd3-ζ、cd28、4-1bb、icos等 中的一个或多个胞内信号结构域。在一些情况下，car可以包含cd3-ζ、cd28、 4-1bb、icos等的任何组合。
[0361]
在一个方面，本发明car构建体的核酸序列选自seq id no:39-42和66-97 的一者或多者。在一个方面，car构建体的核酸序列包含(例如，由以下组成) seq id no：39。在一个方面，car构建体的核酸序列包含(例如，由以下组成) seq id no：40。在一个方面，car构建体的核酸序列包含(例如，由以下组成) seq id no：41。在一个方面，car构建体的核酸序列包含(例如，由以下组成) seq id no：42。在一个方面，car构建体的核酸序列包含(例如，由以下组成) seq id no：66。在一个方面，car构建体的核酸序列包含(例如，由以下组成) seq id no：67。在一个方面，car构建体的核酸序列包含(例如，由以下组成) seq id no：
68。在一个方面，car构建体的核酸序列包含(例如，由以下组成) seq id no：69。在一个方面，car构建体的核酸序列包含(例如，由以下组成) seq id no：70。在一个方面，car构建体的核酸序列包含(例如，由以下组成) seq id no：71。在一个方面，car构建体的核酸序列包含(例如，由以下组成) seq id no：72。在一个方面，car构建体的核酸序列包含(例如，由以下组成) seq id no：73。在一个方面，car构建体的核酸序列包含(例如，由以下组成) seq id no：74。在一个方面，car构建体的核酸序列包含(例如，由以下组成) seq id no：75。在一个方面，car构建体的核酸序列包含(例如，由以下组 成)seq id no:76。在一个方面，car构建体的核酸序列包含(例如，由以下组 成)seq id no:77。在一个方面，car构建体的核酸序列包含(例如，由以下组 成)seq id no:78。在一个方面，car构建体的核酸序列包含(例如，由以下组 成)seq id no:79。在一个方面，car构建体的核酸序列包含(例如，由以下组 成)seq id no:80。在一个方面，car构建体的核酸序列包含(例如，由以下组 成)seq id no:81。在一个方面，car构建体的核酸序列包含(例如，由以下组 成)seq id no:82。在一个方面，car构建体的核酸序列包含(例如，由以下组 成)seq id no:83。在一个方面，car构建体的核酸序列包含(例如，由以下组 成)seq id no：84。在一个方面，car构建体的核酸序列包含(例如，由以下 组成)seq id no：85。在一个方面，car构建体的核酸序列包含(例如，由以 下组成)seq id no：86。在一个方面，car构建体的核酸序列包含(例如，由 以下组成)seq id no：87。在一个方面，car构建体的核酸序列包含(例如， 由以下组成)seq id no：88。在一个方面，car构建体的核酸序列包含(例如， 由以下组成)seq id no：89。在一个方面，car构建体的核酸序列包含(例如， 由以下组成)seq id no：90。在一个方面，car构建体的核酸序列包含(例如， 由以下组成)seq id no：91。在一个方面，car构建体的核酸序列包含(例如， 由以下组成)seq id no：92。在一个方面，car构建体的核酸序列包含(例如， 由以下组成)seq id no：93。在一个方面，car构建体的核酸序列包含(例如， 由以下组成)seq id no:94。在一个方面，car构建体的核酸序列包含(例如， 由以下组成)seq id no:95。在一个方面，car构建体的核酸序列包含(例如， 由以下组成)seq id no:96。在一个方面，car构建体的核酸序列包含(例如， 由以下组成)seq id no:97。可以使用本领域已知的重组方法获得编码所需分 子的核酸序列，如，例如通过从表达该基因的细胞筛选文库、通过从已知包括 该基因的载体衍生该基因、或通过使用标准技术从含有该基因的细胞和组织直 接分离。备选地，可以合成地产生目的核酸，而非克隆。
[0362]
本发明包括表达可以直接转导入细胞中的car的逆转录病毒载体构建体和 慢病毒载体构建体。
[0363]
本发明还包括可以直接转染至细胞中的rna构建体。一种产生用于转染的 mrna的方法涉及用专门设计的引物体外转录(ivt)模板，随后添加聚腺苷酸， 以产生含有3’和5’非翻译序列(“utr”)、5’帽和/或内部核糖体进入位点(ires)、 待表达核酸和长度一般为50-2000个碱基的聚腺苷酸化尾(seq id no:35)的构 建体。如此产生的rna可以高效地转染不同种类的细胞。在一个实施方案中， 模板包括car的序列。在一个实施方案中，将rna car载体通过电穿孔转导 至细胞中。
[0364]
抗原结合结构域
[0365]
在一个方面，发明的car包含靶特异性结合元件，另外称为抗原结合结构 域。部分的选择取决于定义靶细胞表面的配体的类型和数目。例如，可以选择 抗原结合结构域以识
别充当靶细胞上与具体疾病状态相关的细胞表面标志物的 配体。
[0366]
在一个方面，可以通过将特异性结合所需抗原的抗原结合结构域工程化入 car中，将car介导的t细胞应答指向目的抗原。
[0367]
在一个方面，包含抗原结合结构域的car部分包含靶向cd123或其片段的 抗原结合结构域。在一个方面，抗原结合结构域靶向人cd123或其片段。
[0368]
抗原结合结构域可以是与抗原结合的任何结构域，所述结构域包括但不限 于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体及其功能性片段， 包括但不限于单一结构域抗体，如驼类衍生型纳米体的重链可变结构域(vh)、 轻链可变结构域(vl)和可变结构域(vhh)，以及本领域已知的作为抗原结合结 构域发挥作用的备选支架，如重组纤连蛋白结构域等。在一些情况下，从将会 最终使用car的相同物种衍生有益于抗原结合结构域。例如，对于人类中使用， 包含抗体或抗体片段的抗原结合结构域的人残基或人源化残基可能有益于car 的抗原结合结构域。
[0369]
在一些情况下，从将会最终使用car的相同物种衍生有益于抗原结合结构 域。例如，对于人类中使用，包含抗体或抗体片段的抗原结合结构域的人残基 或人源化残基可能有益于car的抗原结合结构域。因此，在一个方面，抗原结 合结构域包含人抗体或抗体片段。在一个实施方案中，人cd123结合结构域包 含本文所述的人cd123结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)轻链互补决定 区1(lc cdr1)、轻链互补决定区2(lc cdr2)和轻链互补决定区3(lc cdr3)、 和/或本文所述的人cd123结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)重链互补 决定区1(hc cdr1)、重链互补决定区2(hc cdr2)和重链互补决定区3(hccdr3)，例如，包含一个或多个(例如，全部三个)lc cdr和一个或多个(例如， 全部三个)hc cdr的人cd123结合结构域。在一个实施方案中，人cd123结合 结构域包含本文所述的人cd123结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)重链 互补决定区1(hc cdr1)、重链互补决定区2(hc cdr2)和重链互补决定区3 (hc cdr3)，例如，人cd123结合结构域具有两个可变重链区域，各自包含本 文所述的hc cdr1、hc cdr2和hc cdr3。在一个实施方案中，人cd123结 合结构域包含本文(例如，表2或9中)所述的人轻链可变区和/或本文(例如，表2 或9中)所述的人重链可变区。在一个实施方案中，人抗cd19结合结构域包含本 文(例如，表2或9中)所述的人重链可变区，例如本文(例如，表2或9中)所述的至 少两个人重链可变区。在一个实施方案中，cd123结合结构域是包含表2或9的 氨基酸序列的轻链和重链的scfv。在一个实施方案中，cd123结合结构域(例如， scfv)包含轻链可变区，所述轻链可变区包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列 具有至少一个、两个或三个表2或9中提供的轻链可变区的氨基酸序列的修饰(例 如置换)，但不多于30、20或10个修饰(例如置换)，或包含与表2的氨基酸序列具 有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，所述重链可变区包含下述氨基酸序 列，所述氨基酸序列具有至少一个、两个或三个在表2或9中提供的重链可变区 的氨基酸序列的修饰(例如置换)，但不多于30、20或10个修饰(例如置换)，或包 含与表2或9的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，人 cd123结合结构域包含选自seq id no:157-160、478、480、483和485的序列 或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，人cd123结合结构域是 scfv，并且包含本文(例如，表2或9中)所述的氨基酸序列的轻链可变区经接头(例 如，本文所述的接头)与包含本文(例如，表2中)所述的氨基酸序列的重链可变区 连接。在一个实施方案中，人的cd123结合结构域包含(gly4-ser)n接
头，其中n 是1、2、3、4、5或6、优选地3或4(seq id no:26)。scfv的轻链可变区和重链 可变区可以例如处于以下任何取向：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区
ꢀ-
接头-轻链可变区。
[0370]
在一些方面，非人抗体是人源化的，其中修饰抗体的特定序列或区域以增 加与人中天然产生的抗体或其片段的相似性。因此，在一个方面，抗原结合结 构域包含人源化抗体或抗体片段。在一个实施方案中，人源化cd123结合结构 域包含本文所述的人源化cd123结合结构域的一个或多个(例如所有三个)轻 链互补决定区1(lc cdr1)、轻链互补决定区2(lc cdr2)和轻链互补决定 区3cdr3)，和/或一个或多个(例如所有三个)重链互补决定区1(hc cdr1)、 重链互补决定区2(hc cdr2)和重链互补决定区3(hc cdr3)，例如人源 化cd123结合结构域包含一个或多个、例如全部三个lc cdr和一个或多个、例 如全部三个hc cdr。在一个实施方案中，人源化cd123结合结构域包含本文 所述的人源化cd123结合结构域的一个或多个(例如所有三个)重链互补决定 区1(hc cdr1)、重链互补决定区2(hc cdr2)和重链互补决定区3cdr3)， 例如人源化cd123结合结构域具有两个可变重链区，每个包含本文所述的hccdr1、hc cdr2和hc cdr3。在一个实施方案中，人源化cd123结合结构域 包含本文所述的人源化轻链可变区(例如，表6中)和/或本文所述的人源化重链 可变区(例如，表6中)。在一个实施方案中，人源化cd123结合结构域包含本 文所述的人源化重链可变区(例如，表6中)，例如本文所述的至少两个人源化 重链可变区(例如，表6中)。在一个实施方案中，cd123结合结构域是scfv， 其包含表6的氨基酸序列的轻链和重链。在一个实施方案中，cd123结合结构域 (例如scfv)包含：轻链可变区，所述轻链可变区具有表4中提供的轻链可变区 氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如置换)但不超过30、20或10个 修饰(例如置换)的氨基酸序列，或与表6的氨基酸序列具有95-99％同一性的 序列；和/或重链可变区，所述重链可变区包含具有表6中提供的重链可变区氨基 酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如置换)但不超过30、20或10个修饰 (例如置换)的氨基酸序列，或与表6的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。 在一个实施方案中，人源化cd123结合结构域包含选自seq id no：184-215 和302-333的序列，或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，人源 化cd123结合结构域是scfv，并且包含本文所述(例如在表6中)的氨基酸序列 的轻链可变区通过接头(例如本文所述的接头)连接于包含本文所述(例如在 表6中)的氨基酸序列的重链可变区。在一个实施方案中，人源化的cd123结合 结构域包含(gly4-ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5或6、优选地3或4(seq idno:26)。scfv的轻链可变区和重链可变区可以例如处于以下任何取向：轻链可 变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。
[0371]
可以使用本领域已知的多种技术产生人源化抗体，所述技术包括但不限于 cdr移植(参见，例如，欧洲专利号ep 239,400；国际公开号wo 91/09967；和 美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089，每份文献通过引用的方式完整并 入本文)、镶饰或表面重塑(参见，例如，欧洲专利号ep 592,106和ep 519,596； padlan,1991,molecular immunology,28(4/5):489-498；studnicka等人,1994, protein engineering,7(6):805-814；和roguska等人,1994,pnas,91:969-973， 每份文献通过引用的方式完整并入本文)、链改组(参见，例如，美国专利号 5,565,332，所述文献通过引用的方式完整并入本文)和在例如以下文献中公开的 技术：美国专利申请公开号us 2005/0042664、美国专利申请公开
号us2005/0048617、美国专利号6,407,213、美国专利号5,766,886、国际公开号wo9317105、tan等人,j.immunol.,169:1119-25(2002)、caldas等人,protein eng., 13(5):353-60(2000)、morea等人,methods,20(3):267-79(2000)、baca等人,j.biol. chem.,272(16):10678-84(1997)、roguska等人,protein eng.,9(10):895-904 (1996)、couto等人,cancer res.,55(23supp):5973s-5977s(1995)、couto等人, cancer res.,55(8):1717-22(1995)、sandhu j s,gene,150(2):409-10(1994)和 pedersen等人,j.mol.biol.,235(3):959-73(1994)，每份文献通过引用的方式完整 并入本文。经常地，构架区中的构架残基将用来自cdr供体抗体的相应残基置 换以改变、例如改善抗原结合。这些构架置换由本领域熟知的方法鉴定，例如， 通过将cdr和构架残基的相互作用建模以鉴定对抗原结合重要的构架残基并且 进行序列比较以鉴定特定位置处的不寻常构架残基。(参见，例如，queen等人， 美国专利号5,585,089；和riechmann等人,1988,nature,332:323，所述文献通过 引用的方式完整并入本文)。
[0372]
人源化抗体或抗体片段具有留在其中的来自非人类来源的一个或多个氨基 酸残基。这些非人氨基酸残基经常称作“输入”残基，它们一般取自“输入”可变 结构域。如本文中提供，人源化抗体或抗体片段包含来自非人类免疫球蛋白分 子和构架区的一个或多个cdr，其中包含构架的氨基酸残基完全或大部分衍生 自人种系。用于抗体或抗体片段人源化的多项技术是本领域熟知并且可以基本 上按照winter和合作者(jones等人,nature,321:522-525(1986)；reichmann等 人,nature,332:323-327(1988)；verhoeyen等人,science,239:1534-1536(1988)) 的方法，通过用啮齿类多个cdr或1个cdr序列置换相应的人抗体序列进行， 即，cdr移植法(ep 239,400；pct公开号wo 91/09967；和美国专利号4,816,567； 6,331,415；5,225,539；5,530,101；5,585,089；6,548,640，所述文献的内容通过 引用的方式完整并入本文)。在这类人源化抗体和抗体片段中，基本上小于完整 人可变结构域的区域已经由来自非人类物种的相应序列置换。人源化抗体往往 是其中一些cdr残基并且可能地一些fr残基由来自啮齿动物抗体中类似位点 的残基置换的人抗体。抗体和抗体片段的人源化也可以通过镶饰或表面重塑(ep592,106；ep 519,596；padlan,1991,molecular immunology,28(4/5):489-498； studnicka等人,protein engineering,7(6):805-814(1994)；和roguska等人, pnas,91:969-973(1994))或链改组(美国专利号5,565,332)实现，所述文献的内容 通过引用的方式完整并入本文。
[0373]
选择待用于产生人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链可变结构域)用于 降低抗原性。根据所谓“最佳配合”方法，针对已知的人可变结构域序列的完整 文库筛选啮齿动物抗体的可变结构域的序列。随后鉴定到与啮齿类序列最接近 的人类序列并且接受它作为用于人源化抗体的人构架区(fr)(sims等人,j. immunol,151:2296(1993)；chothia等人,j.mol.biol.,196:901(1987)，所述文献 的内容通过引用的方式完整并入本文)。另一种方法使用从具有特定亚组轻链或 重链的全部人类抗体的共有序列中衍生的特定构架。相同的框架可以用于几种 不同的人源化抗体(参见，例如，nicholson等人,mol.immun.34(16-17): 1157-1165(1997)；carter等人,proc.natl.acad.sci.usa,89:4285(1992)；presta等人,j.immunol.,151:2623(1993)，所述文献的内容通过引用的方式完整 并入本文)。在一些实施方案中，重链可变区的构架区(例如，全部四个构架区) 衍生自vh4_4-59种系序列。在一个实施方案中，构架区可以包含一个、两个、 三个、四个或五个修饰，例如置
换，例如来自相应鼠序列处的氨基酸。在一个 实施方案中，轻链可变区的构架区(例如，全部四个构架区)衍生自vk3_1.25种 系序列。在一个实施方案中，构架区可以包含一个、两个、三个、四个或五个 修饰，例如置换，例如来自相应鼠序列处的氨基酸。
[0374]
在一些方面，包含抗体片段的本发明car组合物的部分是人源化的，保留 对靶抗原的高亲和力和其他有利的生物学特性。根据本发明的一个方面，使用 亲本序列和人源化序列的三维模型，通过分析亲本序列和多种构思性人源化产 物的方法，制备人源化抗体和抗体片段。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的 并且是本领域技术人员熟悉的。说明并展示所选择候选免疫球蛋白序列的可能 三维构象性结构的计算机程序是可获得的。对这些展示结果的检验允许分析残 基在候选免疫球蛋白序列发挥作用中的可能角色，例如，分析影响候选免疫球 蛋白结合靶抗原的能力的残基。以这种方式，可以从受体序列和输入序列选出 并且组合fr残基，从而实现想要的抗体或抗体片段特征，如对靶抗原的亲和力 增加。通常，cdr残基直接并且最基本上参与影响抗原结合作用。
[0375]
人源化抗体或抗体片段可以保留与(例如，在本发明中的)原始抗体相似的抗 原特异性，结合人cd123或其片段的能力。在一些实施方案中，人源化抗体或 抗体片段可以具有改善的与人cd123或其片段结合的亲和力和/或特异性。
[0376]
在一个方面，抗原结合结构域部分包含选自seq id no:157-160、184-215、 478、480、483、485和556-587的一个或多个序列。在一个方面，包含人cd123 结合结构域的cd123 car选自这样的一个或多个序列，所述序列选自seq idno:157-160、478、480、483和485。在一个方面，包含人源化cd123结合结构 域的cd123 car选自这样的一个或多个序列，所述序列选自seq id no: 184-215和556-587。
[0377]
在一个方面，cd123结合结构域以抗体或抗体片段的特定功能特征或特性 表征。例如，在一个方面，本发明car组合物的包含抗原结合结构域的部分特 异性结合人cd123或其片段。在一个方面，本发明涉及包含抗体或抗体片段的 抗原结合结构域，其中抗体结合结构域与cd123蛋白或其片段特异性结合，其 中抗体或抗体片段包含了包括seq id no:157-160、184-215、478、480、483、 485和556-587的氨基酸序列的可变轻链和/或可变重链。在一个方面，抗原结合 结构域包含选自seq id no:157-160、184-215、478、480、483、485和556-587 的scfv的氨基酸序列。在某些方面，scfv与前导序列邻接并处于与之相同的可 读框内。在一个方面，前导序列是作为seq id no:1提供的多肽序列。
[0378]
在一个方面，cd123结合结构域是片段，例如，单链可变片段(scfv)。在一 个方面，cd123结合结构域是fv、fab、(fab')2、或双功能(例如双特异性)杂合 抗体(例如，lanzavecchia等人,eur.j.immunol.17,105(1987))。在一个方面， 本发明的抗体及其片段以野生型的或增强的亲和力结合cd123蛋白质或其片 段。
[0379]
在一些情况下，人scfv可以从展示文库衍生。展示文库是一组实体；每种 实体包含可及的多肽组分和编码或鉴定多肽组分的可回收组分。多肽组分如此 变动，从而代表不同的氨基酸序列。多肽组分可以是任何长度，例如从三个氨 基酸至超过300个氨基酸。展示文库实体可以包含多于一种多肽组分，例如，fab 的两条多肽链。在一个示例性实施方案中，展示文库可以用来鉴定人cd123结 合结构域。在选择时，将每个文库成员的多肽组分用cd123或其片段探测，并 且如果多肽组分与cd123结合，则鉴定到展示文库成员，一般通过在支持物上 停留来鉴定。
[0380]
从支持物回收留下的展示文库成员并分析。分析可以包括扩增和在相似或 不相似的条件下后续选择。例如，可以交替正向选择和负向选择。分析还可以 包括测定多肽组分(即，抗cd123结合结构域)的氨基酸序列和纯化多肽组分供详 细表征。
[0381]
多种模式可以用于展示文库。例子包括噬菌体展示。在噬菌体展示中，蛋 白质组分一般与噬菌体外壳蛋白共价连接。因翻译编码与外壳蛋白融合的蛋白 质组分的核酸产生键接。键接可以包括因抑制终止密码子而并入的柔性肽接头、 蛋白酶位点或氨基酸。噬菌体展示例如在美国5,223,409；smith(1985)science228:1315-1317；wo 92/18619；wo 91/17271；wo 92/20791；wo 92/15679； wo 93/01288；wo 92/01047；wo 92/09690；wo 90/02809；de haard等人(1999) j.biol.chem 274:18218-30；hoogenboom等人(1998)immunotechnology4:1-20；hoogenboom等人(2000)immunol today 2:371-8和hoet等人(2005)natbiotechnol.23(3)344-8中描述。可以培育展示蛋白质组分的噬菌体并且使用噬菌 体标准制备方法(例如peg沉淀法)从生长培养基收获之。在选择各个展示噬菌体 后，编码所选择蛋白质组分的核酸可以在扩增后从所选择的噬菌体感染的细胞 分离或从噬菌体自身分离。可以挑出单集落或蚀斑，分离核酸并测序。
[0382]
其他展示模式包括基于细胞的展示(参见，例如，wo 03/029456)、蛋白质
-ꢀ
核酸融合(参见，例如，us 6,207,446)、核糖体展示(参见，例如，mattheakis等 人,(1994)proc.natl.acad.sci.usa 91:9022和hanes等人,(2000)nat biotechnol. 18:1287-92；hanes等人,(2000)methods enzymol.328:404-30；和schaffitzel等人, (1999)j immunol methods.231(1-2):119-35)和大肠杆菌周质展示((2005 nov22；pmid:16337958)。
[0383]
在一些情况下，可以根据方法本领域已知的方法制备scfv(参见，例如，bird 等人,(1988)science 242:423-426和huston等人,(1988)proc.natl.acad.sci. usa 85:5879-5883)。可以通过使用柔性多肽接头将vh区和vl区连接在一起产 生scfv分子。scfv分子包含长度和/或氨基酸组成优化的接头(例如，ser-gly接 头)。接头长度可以大大影响scfv的可变区怎样折叠和相互作用。实际上，如果 使用短多肽接头(例如，在5-10个氨基酸之间)，则防止链内折叠。还需要链间折 叠以使这两个可变区一起形成有功能的表位结合位点。关于接头取向和大小的 例子，参见，例如，hollinger等人,1993proc natl acad.sci.u.s.a.90:6444-6448、 美国专利公开号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794，和pct公开号wo2006/020258和wo 2007/024715，所述文献通过引用的方式并入本文。
[0384]
scfv可以在其vl区和vh区之间包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50个或更 多个氨基酸残基的接头。接头序列可以包含任何天然存在的氨基酸。在一些实 施方案中，接头序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在另一个实施方案中，接头 序列包含成组的甘氨酸和丝氨酸重复序列如(gly4ser)
n
，其中n是等于或大于1的 正整数(seq id no:25)。在一个实施方案中，接头可以是(gly4ser)4(seq id no: 27)或(gly4ser)3(seq id no:28)。接头长度的变异性可以保留或增强活性，在 活性研究中产生优越功效。
[0385]
示例性cd123 car构建体和抗原结合结构域
[0386]
本文中公开的示例性cd123 car构建体包含scfv(例如，如本文表2、6和9 中公开的人scfv，任选地前置有任选的前导序列(例如，示例性前导氨基酸序列 和核苷酸序列分
99％同一，或多至20、15、10、8、6、5、4、3、2或1个氨基酸变化) 的序列。
[0390]
在某些实施方案中，cd123 car分子或cd123抗原结合结构域包含表3 或7中提供的1、2或3个来自重链可变区的cdr(例如，hc cdr1，hc cdr2 和/或hc cdr3)；和/或表4或8中提供的1、2或3个来自cd123-1,cd123-2, cd123-3,cd123-4,hzcd123-1,hzcd123-2,hzcd123-3,hzcd123-4, hzcd123-5,hzcd123-6,hzcd123-7,hzcd123-8,hzcd123-9,hzcd123-10, hzcd123-11,hzcd123-12,hzcd123-13,hzcd123-14,hzcd123-15,hzcd123-16, hzcd123-17,hzcd123-18,hzcd123-19,hzcd123-20,hzcd123-21,hzcd123-22, hzcd123-23,hzcd123-24,hzcd123-25,hzcd123-26,hzcd123-27,hzcd123-28, hzcd123-29,hzcd123-30,hzcd123-31或hzcd123-32的轻链可变区的cdr(例 如，lc cdr1、lc cdr2和/或lc cdr3)；或与上述任何序列基本上同一(例 如，95-99％同一，或多至5、4、3、2或1个氨基酸变化)的序列。
[0391]
在某些实施方案中，cd123 car分子或cd123抗原结合结构域包含表10 中提供的1、2或3个来自重链可变区的cdr(例如，hc cdr1，hc cdr2和/ 或hc cdr3)；和/或表11中提供的1、2或3个来自cd123-1,cd123-2,cd123-3, cd123-4,hzcd123-1,hzcd123-2,hzcd123-3,hzcd123-4,hzcd123-5, hzcd123-6,hzcd123-7,hzcd123-8,hzcd123-9,hzcd123-10,hzcd123-11, hzcd123-12,hzcd123-13,hzcd123-14,hzcd123-15,hzcd123-16,hzcd123-17, hzcd123-18,hzcd123-19,hzcd123-20,hzcd123-21,hzcd123-22,hzcd123-23, hzcd123-24,hzcd123-25,hzcd123-26,hzcd123-27,hzcd123-28,hzcd123-29, hzcd123-30,hzcd123-31和hzcd123-32的轻链可变区的cdr(例如，lccdr1、lc cdr2和/或lc cdr3)；或与上述任何序列基本上同一(例如，95-99％ 同一，或多至5、4、3、2或1个氨基酸变化)的序列。
[0392]
在某些实施方案中，cd123 car分子或cd123抗原结合结构域包含表12 中提供的1、2或3个来自重链可变区的cdr(例如，hc cdr1，hc cdr2和/ 或hc cdr3)；和/或表13中提供的1、2或3个来自cd123-1,cd123-2,cd123-3, cd123-4,hzcd123-1,hzcd123-2,hzcd123-3,hzcd123-4,hzcd123-5, hzcd123-6,hzcd123-7,hzcd123-8,hzcd123-9,hzcd123-10,hzcd123-11, hzcd123-12,hzcd123-13,hzcd123-14,hzcd123-15,hzcd123-16,hzcd123-17, hzcd123-18,hzcd123-19,hzcd123-20,hzcd123-21,hzcd123-22,hzcd123-23, hzcd123-24,hzcd123-25,hzcd123-26,hzcd123-27,hzcd123-28,hzcd123-29, hzcd123-30,hzcd123-31或hzcd123-32的轻链可变区的cdr(例如，lcdr1、 lcdr2和/或lcdr3)；或与上述任何序列基本上同一(例如，95-99％同一，或 多至5、4、3、2或1个氨基酸变化)的序列。
[0393]
在scfv结构域的cdr序列中，重链可变结构域的序列显示于表3、7、10 和12，以及轻链可变结构域的序列显示于表4、8、11和13。“id”代表每个 cdr的相应seq id no。
[0394]
在表3、4、7和8中提供的cdr依据kabat和chothia编号方案的组合。
[0395]
表3.重链可变结构域cdr
[0396]
候选者hcdr1idhcdr2idhcdr3idcar123-2gytftgyymh335winpnsggtnyaqkfqg363dmnilatvpfdi391car123-3gyiftgyyih337winpnsggtnyaqkfqg364dmnilatvpfdi392car123-4gytftgyymh336winpnsggtnyaqkfqg365dmnilatvpfdi393car123-1gytftdyymh334winpnsgdtnyaqkfqg362dmnilatvpfdi390
[0397]
表4.轻链可变结构域cdr
[0398]
候选者lcdr1idlcdr2idlcdr3idcar123-2rasqsissyln419aafslqs447qqgdsvplt475car123-3rasqsissyln420aasslqs448qqgdsvplt476car123-4rasqsissyln421aasslqs449qqgdsvplt477car123-1rasqsistyln418aasslqs446qqgdsvplt474
[0399]
表7：重链可变结构域cdr
[0400] hcdr1idhcdr2idhcdr3idhzcar123gytftsywmn361ridpydsethynqkfkd389gnwddy417
[0401]
表8.轻链可变结构域cdr
[0402] lcdr1idlcdr2idlcdr3idhzcar123rasksiskdla445sgstlqs473qqhnkypyt47
[0403]
表10：根据kabat编号方案的重链可变结构域cdr(kabat等人(1991)， sequences of proteins of immunological interest，第5版，public health service， national institutes of health，bethesda，md)
[0404]
[0405][0406]
表11：根据kabat编号方案的轻链可变结构域cdr(kabat等人(1991), sequences of proteins of immunological interest,第5版,public health service, national institutes of health,bethesda,md)
[0407]
[0408][0409]
表12：根据chothia编号方案的重链可变结构域cdr(al-lazikani等人,(1997) jmb 273,927-948)
[0410][0411][0412]
表13：根据chothia编号方案的轻链可变结构域cdr(al-lazikani等人,(1997) jmb 273,927-948)
[0413][0414][0415]
在实施方案中，产生了cd123单链可变片段并克隆到具有胞内cd3ζ结构 域和4-1bb的胞内共刺激结构域的慢病毒car表达载体中。示例性完全人 cd123 scfv的名称示于表1中。示例性人源化cd123 scfv的名称示于表5中。
[0416]
表1：car-cd123构建体
[0417]
构建体idcar别名ebb-c1357-f11car123-1ebb-c1358-b10car123-2
ebb-c1358-d5car123-3ebb-c1357-c4car123-4
[0418]
表5：car-cd123构建体
[0419][0420][0421]
在实施方案中，vl和vh结构域在scfv中出现的顺序是变化的(即vl-vh 或vh-vl取向)，并且其中三个或四个拷贝的“g4s”(seq id no：25)亚 基连接可变结构域以创建scfv结构域的整体，如表2、表6和表9中所示，其中每 个亚基包含序列ggggs(seq id no：25)(例如,(g4s)3(seq id no:28)或 (g4s)4(seq id no:27))，。
[0422]
cd123 scfv结构域和cd123 car分子的氨基酸和核酸序列提供于表2、表6 和表9中。每种scfv的可变重链和可变轻链的氨基酸序列也提供于表2和表6中。 应注意，具有前导序列(例如，seq id no：1的氨基酸序列或seq id no：12 的核苷酸序列)的scfv片段(seq id no：157-160和184-215)和无前导序列的 scfv片段(seq id no：478、480、483、485和556-587)也包括在本发明中。
[0423]
前导(氨基酸序列)(seq id no:1)
[0424]
malpvtalllplalllhaarp
[0425]
前导(核酸序列)(seq id no:12)
[0426]
atggccctgcctgtgacagccctgctgctgcctctggctctgctgctgcatgccgctagaccc
[0427]
cd8铰链(氨基酸序列)(seq id no:2)
[0428]
tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacd
[0429]
cd8铰链(核酸序列)(seq id no:13)
[0430]
accacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtcc ctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttc gcctgtgat
[0431]
cd8跨膜(氨基酸序列)(seq id no:6)
[0432]
iyiwaplagtcgvlllslvitlyc
[0433]
cd8跨膜(核酸序列)(seq id no:17)
[0434]
atctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccct ttactgc
[0435]
4-1bb胞内结构域(氨基酸序列)(seq id no:7)
[0436]
krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel
[0437]
4-1bb胞内结构域(核酸序列)(seq id no:18)
[0438]
aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaact actcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg
[0439]
cd28胞内结构域(氨基酸序列)(seq id no:43)
[0440]
rskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs(seq id no:43)
[0441]
cd28胞内结构域(核苷酸序列)(seq id no:44)
[0442]
aggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggc ccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcc(seq id no:44)
[0443]
icos胞内结构域(氨基酸序列)(seq id no:45)
[0444]
t k k k y s s s v h d p n g e y m f m r a v n t a k k s r l t d v t l(seq id no: 45)
[0445]
icos胞内结构域(核苷酸序列)(seq id no:46)
[0446]
acaaaaaagaagtattcatccagtgtgcacgaccctaacggtgaatacatgttcatgagagcag tgaacacagccaaaaaatccagactcacagatgtgacccta(seq id no:46)
[0447]
cd3ζ结构域(氨基酸序列)(seq id no:9)
[0448]
rvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkd kmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
[0449]
cd3ζ(核酸序列)(seq id no:20)
[0450]
agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctc tataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggcc gggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatg aactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgcc ggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacct acgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc
[0451]
cd3ζ结构域(氨基酸序列；ncbi参考序列nm_000734.3)(seq id no:10)
[0452]
rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkd kmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
[0453]
cd3ζ(核酸序列；ncbi参考序列nm_000734.3)；(seq id no:21)
[0454]
agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccag aaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttt tggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaagga agaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcgg aggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggc acgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgc ccttcacatgcaggccctgccccctcgc
[0455]
igg4铰链(氨基酸序列)(seq id no:36)
[0456]
eskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwy vdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiekti skakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennyktt ppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgkm
[0457]
igg4铰链(核苷酸序列)(seq id no:37)
[0458]
gagagcaagtacggccctccctgccccccttgccctgcccccgagttcctgggcgg acccagcgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagccgga cccccgaggtgacctgtgtggtggtggacgtgtcccaggaggaccccgaggtccag ttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcacaacgccaagaccaagccccggg aggagcagttcaatagcacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccag gactggctgaacggcaaggaatacaagtgtaaggtgtccaacaagggcctgccca gcagcatcgagaaaaccatcagcaaggccaagggccagcctcgggagccccaggt gtacaccctgccccctagccaagaggagatgaccaagaaccaggtgtccctgacct gcctggtgaagggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaacgg ccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggcagct tcttcctgtacagccggctgaccgtggacaagagccggtggcaggagggcaacgtc tttagctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagagcct gagcctgtccctgggcaagatg
[0459]
在实施方案中，表2和6中的这些克隆均含有源自cd3ζ链的共刺激结构域 的信号结构域中的q/k残基变化。
[0460]
表2.示例性cd123 car序列
[0461]
[0462]
[0463]
[0464]
[0465][0466]
表6：人源化cd123 car序列
[0467]
[0468]
[0469]
[0470]
[0471]
[0472]
[0473]
[0474]
[0475]
[0476]
[0477]
[0478]
[0479]
[0480]
[0481]
[0482]
[0483]
[0484]
[0485]
[0486]
[0487]
[0488]
[0489]
[0490]
[0491]
[0492][0493]
在实施方案中，本文所述的car分子包含特异性结合cd123的scfv，且不 含前导序列，例如氨基酸序列seq id no：1。下表9提供了cd123 scfv序列的 氨基酸和核苷酸序列，其不含有前导序列seq id no：1。
[0494]
表9.cd123 car scfv序列
[0495]
[0496]
[0497]
[0498]
[0499]
[0500][0501]
在实施方案中，然后将car scfv片段克隆到慢病毒载体中，以在单个编码 框中产生全长car构建体，并使用ef1α启动子进行表达(seq id no：11)。
[0502]
ef1α启动子
[0503]
cgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaat tgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgaggg tgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaa gtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacctggctg cagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttc gcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcg ctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgta aatgcgggccaagatctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcac atgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctgg tgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaa agatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacc cacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacc tcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacact gagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatc ttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtga
[0504]
gly/ser(seq id no:25)
[0505]
ggggs
[0506]
gly/ser(seq id no:26):该序列可以包含1-6个"gly gly gly gly ser"重复单元
[0507]
ggggsggggs ggggsggggs ggggsggggs
[0508]
gly/ser(seq id no:27)
[0509]
ggggsggggs ggggsggggs
[0510]
gly/ser(seq id no:28)
[0511]
ggggsggggs ggggs
[0512]
gly/ser(seq id no:29)
[0513]
gggs
[0514]
polya:(a)
5000
(seq id no:30)
[0515]
该序列可以包含50-5000个腺嘌呤。
[0516]
polya:(t)
100
(seq id no:31)
[0517]
polya:(t)
5000
(seq id no:32)
[0518]
该序列可以包含50-5000个胸腺嘧啶。
[0519]
polya:(a)
5000
(seq id no:33)
[0520]
该序列可以包含100-5000个腺嘌呤。
[0521]
polya:(a)
400
(seq id no:34)
[0522]
该序列可以包含100-400个腺嘌呤。
[0523]
polya:(a)
2000
(seq id no:35)
[0524]
该序列可以包含50-2000个腺嘌呤。
[0525]
gly/ser(seq id no:709):该序列可以包含1-10个"gly gly gly ser"重 复单元
[0526]
gggsgggsgg gsgggsgggs gggsgggsgg gsgggsgggs
[0527]
可以将car scfv片段克隆至慢病毒载体中以在单个编码框中产生全长 car构建体，并用ef1α启动子用于表达(seq id no:11)。
[0528]
car构建体可以包含具有以下一个或多个序列的gly/ser接头：ggggs (seq id no:25)；包含1-6个"gly gly gly gly ser"重复单元，例如 ggggsggggs ggggsggggs ggggsggggs(seq id no:26)； ggggsggggs ggggsggggs(seq id no:27)；ggggsggggs ggggs (seq id no:28)；gggs(seq id no:29)；或包含1-10个"gly gly gly ser" 重复单元，例如gggsgggsgg gsgggsgggs gggsgggsgggsgggsgggs(seq id no:709)。在实施方案中，car构建体包含聚腺苷酸 序列，例如，包含50-5000个或100-5000个腺嘌呤的序列(例如，seq id no:30、 seq id no:33、seq id no:34或seq id no:35)，或包含50-5000个胸腺嘧 啶的序列(例如，seq id no:31、seq id no:32)。备选地，car构建体可以 例如包含接头，所述接头包括序列gstsgsgkpgsgegstkg(seq id no: 704)。
[0529]
双特异性car
[0530]
在一个实施方案中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗 体对不多于两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子以针对第一表位具有结合 特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和针对第二表位具有结合特异性的第 二免疫球蛋白可变结构域序列为特征。在一个实施方案中，第一和第二表位在 相同抗原(例如，相同蛋白质(或多聚体蛋白的亚基))上。在一个实施方案中，第 一和第二表位重叠。在一个实施方案中，第一和第二表位不重叠。在一个实施 方案中，第一和第二表位在不同抗原(例如，不同蛋白质(或多聚体蛋白的不同亚 基))上。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含针对第一表位具有结合特异 性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序以及针对第二表位具有结合特异 性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一个实施方案中双特异性 抗体分子包含针对第一表位具有结合特异性的半部分抗体和针对第二表位具有 结合特异性的半
2004219643 a1、us 2004220388 a1、us 2004242847 a1、us 2005003403 a1、 us 2005004352 a1、us 2005069552 a1、us 2005079170a1、us 2005100543 a1、 us 2005136049 a1、us 2005136051 a1、us 2005163782 a1、us 2005266425 a1、 us 2006083747 a1、us 2006120960 a1、us 2006204493 a1、us 2006263367 a1、 us 2007004909 a1、us 2007087381 a1、us 2007128150 a1、us 2007141049 a1、 us 2007154901 a1、us 2007274985 a1、us 2008050370 a1、us 2008069820 a1、 us 2008152645 a1、us 2008171855 a1、us 2008241884 a1、us 2008254512 a1、 us 2008260738 a1、us 2009130106 a1、us 2009148905 a1、us 2009155275 a1、 us 2009162359 a1、us 2009162360 a1、us 2009175851 a1、us 2009175867 a1、 us 2009232811 a1、us 2009234105 a1、us 2009263392 a1、us 2009274649 a1、 ep 346087 a2、wo 0006605 a2、wo 02072635 a2、wo 04081051 a1、wo06020258 a2、wo 2007044887 a2、wo 2007095338 a2、wo 2007137760 a2、 wo 2008119353 a1、wo 2009021754 a2、wo 2009068630 a1、wo 9103493a1、wo 9323537 a1、wo 9409131 a1、wo 9412625 a2、wo 9509917 a1、 wo 9637621 a2、wo 9964460 a1。上文所提及申请的内容是通过引用的方式 完整地并入本文。
[0532]
在双特异性抗体分子的每个抗体或抗体片段(例如，scfv)内部，vh可以是 在vl的上游或下游。在一些实施方案中，上游抗体或抗体片段(例如，scfv)按 照其vh(vh1)位于其vl(vl1)上游时布置并且下游抗体或抗体片段(例如，scfv) 按照其vl(vl2)位于其vh(vh2)上游时布置，从而总体双特异性抗体分子具有 布局vh
1-vl
1-vl
2-vh2。在其他实施方案中，上游抗体或抗体片段(例如，scfv) 按照其vl(vl1)位于其vh(vh1)上游时布置并且下游抗体或抗体片段(例如， scfv)按照其vh(vh2)位于其vl(vl2)上游时布置，从而总体双特异性抗体分子 具有布局vl
1-vh
1-vh
2-vl2。任选地，接头布置在两个抗体或抗体片段(例如， scfv)之间，例如，如果将构建体布置为vh
1-vl
1-vl
2-vh2，则布置在vl1和vl2之间，或如果将构建体布置为vl
1-vh
1-vh
2-vl2，则布置在vh1和vh2之间。接 头可以是如本文所述的接头，例如，(gly
4-ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5 或6、优选地4(seq id no:64)。通常，在两个scfv之间的接头应当足够长，以 避免两个scfv的结构域之间错误配对。任选地，接头布置在第一scfv的vl和vh 之间。任选地，接头布置在第二scfv的vl和vh之间。在具有多个接头的构建 体中，任何两个或更多个接头可以是相同或不同的。因此，在一些实施方案中， 双特异性car在如本文所述的布局中包含vl、vh和任选地一个或多个接头。
[0533]
在一个方面，双特异性抗体分子以第一免疫球蛋白可变结构域序列(例如， scfv)和第二免疫球蛋白可变结构域序列为特征，所述的第一免疫球蛋白可变结 构域序列对cd123具有结合特异性，例如包含如本文所述(例如，如表2、表6或 表9中所述)的scfv，或包含来自本文所述的cd123 scfv的轻链cdr和/或重链 cdr，所述第二免疫球蛋白可变结构域序列对不同抗原上的第二表位具有结合 特异性。在一些方面，第二免疫球蛋白可变结构域序列对aml细胞上表达的抗 原(例如，除cd123之外的抗原)具有结合特异性。例如，第二免疫球蛋白可变结 构域序列对ccl-1具有结合特异性。作为另一个例子，第二免疫球蛋白可变结 构域序列对cd33具有结合特异性。作为另一个例子，第二免疫球蛋白可变结构 域序列对cd34具有结合特异性。作为另一个例子，第二免疫球蛋白可变结构域 序列对flt3具有结合特异性。例如，第二免疫球蛋白可变结构域序列对叶酸受 体β具有结合特异性。在一些
方面，第二免疫球蛋白可变结构域序列对b细胞上 表达的抗原(例如，cd19、cd20、cd22或ror1)具有结合特异性。
[0534]
嵌合tcr
[0535]
在一个方面，可以将本发明的cd123抗体和抗体片段(例如，在表2、6或 9中公开的那些)移植到t细胞受体(“tcr”)链(例如，tcrα或tcrβ链)的一个 或多个恒定结构域，以产生与cd123特异性结合的嵌合tcr。不受理论约束， 认为一旦结合抗原，嵌合tcr将通过tcr复合体发送信号。例如，可以将如 本文中公开的cd123 scfv移植至恒定结构域，例如，tcr链(例如，tcrα链 和/或tcrβ链)的胞外恒定结构域、跨膜结构域和胞质结构域的至少一部分。作 为另一个例子，cd123抗体片段，例如，如本文所述的vl结构域，可以移植 至tcrα链的恒定结构域，并且cd123抗体片段，例如，如本文所述的vh结 构域，可以移植至tcrβ链的恒定结构域(或备选地，vl结构域可以移植至 tcrβ链的恒定结构域并且vh结构域可以移植至tcrα链)。作为另一个例子， cd123抗体或抗体片段的cdr(例如，如表3、4、5、6、7、8、10、11、12或13中所述的cd123抗体或抗体片段的cdr)可以移植至tcrα和/或β链中， 以产生与cd123特异性结合的嵌合tcr。例如，本文公开的lcdr可以移植 至tcrα链的可变结构域中并且本文公开的hcdr可以移植至tcrβ链的可变 结构域，或反之亦然。这类嵌合tcr可以通过本领域已知的方法产生(例如， willemsen ra等人,gene therapy 2000；7:1369
–
1377；zhang t等人,cancergene ther 2004；11:487
–
496；aggen等人,gene ther.2012apr；19(4):365-74)。
[0536]
稳定性和突变
[0537]
cd123结合结构域(例如，scfv分子(例如，可溶性scfv))的稳定性可以参照 常规对照scfv分子或全长抗体的生物物理特性(例如，热稳定性)来评价。在一个 实施方案中，人scfv在所述测定法中具有比对照结合分子(例如常规scfv分子) 高约0.1、约0.25、约0.5、约0.75、约1、约1.25、约1.5、约1.75、约2、约2.5、 约3、约3.5、约4、约4.5、约5、约5.5、约6、约6.5、约7、约7.5、约8、约8.5、 约9、约9.5、约10摄氏度、约11摄氏度、约12摄氏度、约13摄氏度、约14摄氏度 或约15摄氏度的热稳定性。
[0538]
随后将cd123结合结构域(例如，scfv)的改善的热稳定性赋予整个 cart123构建体，导致cart123构建体的治疗性特性改善。与常规抗体相比， 可以改善cd123结合结构域(例如，scfv)的热稳定性至少约2℃或3℃。在一个实 施方案中，与常规抗体相比，cd123结合结构域(例如，scfv)具有1℃的热稳定 性改善。在另一个实施方案中，与常规抗体相比，cd123结合结构域(例如，scfv) 具有2℃的热稳定性改善。在另一个实施方案中，与常规抗体相比，scfv具有4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15℃改善的热稳定性。可以例如在本文 公开的scfv分子和全长抗体之间进比行较。可以使用本领域已知的方法测量热 稳定性。例如，在一个实施方案中，可以测量tm。下文更详细地描述用于测量 tm的方法和确定蛋白质稳定性的其他方法。
[0539]
scfv中的突变改变scfv的稳定性并且改善scfv和cart123构建体的总体 稳定性。使用测量如tm、温度变性和温度聚集，测定人源化或人scfv的稳定性。
[0540]
可以使用实施例中描述的测定法确定突变scfv的结合能力。
[0541]
在一个实施方案中，cd123结合结构域(例如，scfv)包含至少一个突变，从 而突变的scfv赋予cart123构建体改善的稳定性。在另一个实施方案中，cd123 结合结构域(例如，
scfv)包含源自人源化过程的至少1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10个突变，从而突变的scfv赋予cart123构建体改善的稳定性。
[0542]
评价蛋白质稳定性的方法
[0543]
可以例如使用下文描述的方法，评估抗原结合结构域的稳定性。这类方法 允许确定多个热解折叠转变，其中最不稳定的结构域首先解折叠或限制协同解 折叠的多结构域单元(例如，显示单一解折叠转变的多结构域蛋白质)的总体稳定 阈值。可以按许多额外的方式鉴定最不稳定的结构域。可以进行诱变以探测哪 个结构域限制总体稳定性。另外，可以在这样的条件下借助dsc或其他光谱方 法确定多结构域蛋白质的蛋白酶抗性，其中已知最不稳定结构域内在解折叠 (fontana等人,(1997)fold.des.,2:r17-26；dimasi等人,(2009)j.mol.biol.393: 672-692)。一旦鉴定到最不稳定的结构域，可以使用编码这种结构域(或其部分) 的序列作为所述方法中的测试序列。
[0544]
a)热稳定性
[0545]
可以使用本领域已知的许多非限制性生物物理或生物化学技术分析组合物 的热稳定性。在某些实施方案中，通过分析光谱法评价热稳定性。
[0546]
一个示例性分析光谱方法是差示扫描量热法(dsc)。dsc采用对伴随大多 蛋白质或蛋白质结构域解折叠的热吸收敏感的量热器(见，例如sanchez-ruiz等 人,biochemistry,27:1648-52,1988)。为了确定蛋白质的热稳定性，将蛋白质的 样品插入量热器中并将温度升高直至fab或scfv解折叠。蛋白质解折叠的温度表 示总体蛋白质稳定性。
[0547]
另一个示例性分析光谱法方法是圆二色性(cd)光谱法。cd光谱法测量组合 物随温度增加而变化的光学活性。圆二色性(cd)光谱法测量相对于右旋偏振光 而言左旋偏振光吸收的差异，所述差异因结构非对称性所致。无序或解折叠的 结构产生与有序或折叠的结构非常不同的cd光谱。cd光谱反映蛋白质对增加 温度的变性效应的灵敏度并且因此表示蛋白质的热稳定性(见van mierlo和 steemsma,j.biotechnol.,79(3):281-98,2000)。
[0548]
用于测量热稳定性的另一个示例性分析光谱方法是荧光发射光谱法(见上 文van mierlo和steemsma)。用于测量热稳定性的又一个示例性分析光谱方法是 核磁共振(nmr)光谱(见，例如上文van mierlo和steemsma)。
[0549]
可以生物化学方式测量组合物的热稳定性。用于评估热稳定性的示例性生 物化学方法是热攻击测定法。在“热攻击测定法”中，组合物经受一系列升高的 温度持续一组时间段。例如，在一个实施方案中，受试scfv分子或包含scfv分 子的分子经受一系列增加的温度持续例如1-1.5小时。随后通过有关的生物化学 测定法分析蛋白质的活性。例如，如果该蛋白质是结合蛋白(例如scfv或含有scfv 的多肽)，则可以通过功能性或定量性elisa确定结合蛋白的结合活性。
[0550]
这种测定法可以按高通量样式进行并且实施例中公开了使用大肠杆菌和高 通量筛选的那些。可以使用本领域已知的方法产生cd123结合结构域(例如，scfv 变体)的文库。可以诱导cd123结合结构域(例如，scfv)表达并且可以对cd123 结合结构域(例如，scfv)进行热攻击。可以对攻击的受试样品测定结合作用，并 且可以将那些稳定的cd123结合结构域(例如，scfv)放大并进一步表征。
[0551]
通过使用前述任一项技术(例如分析光谱技术)测量组合物的熔融温度 (tm)，评
价热稳定性。熔融温度是在热转变曲线中点处的温度，其中组合物的 50％分子处于折叠状态(参见，例如，dimasi等人,(2009)j.mol biol.393: 672-692)。在一个实施方案中，cd123结合结构域(例如，scfv)的tm值是约40℃、 41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、 52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、 63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、 74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、 85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、 96℃、97℃、98℃、99℃、100℃。在一个实施方案中，igg的tm值是约40℃、 41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、 52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、 63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、 74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、 85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、 96℃、97℃、98℃、99℃、100℃。在一个实施方案中，多价抗体的tm值是约 40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、 51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、 73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、 84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、 95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃。
[0552]
还通过使用分析性量热技术(例如dsc)测量组合物的比热或热容(cp)评价 热稳定性。组合物的比热是为升高1摩尔水的温度1℃所需要的能量(例如以 kcal/mol为单位)。大的cp是变性或无活性蛋白质组合物的标志。通过确定组合 物在其热转变之前和之后的比热来测量组合物的热容(δcp)变化。还可以通过测 量或确定热动力稳定性的其他参数(包括解折叠gibbs自由能(δg)、解折叠焓(δh) 或解折叠熵(δs))评价热稳定性。一种或多种上述生物化学测定法(例如热攻击测 定法)用来确定50％组合物保留其活性(例如结合活性)的温度(即t
c
值)。
[0553]
此外，与未突变的cd123结合结构域(例如，scfv)相比，对cd123结合结构 域(例如，scfv)的突变改变cd123结合结构域(例如，scfv)的热稳定性。当人源 化或人cd123结合结构域(例如，scfv)并入cart123构建体时，cd123结合结构 域(例如，人源化或人scfv)向整个cd123 cart构建体赋予热稳定性。在一个实 施方案中，cd123结合结构域(例如，scfv)包含向cd123结合结构域(例如，scfv) 赋予热稳定性的单突变。在另一个实施方案中，cd123结合结构域(例如，scfv) 包含向cd123结合结构域(例如，scfv)赋予热稳定性的多突变。在一个实施方案 中，cd123结合结构域(例如，scfv)中的多突变对cd123结合结构域(例如，scfv) 的热稳定性具有加合效应。
[0554]
b)聚集％
[0555]
可以通过测量其聚集倾向性确定组合物的稳定性。可以通过许多非限制性 生物化学或生物物理技术测量聚集。例如，可以使用色谱(例如大小排阻色谱 (sec))评价组合物的聚集。sec基于大小分离分子。柱用高分子凝胶的半固态 珠填充，所述高分子凝胶允许离子和小分子进入其内部，但是不允许大实体进 入其内部。将蛋白质组合物施加至柱顶部时，紧凑的折叠蛋白质(即未聚集的蛋 白质)分布遍及蛋白质大聚集物可用的较大溶剂体积。因此，大聚集物更快速地 移动穿过该柱，并且以这种方式，混合物可以分离或分级成为其组分。当每种 级分从凝胶洗脱时，可以分别对其定量(例如通过光散射)。因此，可以通过
比较 级分的浓度与施加至凝胶的蛋白质的总浓度确定组合物的聚集％。稳定组合物 作为基本上单一级分从柱洗脱并且作为基本上单一峰出现在洗脱曲线或色谱图 中。
[0556]
c)结合亲和力
[0557]
可以通过确定其靶结合亲和力评估组合物的稳定性。用于确定结合亲和力 的广泛类型方法是本领域已知的。一种用于确定结合亲和力的示例性方法采用 表面等离子体共振。表面等离子体共振是允许通过(例如使用biacore系统 (pharmacia biosensor ab,uppsala,sweden and piscataway,n.j.))检测生物传 感器基质内部蛋白质浓度的改变来分析实时生物特异性相互作用的光学现象。 关于进一步的描述，参见jonsson,u.等人,(1993)ann.biol.clin.51:19-26； jonsson,u.,i(1991)biotechniques 11:620-627；johnsson,b.等人,(1995)j.mol. recognit.8:125-131以及johnnson,b.等人,(1991)anal.biochem.198:268-277。
[0558]
在一个方面，car的抗原结合结构域包含与本文所述的抗原结合结构域氨 基酸序列同源的氨基酸序列，并且抗原结合结构域保留本文所述的cd123抗体 片段的所需功能特性。在一个具体方面中，本发明的car组合物包含抗体片段。 在又一个方面，该抗体片段包含scfv。
[0559]
在多个方面，可以通过修饰在一个或两个可变区(例如，vh和/或vl)内部， 例如，一种或多种cdr区内部和/或一个或多个构架区内部的一个或多个氨基 酸，将car的抗原结合结构域工程化。在一个具体方面中，本发明的car组合 物包含抗体片段。在又一个方面，该抗体片段包含scfv。
[0560]
本领域普通技术人员将理解，本发明的抗体或抗体片段还可以如此修饰， 从而它们在氨基酸序列方面变动(例如，不同于野生型)，但是在所需的活性方面 不变动。例如，可以对蛋白质进行导致“非必需”氨基酸残基处氨基酸置换的额 外核苷酸置换。例如，可以将分子中的非必需氨基酸残基替换为来自相同侧链 家族的另一个氨基酸残基。在另一个实施方案中，可以将一个氨基酸片段替换 为结构上相似的片段，所述的片段在侧链家族成员的顺序和组成方面中不同， 例如，可以进行保守性置换，其中将氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸 残基。
[0561]
本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，所述侧链包括碱性 侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不 带电荷极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨 酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨 酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分枝侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨 酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
[0562]
在两个或更多个核酸序列或多肽序列的上下文中，同一性百分数指相同的 两个或更多个序列。如果在比较窗口或指定区域范围内为最大对应性而进行比 较和比对时，如使用以下序列比较算法之一或通过手工比对和目视审查所测量， 两个序列具有指定百分数的相同氨基酸残基或核苷酸(例如，在指定区域范围内 或当未指定时在整个序列范围内60％同一性，任选地70％、71％。72％。73％、 74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、 86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％同一性)，则这两个序列是“基本上同一的”。任选地，同一性存在于 长度至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域内，或更优选地在长度100到500 或1000或
更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)的区域内。
[0563]
对于序列比较，一般地一个序列充当与受试序列比较的参考序列。当使用 序列比较算法时，将受试序列和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列 坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数或可以指定备选参数。 基于程序参数，序列比较算法随后相对于参考序列计算受试序列的序列同一性 百分数。用于比对序列以比较的方法是本领域熟知的。用于比较的最佳序列比 对可以按如下方式进行，例如通过smith和waterman,(1970)adv.appl.math. 2:482c的局部同源性算法、通过needleman和wunsch(1970)j.mol.biol.48:443 的同源性比对算法、通过pearson和lipman,(1988)proc.nat'l.acad.sci.usa 85:2444的相似性搜索方法、通过这些算法的计算机化执行(wisconsin genetics 软件包，genetics computer group,575science dr.,madison,wi中的gap、 bestfit、fasta和tfasta)或通过手工比对和目视审查(见，例如，brent 等人,(2003)current protocols in molecular biology)。
[0564]
适用于确定序列同一性和序列相似性百分数的两个算法例子是blast算法 和blast 2.0算法，它们分别在altschul等人,(1977)nuc.acids res. 25:3389-3402；和altschul等人,(1990)j.mol.biol.215:403-410(1990)中描述。 用于进行blast分析的软件是通过国家生物技术信息中心可公开获得的。
[0565]
还可以使用pam120权重余数表、空位长度罚分12，空位罚分4，利用已 经并入align程序(2.0版)的e.meyers和w.miller算法,(1988)comput.appl. biosci.4:11-17)确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。此外，可以使用已 经集成至gcg软件包的gap程序中的needlema和wunsch(1970)j.mol.biol. 48:444-453)算法(在www.gcg.com可获得)，使用blossom 62矩阵或pam250矩 阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确 定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。
[0566]
在一个方面，本发明构思了产生功能上等同分子的起始抗体或片段(例如， scfv)氨基酸序列修饰。例如，可以修饰car中包含的cd123结合结构域(例如， scfv)的vh或vl，以保留与cd123结合结构域(例如，scfv)的起始vh或vl 构架区至少约70％、71％。72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、 80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性。本发明构思了 修饰完整car构建体，例如，在car构建体的多个结构域的一种或多种氨基 酸序列中修饰，旨在产生功能上等同的分子。可以修饰car构建体以保留起始 car构建体的至少约70％、71％。72％。73％、74％、75％、76％、77％、78％、 79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性。
[0567]
跨膜结构域
[0568]
就跨膜结构域而言，在多种实施方案中，car可以设计成包含与car的胞 外结构域连接的跨膜结构域。跨膜结构域可以包括一个或多个与跨膜区毗邻的 额外氨基酸，例如，一个或多个与衍生跨膜区的蛋白质的胞外区相关的氨基酸 (例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个直至15个胞外区氨基酸)和/或一个或 多个与衍生跨膜蛋白的蛋白质的胞内区相关的氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10个至多15个胞内区氨基酸)。在一个方面，跨膜结构域是与所用car 的其他结构域之一缔合的结构域。在一些情况下，可以选择或通过氨基酸置换 修饰跨膜结构域，以避免这类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结 合，例
如，以最大限度减少与受体复合体的其他构件的相互作用。在一个方面， 跨膜结构域能够与表达car的细胞(例如，cart细胞)细胞表面上的另一个 car同型二聚化。在一个不同方面，可以修饰或置换跨膜结构域的氨基酸序列， 从而最小化与表达car的相同细胞(例如，cart细胞)中存在的天然结合配偶体 的结合结构域相互作用。
[0569]
跨膜结构域可以衍生自天然来源或重组来源。在来源是天然的情况下，结 构域可以衍生自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在一个方面，每当car已经与靶 结合时，跨膜结构域就能够向胞内结构域发送信号。在本发明中特别有用的跨 膜结构域可以包含例如以下蛋白质的跨膜结构域：t细胞受体的α、β或ζ链、 cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8(例如，cd8α，cd8β)、cd9、cd16、 cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154。在一 些实施方案中，跨膜结构域可以包括至少例如以下蛋白质的跨膜区：kirds2、 ox40、cd2、cd27、lfa-1(cd11a、cd18)、icos(cd278)、4-1bb(cd137)、 gitr、cd40、baffr、hvem(lightr)、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、 nkp30、nkp46、cd160、cd19、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga1、vla1、 cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、 itgae、cd103、itgal、cd11a、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、 itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、tnfr2、dnam1(cd226)、 slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9 (cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、slamf6(ntb-a、 ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg (cd162)、ltbr、pag/cbp、nkg2d、nkg2c和cd19。
[0570]
在一些情况下，跨膜结构域可以借助铰链(例如，来自人蛋白质的铰链)与 car的胞外区连接(例如，car的抗原结合结构域)。例如，在一个实施方案中， 铰链可以是人ig(免疫球蛋白)铰链，例如，igg4铰链，或cd8a铰链。在一个实 施方案中，铰链或间隔序列包含seq id no:2的氨基酸序列(例如，由其组成)。 在一个方面，跨膜结构域包含seq id no:6的跨膜结构域(例如，由其组成)。
[0571]
在一个方面，铰链或间隔序列包含igg4铰链。例如，在一个实施方案中， 铰链或间隔序列包含具有以下氨基酸序列的铰链： eskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnak tkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeem tknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsv mhealhnhytqkslslslgkm(seq id no:3)。在一些实施方案中，铰链或间隔序列包含 由以下核苷酸序列编码的铰链： gagagcaagtacggccctccctgccccccttgccctgcccccgagttcctgggcggacccagcgtgt tcctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccccgaggtgacctgtgtggt ggtggacgtgtcccaggaggaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgca caacgccaagaccaagccccgggaggagcagttcaatagcacctaccgggtggtgtccgtgctgac cgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaggaatacaagtgtaaggtgtccaacaagggcctgcc cagcagcatcgagaaaaccatcagcaaggccaagggccagcctcgggagccccaggtgtacaccct gccccctagccaagaggagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgcctggtgaagggcttcta ccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccacccc ccctgtgctggacagcgacggcagcttcttcctgtacagccggctgaccgtggacaagagccggtg gcaggagggcaacgtctttagctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaa gagcctgagcctgtccctgggcaagatg(seq id no:14).
[0572]
在一个方面，铰链或间隔序列包含igd铰链。例如，在一个实施方案中，铰 链或间隔序列包含具有以下氨基酸序列的铰链： rwpespkaqassvptaqpqaegslakattapattrntgrg
geekkkekekeeqeeretkt pecpshtqplgvylltpavqdlwlrdkatftcfvvgsdlkdahltwevagkvptggvee gllerhsngsqsqhsrltlprslwnagtsvtctlnhpslppqrlmalrepaaqapvklsln llassdppeaaswllcevsgfsppnillmwledqrevntsgfaparpppqpgsttfwawsv lrvpappspqpatytcvvshedsrtllnasrslevsyvtdh(seq id no:4)。在一些实施 方案中，铰链或间隔序列包含由以下核苷酸序列编码的铰链： aggtggcccgaaagtcccaaggcccaggcatctagtgttcctactgcacagccccagg cagaaggcagcctagccaaagctactactgcacctgccactacgcgcaatactggccg tggcggggaggagaagaaaaaggagaaagagaaagaagaacaggaagagagggag accaagacccctgaatgtccatcccatacccagccgctgggcgtctatctcttgactcc cgcagtacaggacttgtggcttagagataaggccacctttacatgtttcgtcgtgggct ctgacctgaaggatgcccatttgacttgggaggttgccggaaaggtacccacaggggg ggttgaggaagggttgctggagcgccattccaatggctctcagagccagcactcaaga ctcacccttccgagatccctgtggaacgccgggacctctgtcacatgtactctaaatca tcctagcctgcccccacagcgtctgatggcccttagagagccagccgcccaggcacca gttaagcttagcctgaatctgctcgccagtagtgatcccccagaggccgccagctggct cttatgcgaagtgtccggctttagcccgcccaacatcttgctcatgtggctggaggacc agcgagaagtgaacaccagcggcttcgctccagcccggcccccaccccagccgggttc taccacattctgggcctggagtgtcttaagggtcccagcaccacctagcccccagcca gccacatacacctgtgttgtgtcccatgaagatagcaggaccctgctaaatgcttctag gagtctggaggtttcctacgtgactgaccatt(seq id no:15)。
[0573]
在一个方面，跨膜结构域可以是重组的，在这种情况下，它将包含优势疏 水的残基如亮氨酸和缬氨酸。在一个方面，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸三联体 可以在重组跨膜结构域的每个末端存在。
[0574]
任选地，2和10个氨基酸长度之间的短寡肽接头或多肽接头可以在car的跨 膜结构域和胞质区域之间形成键接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接 头。例如，在一个方面，接头包含ggggsggggs的氨基酸序列(seq id no:5)。 在一些实施方案中，接头由ggtggcggaggttctggaggtggaggttcc 的核苷酸序列(seq id no:16)编码。
[0575]
在一个方面，铰链或间隔序列包含kir2ds2铰链。
[0576]
胞质结构域
[0577]
本发明car的胞质结构域或区域包含胞内信号结构域。胞内信号结构域能 够活化其中已经引入car的免疫细胞的至少一个正常效应子功能。
[0578]
用于本发明car中的胞内信号结构域的例子包括协同发挥作用以在抗原受 体接合后启动信号转导的t细胞受体(tcr)和共受体的胞质序列，以及这些序列 的任何衍生物或变体和具有相同功能性能力的任何重组序列。
[0579]
已知单独通过tcr生成的信号不足以完全活化t细胞并且还需要次级和/或 共刺激信号。因此，据称t细胞活化可以由两类不同的胞质信号传导序列介导： 通过tcr启动抗原依赖性初级活化的那些序列(初级胞内信号结构域)和以抗原 非依赖性方式发挥作用以提供次级或共刺激信号的那些序列(次级胞质结构域， 例如，共刺激结构域)。
[0580]
初级信号结构域以刺激性方式或以抑制性方式调节tcr复合物的初级活 化。以刺激性方式发挥作用的初级胞内信号结构域可以含有称作基于免疫受体 酪氨酸的活化基序或itam的信号传导基序。
[0581]
含有在本发明中特别有用的itam的初级胞质信号传导序列的例子包括 tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b、 cd278(也称作“icos”)、fcεri、
dap10、dap12和cd66d的那些。在一个实施 方案中，本发明的car包含胞内信号结构域，例如，cd3-ζ的初级信号结构域。
[0582]
在一个实施方案中，初级信号结构域包含修饰的itam结构域，例如，如与 天然itam结构域相比活性改变(例如，增加或减少)的突变itam结构域。在一 个实施方案中，初级信号结构域包含了含有修饰的itam的初级胞内信号结构 域，例如，含有优化和/或截短的itam的初级胞内信号结构域。在一个实施方 案中，初级信号结构域包含一个、两个、三个、四个或更多个itam基序。
[0583]
含有在本发明中特别有用的初级胞内信号结构域的分子的其他例子包括 dap10、dap12和cd32的那些分子。
[0584]
car的胞内信号结构域可以本身包含初级信号结构域，例如，cd3-ζ信号 结构域，或它可以与本发明car背景下有用的任何其他所需的胞内信号结构域 组合。例如，car的胞内信号结构域可以包含初级信号结构域(例如，cd3-ζ链 部分)和共刺激信号结构域。共刺激信号结构域指包含共刺激分子的胞内结构域 的car部分。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外淋巴细胞对抗原作出有效 反应所需要的细胞表面分子。这类分子的例子包括mhc i类分子、tnf受体蛋 白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、淋巴细胞活化信号分子 (slam蛋白)、活化nk细胞受体、btla、toll配体受体、ox40、cd2、cd7、 cd27、cd28、cd30、cd40、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、4-1bb (cd137)、b7-h3、cds、icam-1、icos(cd278)、gitr、baffr、light、 hvem(lightr)、kirds2、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、 nkp46、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、 itgae、cd103、itgal、cd11a、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、 itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、nkg2d、nkg2c、tnfr2、 trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96 (tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100 (sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、ly108)、slam(slamf1、cd150、 ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、 pag/cbp、cd19a和与cd83特异性结合的配体。例如，cd27共刺激作用已经 证实在体外增强人cart细胞的扩充、效应子功能和存活并且在体内增进人t细 胞留存和抗肿瘤活性(song等人,blood.2012；119(3):696-706)。
[0585]
在本发明car的胞质部分内部的胞内信号传导序列可以彼此按随机顺序或 指定顺序连接。任选地，例如2个和10个氨基酸(例如，2、3、4、5、6、7、8、 9或10个氨基酸)长度之间的短寡肽接头或多肽接头可以在胞内信号传导序列之 间形成键接。在一个实施方案中，甘氨酸-丝氨酸双联体可以用作合适的接头。 在一个实施方案中，单个氨基酸，例如，丙氨酸、甘氨酸，可以用作合适的接 头。
[0586]
在一个方面，胞内信号结构域设计成包含两个或更多个(例如，2、3、4、5 或更多个)共刺激信号结构域。在一个实施方案中，两个或更多个(例如，2、3、 4、5或更多个)共刺激信号结构域由接头分子(例如，本文所述的接头分子)分开。 在一个实施方案中，胞内信号结构域包含两个共刺激信号结构域。在一些实施 方案中，接头分子是甘氨酸残基。在一些实施方案中，接头是丙氨酸残基。
[0587]
在一个方面，胞内信号结构域设计成包含cd3-ζ的信号结构域和cd28的信 号结构域。在一个方面，胞内信号结构域设计成包含cd3-ζ的信号结构域和 4-1bb的信号结构域。
ceacam-3和/或ceacam-5)、lag3、vista、btla、tigit、lair1、 cd160、2b4、cd80、cd86、b7-h3(cd276)、b7-h4(vtcn1)、hvem (tnfrsf14或cd270)、kir、a2ar、mhc i类、mhc ii类、gal9、腺苷 和tgfr(例如tgfrβ)的胞内结构域。
[0594]
在一个实施方案中，当表达car的细胞包含两种或更多种不同car时，不 同car的抗原结合结构域可以是这样的，从而抗原结合结构域彼此不相互作用。 例如，表达第一和第二car的细胞可以具有第一car的抗原结合结构域，例如， 作为不与第二car的抗原结合结构域形成缔合的片段(例如，scfv)，例如，第二 car的抗原结合结构域是vhh。
[0595]
在一些实施方案中，抗原结合结构域包含单结构域抗原结合(sdab)分子， 包括其互补决定区是单结构域多肽组成部分的分子。例子包括但不限于重链可 变结构域、天然缺少轻链的结合分子、衍生自常规四链抗体的单结构域、工程 化结构域和除衍生自抗体的那些之外的单结构域支架。sdab分子可以是现有技 术的任何分子，或将来的任何单结构域分子。sdab分子可以衍生自任何物种， 包括但不限于小鼠、人、骆驼、羊驼、七鳃鳗、鱼、鲨鱼、山羊、兔和牛。这 个术语还包括来自骆驼属(camelidae)和鲨鱼之外的物种中的天然存在的单结构 域抗体分子。
[0596]
在一个方面，sdab分子可以衍生自鱼类中存在的免疫球蛋白的可变区，如， 例如，从鲨鱼血清中存在的称作新抗原受体(nar)的免疫球蛋白同种型衍生的 那种可变区。产生从nar可变区衍生的单结构域分子(“ignar”)的方法在wo03/014161和streltsov(2005)protein sci.14:2901-2909中描述。
[0597]
根据另一个方面，sdab分子是天然存在的单结构域抗原结合分子，称作缺 少轻链的重链。这类单结构域分子例如在wo 9404678和hamers-casterman,c. 等人,(1993)nature 363:446-448中公开。出于清晰原因，从天然缺少轻链的重 链分子衍生的这种可变结构域在本文中称作vhh或纳米体以将它与四链免疫球 蛋白的常规vh区分。这种vhh分子可以衍生自骆驼属(camelidae)物种，例如 骆驼、羊驼、单峰驼、驼羊和原驼。除骆驼属之外的其他物种可以产生天然缺 少轻链的重链分子；这类vhh处于本发明的范围内。
[0598]
sdab分子可以是重组的、cdr移植的、人源化、骆驼化、去免疫化和/或 在体外生成(例如，通过噬菌体展示法选择)。
[0599]
也已经发现，可能不想要具有多个膜嵌入型嵌合受体的细胞，所述嵌合膜 嵌入型受体包含在受体的抗原结合结构域之间相互作用的抗原结合结构域，例 如，原因在于它抑制一个或多个抗原结合结构域与其相应抗原结合的能力。因 此，本文公开了具有第一和第二非天然存在的膜嵌入型嵌合受体的细胞，所述 膜嵌入型嵌合受体包含使这类相互作用最小化的抗原结合结构域。本文还公开 了编码第一和第二非天然存在的膜嵌入型嵌合受体的核酸，所述膜嵌入型嵌合 受体包含使这类相互作用最小化的抗原结合结构域。以及产生和使用这类细胞 和核酸的方法。在一个实施方案中，所述第一和所述第二非天然存在的膜嵌入 型嵌合受体之一的抗原结合结构域包含scfv，并且另一者包含单一vh结构域， 例如，驼类、鲨鱼或七鳃鳗单一vh结构域，或从人或小鼠序列衍生的单一vh 结构域。
[0600]
在一些实施方案中，要求保护的发明包含第一和第二car，其中所述第一 car和所述第二car之一的抗原结合结构域不包含可变轻链结构域和可变重 链结构域。在一些实施方案中，所述第一car和所述第二car之一的抗原结合 结构域是scfv，并且另一者不是scfv。在一些实施方案中，所述第一car和所 述第二car之一的抗原结合结构域包含单一vh
结构域，例如，驼类、鲨鱼或七 鳃鳗单一vh结构域，或从人或小鼠序列衍生的单一vh结构域。在一些实施方 案中，所述第一car和所述第二car之一的抗原结合结构域包含纳米体。在一 些实施方案中，所述第一car和所述第二car之一的抗原结合结构域包含驼类 vhh结构域。
[0601]
在一些实施方案中，所述第一car和所述第二car之一的抗原结合结构域 包含scfv，并且另一者包含单一vh结构域，例如，驼类、鲨鱼或七鳃鳗单一vh 结构域，或从人或小鼠序列衍生的单一vh结构域。在一些实施方案中，所述第 一car和所述第二car之一的抗原结合结构域包含scfv，并且另一者包含纳米 体。在一些实施方案中，所述第一car和所述第二car之一的抗原结合结构域 包含scfv，并且另一者包含驼类vhh结构域。
[0602]
在一些实施方案中，当在细胞表面上存在时，所述第一car的抗原结合结 构域与其相应抗原的结合基本上不因所述第二car的存在而降低。在一些实施 方案中，所述第一car的抗原结合结构域与其相应抗原在所述第二car存在的 结合是所述第一car的抗原结合结构域与其相应抗原在所述第二car不存在 下的结合的85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
[0603]
在一些实施方案中，在细胞表面上存在时，所述第一car的抗原结合结构 域和所述第二car的抗原结合结构域彼此比二种抗原结合结构域均为scfv抗原 结合结构域时缔合更小。在一些实施方案中，所述第一car的抗原结合结构域 和所述第二car的抗原结合结构域彼此比二种抗原结合结构域均为scfv抗原结 合结构域时缔合小85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
[0604]
在另一个方面，本文所述的表达car的细胞还可以表达另一种物质，例如， 增强表达car的细胞活性的物质。例如，在一个实施方案中，该物质可以是对 抑制性分子抑制的物质。在一些实施方案中，抑制性分子(例如，pd1)可以降低 表达car的细胞发动免疫效应子反应的能力。抑制性分子的例子包括pd1、 pd-l1、pd-l2、ctla4、tim3、ceacam(例如，ceacam-1、ceacam-3 和/或ceacam-5)、lag3、vista、btla、tig、lair1、cd160、2b4、cd80、cd86、b7-h3(cd276)、b7-h4(vtcn1)、hvem(tnfrsf14或cd270)、 kir、a2ar、mhc i类、mhc ii类、gal9、腺苷和tgfr(tgfrβ)。在 一个实施方案中，对抑制性分子抑制的物质例如是本文所述的分子，例如，是 这样的物质，所述物质包含第一多肽(例如，抑制性分子)，所述第一多肽与提供 正向信号给细胞的第二多肽(例如，本文所述的胞内信号结构域)缔合。在一个实 施方案中，该物质包含例如抑制性分子如pd1、pd-l1、pd-l2、ctla4、tim3、 ceacam(例如，ceacam-1、ceacam-3和/或ceacam-5)、lag3、vista， btla、tigit、lair1、cd160，2b4、cd80、cd86，b7-h3(cd276)、b7-h4 (vtcn1)、hvem(tnfrsf14或cd270)、kir、a2ar、mhc i类，mhc ii 类、gal9、腺苷和tgfr(tgfrβ)或这些分子中任一者的片段(例如，这些 分子中任一者的胞外结构域的至少一部分)的第一多肽和作为本文所述的胞内 信号结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，如本文所述的41bb、cd27或cd28) 和/或初级信号结构域(例如，本文所述的cd3ζ信号结构域)的第二多肽。在一 个实施方案中，该物质包含pd1或其片段(例如，pd1的胞外结构域的至少一部 分)的第一多肽和本文所述的胞内信号结构域(例如，本文所述的cd28信号结构 域和/或本文所述的cd3ζ信号结构域)的第二多肽。在实施方案中，本文所述的 表达car的细胞包含转换开关共刺激受体，例如，如通过引用的方式完整并入 本文的wo 2013/019615中所述。pd1是受体cd28家族的抑制性成员，所述 家族还包括cd28、
ctla-4、icos和btla。pd-1在活化的b细胞、t细胞 和髓样细胞上表达(agata等人,1996 int.immunol 8:765-75)。已经显示与pd1 结合时，pd1、pd-l1和pd-l2的两种配体下调t细胞活化(freeman等人,2000j exp med 192:1027-34；latchman等人,2001nat immunol 2:261-8；carter 等人,2002 eur j immunol 32:634-43)。pd-l1在人类癌症中丰富(dong等人, 2003 j mol med 81:281-7；blank等人,2005 cancer immunol.immunother54:307-314；konishi等人,2004 clin cancer res 10:5094)。可以通过抑制pd1 与pd-l1的局部相互作用，逆转免疫抑制作用。
[0605]
在一个实施方案中，该物质包含抑制性分子(例如，程序性死亡1(pd1))的胞 外结构域(ecd)，可以与跨膜结构域和胞内信号结构域如41bb和cd3ζ融合(本文 也称作pd1 car)。在一个实施方案中，与本文所述的cd123 car组合使用时，pd1 car改善表达car的细胞(例如，t细胞或nk细胞)的持久性。在一个实施 方案中，car是pd1 car，其包含如seq id no:24中加下划线所示的pd1胞 外结构域。在一个实施方案中，pd1 car包含seq id no:24的氨基酸序列。
[0606]
malpvtalllplalllhaarppgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiw aplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayk qgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrg kghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seq id no:24)。
[0607]
在一个实施方案中，pd1 car包含下文提供的氨基酸序列(seq id no: 22)。
[0608]
pgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckr grkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeyd vldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtyd alhmqalppr(seq id no:22)。
[0609]
在一个实施方案中，该物质包含编码pd1 car的核酸序列(例如，本文所述 的pd1 car)。在一个实施方案中，下文显示了pd1 car的核酸序列，下文在 seq id no:23中将pd1 ecd加下划线
[0610]
atggccctccctgtcactgccctgcttctccccctcgcactcctgctccacgccgctagaccacccggatggtttctggactctccggatcgcccgtggaatcccccaaccttctcaccggcactcttggttgtgactgagggcgataatgcgaccttcacgtgctcgttctccaacacctccgaatcattcgtgctgaactggtaccgcatgagcccgtcaaaccagaccgacaagctcgccgcgtttccggaagatcggtcgcaaccgggacaggattgtcggttccgcgtgactcaactgccgaatggcagagacttccacatgagcgtggtccgcgctaggcgaaacgactccgggacctacctgtgcggagccatctcgctggcgcctaaggcccaaatcaaagagagcttgagggccgaactgagagtgaccgagcgcagagctgaggtgccaactgcacatccatccccatcgcctcggcctgcggggcagtttcagaccctggtcacgaccactccggcgc cgcgcccaccgactccggccccaactatcgcgagccagcccctgtcgctgaggccggaagcatgccgccctgccg ccggaggtgctgtgcatacccggggattggacttcgcatgcgacatctacatttgggctcctctcgccggaacttgt ggcgtgctccttctgtccctggtcatcaccctgtactgcaagcggggtcggaaaaagcttctgtacat
tttcaagcag cccttcatgaggcccgtgcaaaccacccaggaggaggacggttgctcctgccggttccccgaagaggaagaagg aggttgcgagctgcgcgtgaagttctcccggagcgccgacgcccccgcctataagcagggccagaaccagctgta caacgaactgaacctgggacggcgggaagagtacgatgtgctggacaagcggcgcggccgggaccccgaaatg ggcgggaagcctagaagaaagaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaagatggccgag gcctactccgaaattgggatgaagggagagcggcggaggggaaaggggcacgacggcctgtaccaaggactgt ccaccgccaccaaggacacatacgatgccctgcacatgcaggcccttccccctcgc(seq id no:23)。
[0611]
在另一个方面，本发明提供表达car的细胞(例如，cart细胞或表达car 的nk细胞)的群体。在一些实施方案中，表达car的细胞群体包含表达不同car 的细胞的混合物。例如，在一个实施方案中，表达car的细胞(例如，cart细 胞或表达car的nk细胞)的群体可以包含表达具有本文所述的cd123结合结构 域的car的第一细胞和表达具有不同cd123结合结构域(例如，与在第一细胞表 达的car中的cd123结合结构域不同的本文所述的cd123结合结构域)的car 的第二细胞。作为另一个例子，表达car的细胞的群体可以包含表达下述car 的第一细胞，所述car包含(例如，如本文所述的)cd123结合结构域，和表达下 述car的第二细胞，所述car包含针对除cd123以外的靶(例如，cd33、cd34、 cll-1、flt3或叶酸受体β)的抗原结合结构域。在一个实施方案中，表达car 的细胞的群体包含例如表达下述car的第一细胞，所述car包含初级胞内信号 结构域，和表达下述car的第二细胞，所述car包含次级信号结构域，例如， 共刺激信号结构域。
[0612]
在另一个方面，本发明提供细胞群体，其中，群体中的至少一个细胞表达 具有本文所述的cd123结合结构域的car，和表达另一种物质(例如，增强表 达car的细胞活性的物质)的第二细胞。例如，在一个实施方案中，该物质可 以是对抑制性分子抑制的物质。在一些实施方案中，抑制性分子例如可以降低 表达car的细胞发动免疫效应子反应的能力。抑制性分子的例子包括pd1、 pd-l1、pd-l2、ctla4、tim3、ceacam(例如，ceacam-1、ceacam-3 和/或ceacam-5)、lag3、vista、btla、tig、lair1、cd160、2b4、 cd80、cd86、b7-h3(cd276)、b7-h4(vtcn1)、hvem(tnfrsf14或cd270)、 kir、a2ar、mhc i类、mhc ii类、gal9、腺苷和tgfr(例如tgfrβ)。 在一个实施方案中，对抑制性分子抑制的物质例如是本文描述的分子，例如包 含第一多肽(例如，抑制性分子)的物质，所述第一多肽与提供正向信号给细胞 的第二多肽(例如，本文所述的胞内信号结构域)缔合。在一个实施方案中，该物 质包含例如抑制性分子如pd1、pd-l1、pd-l2、ctla4、tim3、ceacam(例 如，ceacam-1、ceacam-3和/或ceacam-5)、lag3、vista，btla、 tigit、lair1、cd160，2b4、cd80、cd86，b7-h3(cd276)、b7-h4(vtcn1)、 hvem(tnfrsf14或cd270)、kir、a2ar、mhc i类，mhc ii类、gal9、 腺苷和tgfr(例如tgfrβ)或这些分子中任一者的片段(例如，这些分子中 任一者的胞外结构域的至少一部分)的第一多肽和作为本文所述的胞内信号结 构域(例如，包含共刺激结构域(例如，如本文所述的41bb、cd27或cd28)和/ 或初级信号结构域(例如，本文所述的cd3ζ信号结构域)的第二多肽。在一个实 施方案中，该物质包含pd1或其片段(例如，pd1的胞外结构域的至少一部分) 的第一多肽和本文所述的胞内信号结构域(例如，本文所述的cd28信号结构域 和/或本文所述的cd3ζ信号结构域)的第二多肽。
[0613]
在一个方面，本发明提供多种方法，所述方法包括施用与另一个物质(例如， 激酶抑制剂，如本文所述的激酶抑制剂)组合的表达car的细胞(例如，cart 细胞或表达car的nk细胞)的群体，例如，表达不同car的细胞的混合物。在 另一个方面，本发明提供了这样的方
法，所述方法施用与另一个物质(例如，激 酶抑制剂，如本文所述的激酶抑制剂)组合的细胞群体，其中该群体中的至少一 个细胞表达具有如本文所述的抗癌相关性抗原结合结构域的car，和表达另一 种物质(例如，增强表达car的细胞活性的物质)的第二细胞。
[0614]
天然杀伤细胞受体(nkr)car
[0615]
在一个实施方案中，本文所述的car分子包含天然杀伤细胞受体(nkr)的 一种或多种组分，因而形成nkr-car。nkr组分可以是来自以下任何天然杀 伤细胞受体的跨膜结构域、铰链结构域或胞质结构域：杀伤细胞免疫球蛋白样 受体(kir)，例如kir2dl1、kir2dl2/l3、kir2dl4、kir2dl5a、kir2dl5b、 kir2ds1、kir2ds2、kir2ds3、kir2ds4、dir2ds5、kir3dl1/s1、kir3dl2、 kir3dl3、kir2dp1和kir3dp1；天然细胞毒性受体(ncr)，例如，nkp30、 nkp44、nkp46；免疫细胞受体的信号传导淋巴细胞活化分子(slam)家族，例 如，cd48、cd229、2b4、cd84、ntb-a、cra、blame和cd2f-10；fc受 体(fcr)，例如，cd16、和cd64；和ly49受体，例如，ly49a、ly49c。本文 所述的nkr-car分子可以与衔接子分子或胞内信号结构域(例如，dap12)相互 作用。国际公开号wo2014/145252中描述了包含nkr组分的car分子的示例性 布局和序列，所述文献的内容因而通过引用的方式完整并入。
[0616]
分拆的car(split car)
[0617]
在一些实施方案中，表达car的细胞使用分拆的car。分拆的car方法在 出版物wo2014/055442和wo2014/055657中更详细地描述，其通过引用并入本 文。简言之，分拆的car系统包含表达第一car的细胞，所述第一car具有第 一抗原结合结构域和共刺激结构域(例如，41bb)，并且所述细胞还表达第二 car，所述第二car具有第二抗原结合结构域和胞内信号结构域(例如，cd3 ζ)。当细胞遇到第一抗原时，共刺激结构域被激活，并且细胞增殖。当细胞 遇到第二抗原时，细胞内信号结构域被激活，细胞杀伤活性开始。因此，表达 car的细胞仅在两种抗原的存在下完全活化。在实施方案中，第一抗原结合结 构域识别cd123，例如包含本文所述的抗原结合结构域，以及第二抗原结合结 构域识别在急性髓性白血病细胞例如cll-1、cd33、cd34、flt3或叶酸受体 β上表达的抗原。在实施方案中，第一抗原结合结构域识别cd123，例如包含 本文所述的抗原结合结构域，以及第二抗原结合结构域识别在b细胞上表达的抗 原例如cd19、cd20、cd22或ror1。
[0618]
调节嵌合抗原受体的策略
[0619]
存在可以调节car活性的许多方式。在一些实施方案中，其中car活性可 以控制的可调节性car(rcar)是优化car疗法的安全性和疗效需要的。例如， 使用例如与二聚化结构域融合的胱天蛋白酶诱导凋亡(参见，例如，di等人,nengl.j.med.2011 nov.3；365(18):1673-1683)可以用作本发明car治疗中的安 全开关。在另一个例子中，当施用导致胱天蛋白酶-9激活和细胞凋亡的二聚化 药物(例如，rimiducid(也称作ap1903(bellicum pharmaceuticals)或ap20187 (ariad))时，表达car的细胞也可以表达诱导型胱天蛋白酶-9(icaspase-9)分子。 icaspase-9分子含有在cid存在下介导二聚化的二聚化过程化学诱导物(cid)结 构域。这导致表达car的细胞诱导性消耗和选择性消耗。在一些情况下，icaspase-9分子由独立于car编码载体的核酸分子编码。在一些情况下， icaspase-9分子由与car编码载体相同的核酸分子编码。icaspase-9可以提供安 全开关以避免表达car的细胞的任何毒性。参见，例如，song等人,cancer genether.2008；15(10):667-75；临床试验识别号nct02107963；和di stasi等人,n. engl.j.med.2011；365:1673-83。
[0620]
调节本发明car疗法的备选策略包括利用小分子或抗体，所述小分子或抗 体失活或关闭car活性，例如，通过消除表达car的细胞，例如，通过诱导抗 体依赖的细胞介导细胞毒性(adcc)实施。例如，本文所述的表达car的细胞还 可以表达由能够诱导细胞死亡(例如，adcc或补体诱导的细胞死亡)的分子识别 的抗原。例如，本文所述的表达car的细胞还可以表达能够被抗体或抗体片段 靶向的受体。这类受体的例子包括epcam、vegfr、整联蛋白(例如，整联蛋 白ανβ3、α4、αι3/4β3、α4β7、α5β1、ανβ3、αν)、tnf受体超家族成员(例如， trail-r1、trail-r2)、pdgf受体、干扰素受体、叶酸受体、gpnmb、icam-1、 hla-dr、cea、ca-125、muc1、tag-72、il-6受体、5t4、gd2、gd、 cd2、cd3、cd4、cd5、cd11、cd11a/lfa-1、cd15、cd18/itgb2、cd19、 cd20、cd22、cd23/lge受体、cd25、cd28、cd30、cd33、cd38、cd40、 cd41、cd44、cd51、cd52、cd62l、cd74、cd80、cd125、cd147/basigin、 cd152/ctla-4、cd154/cd40l、cd195/ccr5、cd319/slamf7和egfr及 其截短形式(例如，保留一个或多个胞外表位但缺少胞质结构域内部一个或多个 区域的形式)。
[0621]
例如，本文所述的表达car的细胞还可以表达截短的表皮生长因子受体 (egfr)，所述截短的表皮生长因子受体缺少信号传导能力，但是保留由能够诱 导adcc的分子(例如，西妥昔单抗)识别的表位，从而西妥昔单抗 的施用引起adcc和表达car的细胞后续消耗(参见，例如，wo 2011/056894， 和jonnalagadd等人,gene ther.2013；20(8)853-860)。另一种策略包括在本文所 述的表达car的细胞中表达合并来自cd32抗原和cd20抗原的靶表位的高度紧 凑型标志物/自杀基因，所述的高度紧凑型标志物/自杀基因表达物结合利妥昔单 抗，导致表达car的细胞选择性消耗，例如，通过adcc做到(参见，例如，philip 等人,blood.2014；124(8)1277-1287)。用于消耗本文所述的表达car的细胞的其 他方法包括施用campath，一种选择性结合并靶向成熟淋巴细胞(例如，表达 car的细胞)以破坏(例如，通过诱导adcc进行破坏)的单克隆抗cd52抗体。在 其他实施方案中，可以使用car配体(例如，抗独特型抗体)选择性地靶向表达 car的细胞。在一些实施方案中，抗独特型抗体可以造成效应细胞活性，例如 adcc或adc活性，因而减少表达car的细胞的数目。在其他实施方案中，car 配体，例如，抗独特型抗体，可以偶联至诱导细胞杀伤的物质(例如，毒素)，因 而减少表达car的细胞的数目。备选地，car分子本身可以如此设置，从而可 以调节活性，例如，开启和关闭，如下文描述。
[0622]
在其他实施方案中，本文所述的表达car的细胞还可以表达由t细胞消耗 剂识别的靶蛋白。在一个实施方案中，靶蛋白是cd20，t细胞消耗剂是抗cd20 抗体，例如利妥昔单抗。在这样的实施方案中，一旦需要减少或消除表达car 的细胞，例如以减轻car诱导的毒性，就施用t细胞消耗剂。在其他实施方案 中，t细胞消耗剂是如本文实施例中所述的抗cd52抗体，例如阿仑单抗。
[0623]
在其他实施方案中，rcar包含一组多肽，在最简单的实施方案中一般两 种多肽，其中本文所述的标准car的组件(例如，抗原结合结构域和胞内信号结 构域)分配在分离的多肽或构件上。在一些实施方案中，该组多肽包括二聚化开 关，其中存在二聚化分子时，所述二聚化开关可以使多肽彼此偶联，例如，可 以使抗原结合结构域与胞内信号结构域偶联。本文中和国际公开号wo 2015/090229中提供对这类调节型car的额外描述和示例性布局，所述文献因而 通过引用的方式完整地并入。
[0624]
在一个方面中，rcar包含两种多肽或构件：1)包含胞内信号结构域(例如， 本文所
述的初级胞内信号结构域)和第一开关结构域的胞内信号传导构件；2)包 含如本文所述的(例如特异性结合本文所述的肿瘤抗原的)抗原结合结构域和第 二开关结构域的抗原结合构件。任选地，rcar包含本文所述的跨膜结构域。 在一个实施方案中，可以在胞内信号传导构件上、抗原结合构件上或在这两者 上设置跨膜结构域。(除非另外说明，否则本文中描述rcar的构件或元件时， 该顺序可以是如所提供的那样，但是也可以包括其他顺序)。换而言之，在一个 实施方案中，顺序如文本中所述那样，但是在其他实施方案中，顺序可以是不 同的。例如，在跨膜区一侧上的各元件顺序可以与例子不同，例如，开关结构 域相对于胞内信号结构域的安置可以是不同的，例如，是反向的。
[0625]
在一个实施方案中，第一开关结构域和第二开关结构域可以形成胞内或胞 外二聚化开关。在一个实施方案中，二聚化开关可以是同型二聚化开关，例如， 其中第一开关结构域和第二开关结构域是相同的，或异二聚化开关，例如，其 中第一开关结构域和第二开关结构域彼此不同。
[0626]
在实施方案中，rcar可以包含“多重开关”。多重开关可以包含异二聚化 开关结构域或同型二聚化开关结构域。多重开关在第一构件(例如，抗原结合构 件)和第二构件(例如，胞内信号传导构件)上独立地包含多个例如，2、3、4、5、 6、7、8、9、或10个开关结构域。在一个实施方案中，第一构件可以包含多个 第一开关结构域，例如，基于fkbp的开关结构域，并且第二构件可以包含多个 第二开关结构域，例如，基于frb的开关结构域。在一个实施方案中，第一构 件可以包含第一开关结构域和第二开关结构域，例如，基于fkbp的开关结构域 和基于frb的开关结构域，并且第二构件可以包含第一开关结构域和第二开关 结构域，例如，基于fkbp的开关结构域和基于frb的开关结构域。
[0627]
在一个实施方案中，胞内信号传导构件包含一个或多个胞内信号结构域(例 如，初级胞内信号结构域和一个或多个共刺激信号结构域)。
[0628]
在一个实施方案中，抗原结合构件可以包含一个或多个胞内信号结构域， 例如，一个或多个共刺激信号结构域。在一个实施方案中，抗原结合构件包含 多个，例如，2个或3个本文所述的共刺激信号结构域，例如，选自4-1bb、cd28、 cd27、icos和ox40的共刺激信号结构域，并且在多个实施方案中，不包含初 级胞内信号结构域。在一个实施方案中，抗原结合构件从胞外至胞内方向包含 以下共刺激信号结构域：4-1bb-cd27；4-1bb-cd27；cd27-4-1bb；4-1bb-cd28； cd28-4-1bb；ox40-cd28；cd28-ox40；cd28-4-1bb；或4-1bb-cd28。在这 类实施方案中，胞内结合构件包含cd3ζ结构域。在这样一个实施方案中，rcar 包含(1)抗原结合构件，所述抗原结合构件包含抗原结合结构域、跨膜结构域和 两个共刺激结构域和第一开关结构域；和(2)胞内信号结构域，所述胞内信号结 构域包含跨膜结构域或膜束缚结构域和至少一个初级胞内信号结构域和第二开 关结构域。
[0629]
一个实施方案提供了其中抗原结合构件未束缚于car细胞表面的rcar。 这允许具有胞内信号传导构件的细胞在不用编码抗原结合构件的序列转化细胞 的情况下便利地与一个或多个抗原结合结构域配对。在这类实施方案中，rcar 包含：1)胞内信号传导构件，所述胞内信号传导构件包含：第一开关结构域、 跨膜结构域、胞内信号结构域(例如，初级胞内信号结构域)和第一开关结构域； 和2)抗原结合构件，所述抗原结合构件包含：抗原结合结构域和第二开关结构 域，其中抗原结合构件不包含跨膜结构域或膜束缚结构域并且任选地不包含胞 内信号结构域。在一些实施方案中，rcar还可以包含3)第二抗原结合构件，
所 述第二抗原结合构件包含第二抗原结合结构域，例如，结合被抗原结合结构域 结合的不同抗原的第二抗原结合结构域；和第二开关结构域。
[0630]
本文中还提供其中抗原结合构件包含双特异性激活和靶向能力的rcar。 在这个实施方案中，抗原结合构件可以包含多个，例如，2、3、4、或5个抗原 结合结构域，例如，scfv，其中每种抗原结合结构域结合至靶抗原，例如不同 的抗原或相同的抗原，例如，相同抗原上的相同或不同表位。在一个实施方案 中，多个抗原结合结构域串联，并且任选地，接头或铰链区布置在每个抗原结 合结构域之间。本文中描述了合适的接头和铰链区。
[0631]
一个实施方案提供了具有允许增殖变换的布局的rcar。在这个实施方案 中，该rcar包含：1)胞内信号传导构件，所述胞内信号传导构件包含：任选地， 跨膜结构域或膜束缚结构域；一种或多种(例如，选自4-1bb、cd28、cd27、icos 和ox40的)共刺激信号结构域，以及开关结构域；和2)抗原结合构件，所述抗原 结合构件包含：抗原结合结构域、跨膜结构域和初级胞内信号结构域(例如，cd3ζ 结构域)，其中抗原结合构件不包含开关结构域或不包含与胞内信号传导构件上 开关结构域二聚化的开关结构域。在一个实施方案中，抗原结合构件不包含共 刺激信号结构域。在一个实施方案中，胞内信号传导构件包含来自同型二聚化 开关的开关结构域。在一个实施方案中，胞内信号传导构件包含异二聚化开关 的第一开关结构域，并且rcar包含第二胞内信号传导构件，所述第二胞内信 号传导构件包含异二聚化开关的第二开关结构域。在这类实施方案中，第二胞 内信号传导构件包含与胞内信号传导构件相同的胞内信号结构域。在一个实施 方案中，二聚化开关是胞内的。在一个实施方案中，二聚化开关是胞外的。
[0632]
在本文描述的任何rcar布局中，第一开关结构域和第二开关结构域包含 如本文所述的基于fkbp-frb的开关。
[0633]
本文中还提供包含本文所述的rcar的细胞。经工程化以表达rcar的任何 细胞可以用作rcarx细胞。在一个实施方案中，rcarx细胞是t细胞并且称 作rcart细胞。在一个实施方案中，rcarx细胞是nk细胞并且称作rcarn 细胞。
[0634]
本文中还提供包含编码rcar的序列的核酸和载体。编码rcar的多种元件 的序列可以设置在相同的核酸分子上，例如，相同的质粒或载体，例如，病毒 载体，例如，慢病毒载体。在一个实施方案中，(i)编码抗原结合构件的序列和(ii) 编码胞内信号传导构件的序列可以存在于相同的核酸(例如，载体)上。可以例如 通过使用独立的启动子，或通过使用双顺反子转录产物(通过切割单一翻译产物 或通过翻译两种独立的蛋白质产物，所述双顺反子转录产物可以导致产生两种 蛋白质)实现相应蛋白质的产生。在一个实施方案中，编码可切割肽的序列(例如， p2a或f2a序列)布置在(i)和(ii)之间。在一个实施方案中，编码ires(例如， emcv或ev71ires)的序列布置在(i)和(ii)之间。在这些实施方案中，(i)和(ii) 转录为单个rna。在一个实施方案中，第一启动子与(i)有效连接并且第二启动 子与(ii)有效连接，从而(i)和(ii)转录为独立的mrna。
[0635]
备选地，编码rcar的多种元件的序列可以设置在不同的核酸分子上，例 如，不同的质粒或载体，例如，病毒载体，例如，慢病毒载体。例如，(i)编码 抗原结合构件的序列可以存在于第一核酸(例如，第一载体)上，并且(ii)编码胞 内信号传导构件的序列可以存在于第二核酸(例如，第二载体)上。
[0636]
二聚化开关
[0637]
二聚化开关可以是非共价或共价的。在非共价二聚化开关中，二聚化分子 促进各开关结构域之间的非共价相互作用。在共价二聚化开关中，二聚化分子 促进各开关结构域之间的共价相互作用。
[0638]
在一个实施方案中，rcar包含基于fkbp/frap或基于fkbp/frb的二聚 化开关。fkbp12(fkbp、或fk506结合蛋白)是充当天然产物免疫抑制药物雷 帕霉素的初始胞内靶的丰富胞质蛋白。雷帕霉素与fkbp结合并且与大pi3k同 源物frap(raft、mtor)结合。frb是frap的93氨基酸部分，所述部分足以 结合fkbp-雷帕霉素复合物(chen,j.,zheng,x.f.,brown,e.j.和schreiber,s. l.(1995)identification of an 11-kda fkbp12-rapamycin-binding domain withinthe 289-kda fkbp12-rapamycin-associated protein and characterization of acritical serine residue.proc natl acad sci u s a 92:4947-51)。
[0639]
在实施方案中，基于fkbp/frap(例如，基于fkbp/frb)的开关可以使用 二聚化分子，例如，雷帕霉素或雷帕霉素类似物。
[0640]
fkbp的氨基酸序列如下：
[0641]
d v p d y a s l g g p s s p k k k r k v s r g v q v e t i s p g d gr t f p k r g q t c v v h y t g m l e d g k k f d s s r d r n k p f k fm l g k q e v i r g w e e g v a q m s v g q r a k l t i s p d y a y ga t g h p g i i p p h a t l v f d v e l l k l e t s y(seq id no:588)。
[0642]
在实施方案中，fkbp开关结构域可以包含具有在雷帕霉素或雷帕霉素类似 物存在下与frb或其片段或类似物结合的能力的fkbp片段，例如，seq id no: 588中的下列部分，其是：
[0643]
v q v e t i s p g d g r t f p k r g q t c v v h y t g m l e d g k k fd s s r d r n k p f k f m l g k q e v i r g w e e g v a q m s v g q ra k l t i s p d y a y g a t g h p g i i p p h a t l v f d v e l l k l e ts(seq id no:589)。
[0644]
frb的氨基酸序列如下：
[0645]
ilwhemwheg leeasrlyfg ernvkgmfev leplhammer gpqtlketsf nqaygrdlme aqewcrkymk sgnvkdltqa wdlyyhvfrr isk(seq id no:590)
[0646]
如该术语在本文中所用那样，“基于fkbp/frap(例如，基于fkbp/frb) 的开关”指包含第一开关结构域和第二开关结构域的二聚化开关，所述第一开关 结构域包含了具有在雷帕霉素或雷帕霉素类似物(例如，rad001)存在下与frb 或其片段或类似物结合的能力的fkbp片段或其类似物并且与seq id no:54 或55的fkbp序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、 98％或99％同一性或差异不多于30、25、20、15、10、5、4、3、2或1个氨基酸 残基；所述第二开关结构域包含了具有在雷帕霉素或雷帕霉素类似物存在下与frb或片段或其类似物结合的能力的frb片段或其类似物并且与seq id no: 56的frb序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、 98％或99％同一性或差异不多于30、25、20、15、10、5、4、3、2或1个氨基酸 残基。在一个实施方案中，本文所述的rcar包含含有在seq id no:588(或 seq id no:589)中公开的氨基酸残基的一个开关结构域和含有在seq id no: 590中公开的氨基酸残基的一个开关结构域。
[0647]
在实施方案中，fkbp/frb二聚化开关包含修饰的frb开关结构域，所述 修饰的frb开关结构域显示出改变(例如，增强)基于frb的开关结构域(例如， 修饰的frb开关结构域、基于fkbp的开关结构域)和二聚化分子(例如，雷帕霉 素或雷帕霉素类似物，例如，rad001)之间的复合物形成。在一个实施方案中， 修饰的frb开关结构域包含一个或多个突变，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、 10个或更多个选自氨基酸位置l2031、e2032、s2035、r2036、f2039、g2040、 t2098、w2101、d2102、y2105和f2108处的突变，其中野生型氨基酸突变成任 何其他天然存在的氨基酸。在一个实施方案中，突变frb包含在e2032处的突变， 其中e2032突变成苯丙氨酸(e2032f)、甲硫氨酸(e2032m)、精氨酸(e2032r)、 缬氨酸(e2032v)、酪氨酸(e2032y)、异亮氨酸(e2032i)(例如，seq id no:591) 或亮氨酸(e2032l)(例如，seq id no:592)。在一个实施方案中，突变frb包 含在t2098处的突变，其中t2098突变成苯丙氨酸(t2098f)或亮氨酸(t2098l)， 例如，seq id no:593。在一个实施方案中，突变frb包含在e2032处和t2098 处的突变，其中e2032突变成任何氨基酸并且其中t2098突变成任何氨基酸，例 如，seq id no:594。在一个实施方案中，突变frb包含e2032i和t2098l突变， 例如，seq id no:595。在一个实施方案中，突变frb包含e2032l和t2098l 突变，例如，seq id no:596。
[0648]
表14.具有增加的二聚化分子亲和力的示例性突变frb。
[0649][0650][0651]
其他合适的二聚化开关包括基于gyrb-gyrb的二聚化开关、基于赤霉素的 二聚化开关、标签/结合物二聚化开关和halo-标签/snap-标签二聚化开关。按照 本文提供的指南，这类开关和有关的二聚化分子将是普通技术人员显而易见的。
[0652]
二聚化分子
[0653]
开关结构域之间的缔合由二聚化分子引发。在二聚化分子存在下，开关结 构域之间的相互作用或缔合允许与第一开关结构域缔合(例如，融合)的多肽和与 第二开关结构域缔合(例如，融合)的多肽之间的信号转导。在非限制水平的二聚 化分子存在下，信号转导增加了1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、 5、10、50、100倍，例如，如本文所述的系统中测量。
[0654]
雷帕霉素和雷帕霉素类似物(有时称作雷帕类似物)，例如rad001，可以用 作本文所述的基于fkbp/frb的二聚化开关中的二聚化分子。在一个实施方案 中二聚化分子可以选自雷帕霉素(西罗莫司(sirolimus))、rad001(依维莫司)、佐 他莫司(zotarolimus)、坦
罗莫司、ap-23573(地磷莫司)、百奥莫司(biolimus)和 ap21967。适合随基于fkbp/frb的二聚化开关使用的额外雷帕霉素类似物进一 步在名为“联合疗法”的部分中或在名为“与低剂量的mtor抑制剂联用”的子部 分中描述。
[0655]
car与趋化因子受体的共表达
[0656]
在实施方案中，本文所述的表达car的细胞进一步包含趋化因子受体分子。 趋化因子受体ccr2b或cxcr2在t细胞中的转基因表达增强向ccl2-或 cxcl1分泌性实体瘤(包括黑素瘤和成神经细胞瘤)的运输(craddock等人, j immunother.2010 oct；33(8):780-8and kershaw等人,hum gene ther.2002nov 1；13(16):1971-80)。因此，不希望受理论束缚，据信在表达car的细胞中 表达的识别由肿瘤(例如实体瘤)分泌的趋化因子的趋化因子受体，可以改善 表达car的细胞归巢到肿瘤，促进表达car的细胞对肿瘤的浸润，并增强表达 car的细胞的抗肿瘤功效。趋化因子受体分子可以包含天然存在的或重组的趋 化因子受体或其趋化因子结合片段。适于在本文所述的表达car的细胞中表达 的趋化因子受体分子包括cxc趋化因子受体(例如cxcr1、cxcr2、cxcr3、 cxcr4、cxcr5、cxcr6或cxcr7)、cc趋化因子受体(例如ccr1、ccr2、 ccr3、ccr4、ccr5、ccr6、ccr7、ccr8、ccr9、ccr10或ccr11)、 cx3c趋化因子受体(例如cx3cr1)、xc趋化因子受体(例如xcr1)或其趋 化因子结合片段。在一个实施方案中，用本文所述的car待表达的趋化因子受 体分子基于肿瘤分泌的趋化因子来选择。在一个实施方案中，本文所述的表达 car的细胞进一步包含，例如，表达ccr2b受体或cxcr2受体。在一个实施方 案中，本文所述的car和趋化因子受体分子在相同的载体上或在两种不同的载 体上。在本文所述的car和趋化因子受体分子在相同载体上的实施方案中， car和趋化因子受体分子各自在两种不同启动子的控制下或在相同启动子的控 制下。
[0657]
rna转染
[0658]
本文公开了用于产生体外转录的rna car的方法。本发明还包括可以直接 转染至细胞中的编码car的rna构建体。一种产生用于转染的mrna的方法可 以涉及用专门设计的引物体外转录(ivt)模板，随后添加聚腺苷酸，以产生含有 3’和5’非翻译序列(“utr”)、5’帽和/或内部核糖体进入位点(ires)、待表达核酸 和聚腺苷酸化尾的构建体，长度一般为50-2000个碱基(seq id no:35)。如此产 生的rna可以高效地转染不同种类的细胞。在一个方面，模板包括用于car的 序列。
[0659]
在一个方面，cd123 car由信使rna(mrna)编码。在一个方面，将编码 cd123 car的mrna引入t细胞，以产生car t细胞。
[0660]
在一个实施方案中，可以将体外转录的rna car作为瞬时转染的形式引入 细胞。使用聚合酶链反应(pcr)生成的模板，通过体外转录产生rna。来自任 何来源的目的dna可以直接通过pcr转化成模板，以使用适宜引物和rna聚合 酶，体外合成mrna。dna的来源可以例如是基因组dna、质粒dna、噬菌体 dna、cdna、合成的dna序列或任何其他适宜的dna来源。用于体外转录的 目的模板是本发明的car。例如，用于rna car的模板包含胞外区，所述胞外 区包含抗肿瘤抗体的单链可变结构域；铰链区、跨膜结构域(例如，cd8a的跨膜 结构域)；和包含胞内信号结构域(例如，包含cd3-ζ的信号结构域和4-1bb的信 号结构域)的胞质区。
[0661]
在一个实施方案中，待用于pcr的dna含有可读框。dna可以来自源于生 物基因组的天然存在的dna序列。在一个实施方案中，核酸可以包括5'非翻译 区和/或3'非翻译区
(utr)的一些或全部。核酸可以包括外显子和内含子。在一 个实施方案中，待用于pcr的dna是人类核酸序列。在另一个实施方案中，待 用于pcr的dna是人类核酸序列，包括5'utr和3'utr。dna可以备选地是正 常情况下在天然存在的生物中不表达的人工dna序列。示例性人工dna序列是 含有各基因部分的人工dna序列，其中所述的各基因部分连接在一起以形成编 码融合蛋白的可读框。连接在一起的各dna部分可以来自单种生物或来自多于 一种生物。
[0662]
pcr用来产生模板以便体外转录用于转染的mrna。用于开展pcr的方法 是本领域熟知的。用于pcr中的引物设计成具有与待用作pcr模板的dna的区 域基本上互补的区域。如本文所用，“基本上互补”，指其中引物序列中的大部 分或全部碱基互补或一个或多个碱基是非互补或错配的核苷酸序列。基本上互 补的序列能够在用于pcr的复性条件下与预期的dna靶复性或杂交。引物可以 设计成与dna模板的任何部分基本上互补。例如，引物可以设计成扩增正常情 况下在细胞中转录的核酸部分(可读框)，包括5'和3'utr。引物也可以设计成扩 增编码特定目的结构域的核酸部分。在一个实施方案中，引物是设计成扩增人 cdna的编码区，包括全部或部分的5'和3'utr。用于pcr的引物可以通过本领 域熟知的合成方法产生。“正向引物”是这样的引物，其含有与dna模板上待扩 增的dna序列上游的核苷酸基本上互补的核苷酸区域。“上游”在本文中用来指 相对于编码链的对待扩增的dna序列而言5'的位置。“反向引物”是这样的引物， 其含有与dna模板上待扩增的dna序列下游的双链dna模板基本上互补的核 苷酸区域。“下游”在本文中用来指相对于编码链的对待扩增的dna序列而言3' 的位置。
[0663]
用于pcr的任何dna聚合酶可以用在本文中公开的方法中。从众多来源可 商业获得试剂和聚合酶。
[0664]
也可以使用具有促进稳定性和/或翻译效率的能力的化学结构物。rna优选 地具有5'utr和3'utr。在一个实施方案中，5'utr长度在1个和3000个核苷 酸之间。待添加至编码区的5'utr和3'utr序列的长度可以通过不同方法改变， 所述方法包括但不限于设计与utr的不同区域复性的pcr用引物。使用这种方 法，本领域普通技术人员可以调节为转染转录的rna后实现最佳翻译效率所需 要的5'utr和3'utr长度。
[0665]
5'utr和3'utr可以是目的核酸的天然存在的、内源5'utr和3'utr。备 选地，相对于目的核酸并非内源的utr序列可以通过将该utr序列并入正向引 物和反向引物中或通过对模板的任何其他修饰进行添加。使用相对于目的核酸 并非内源的utr序列可以用于调节rna的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3' utr序列中的au丰富元件可以降低mrna的稳定性。因此，基于本领域熟知的 utr特性，可以选择或设计3'utr以增加转录的rna的稳定性。
[0666]
在一个实施方案中，5'utr可以含有内源核酸的kozak序列。备选地，当 通过如上文所述的pcr添加相对于目的核酸并非内源的5'utr时，可以通过添 加5'utr序列再设计共有kozak序列。kozak序列可以增加某些rna转录物的 翻译效率、但似乎不是令全部rna有效翻译需要的。本领域已知许多mrna需 要kozak序列。在其他实施方案中，5'utr可以是其rna基因组在细胞中稳定 的rna病毒的5’utr。在其他实施方案中，多种核苷酸类似物可以用于3'或 5'utr中，以阻碍核酸外切酶降解mrna。
[0667]
为了能够在不需要基因克隆的情况下从dna模板合成rna，转录启动子应 当在待转录序列上游与dna模板连接。当作为rna聚合酶启动子发挥作用的序 列添加至正向引物
的5'末端时，rna聚合酶启动子并入待转录的可读框上游的 pcr产物中。在一个优选的实施方案中，启动子是t7聚合酶启动子，如本文他 处描述。其他有用的启动子包括但不限于t3 rna聚合酶启动子和sp6 rna聚合 酶启动子。t7、t3和sp6启动子的共有核苷酸序列是本领域已知的。
[0668]
在一个优选实施方案中，mrna在5'末端和3'聚腺苷酸尾均具有决定在细胞 中核糖体结合、翻译起始和mrna稳定性的帽。在环状dna模板，例如，质粒 dna上，rna聚合酶产生不适于真核细胞中表达的长连环体产物。在3'utr末 端线性化的质粒dna的转录产生在真核转染中并非有效的大小正常的mrna， 即便转录后它发生聚腺苷酸化。
[0669]
在线性dna模板上，噬菌体t7rna聚合酶可以越过模板的最后碱基延伸转 录物的3’末端(schenborn和mierendorf,nuc acids res.,13:6223-36(1985)； nacheva和berzal-herranz,eur.j.biochem.,270:1485-65(2003)。
[0670]
整合polya/t片段至dna模板中的常规方法是分子克隆。但是，整合入质粒 dna的polya/t序列可能造成质粒不稳定性，这是为何从细菌细胞获得的质粒 dna模板经常遭受缺失和其他畸变的高度污染的原因。这使得克隆方法不仅繁 琐和费时，而且经常不可靠。这是为何迫切需要以下方法的原因：允许在不进 行高度希望的克隆情况下构建带polya/t 3'片段的dna模板。
[0671]
通过使用含有聚胸苷酸尾(如100t尾(seq id no:31)(大小可以是50-5000 t(seq id no:32))的反向引物或在pcr后通过任何其他方法(包括但不限于 dna连接或体外重组)，可以在pcr期间产生转录用dna模板的polya/t区段。 聚腺苷酸尾还向rna提供稳定性并减少它们的降解。通常，聚腺苷酸尾的长度 与转录的rna的稳定性正相关。在一个实施方案中，聚腺苷酸尾在100个和5000 个腺苷之间(seq id no:33)。
[0672]
rna的聚腺苷酸尾可以在体外转录后利用聚腺苷酸聚合酶(如大肠杆菌聚 腺苷酸聚合酶(e-pap))进一步延长。在一个实施方案中，聚腺苷酸尾的长度从 100个核苷酸增加至300个和400个核苷酸之间(seq id no:34)导致rna的翻译 效率增加约两倍。另外，接合不同化学基团至3’末端可以增加mrna稳定性。 这种接合可以含有修饰/人工的核苷酸、适配体和其他化合物。例如，atp类似 物可以使用聚腺苷酸聚合酶并入聚腺苷酸尾中。atp类似物还可以增加rna的 稳定性。
[0673]
5'帽也向rna分子提供稳定性。在一个优选实施方案中，通过本文所公开 的方法产生的rna包含5'帽。使用本领域已知和本文所述的技术提供5'帽(cougot等人,trends in biochem.sci.,29:436-444(2001)；stepinski等人,rna, 7:1468-95(2001)；elango等人,biochim.biophys.res.commun.,330:958-966 (2005))。
[0674]
通过本文所公开的方法产生的rna还可以含有内部核糖体进入位点(ires) 序列。ires序列可以是任何病毒序列、染色体序列或人工设计的序列，所述序 列启动帽非依赖性核糖体结合至mrna并促进翻译的起始。可以包含适于细胞 电穿孔的任何溶质，所述溶质可以含有促进细胞通透性和生存力的因子，如糖、 肽、脂质、蛋白质、抗氧化剂和表面活性剂。
[0675]
可以使用众多不同方法的任一方法，将rna引入靶细胞中，例如包括但不 限于以下的市售方法：电穿孔法(amaxa nucleofector-ii(amaxa biosystems, cologne,德国))、(ecm 830(btx)(harvard instruments,boston,mass.)或genepulser ii(biorad,denver,colo.)、multiporator(eppendort,hamburg德国)、 使用脂转染的阳离子脂质体介
导转染法、聚合物包囊化法、肽介导的转染法或 生物射弹粒子递送系统如“基因枪”(参见，例如，nishikawa等人，hum genether.,12(8):861-70(2001)。
[0676]
非病毒递送方法
[0677]
在一些方面，可以用非病毒方法来递送编码本文所述的car的核酸至细胞 或组织或受试者中。
[0678]
在一些实施方案中，非病毒方法包括利用转座子(也称作转座元件)。在一些 实施方案中，转座子是可以将本身插入基因组中的某位置处的一段dna，例如， 能够自我复制并将其拷贝插入基因组中的一段dna或可以是从较长核酸剪切出 来并插入基因组中的另一个位置的一段dna。例如，转座子包含由反向重复序 列组成的dna序列，所述反向重复序列在用于换位的基因旁侧分布。
[0679]
使用转座子递送核酸的示例性方法包括睡美人转座子系统(sbts)和 piggybac(pb)转座子系统。参见，例如，aronovich等人,hum.mol.genet. 20.r1(2011):r14-20；singh等人,cancer res.15(2008):2961
–
2971；huang等人, mol.ther.16(2008):580
–
589；grabundzija等人,mol.ther. 18(2010):1200
–
1209；kebriaei等人,blood.122.21(2013):166；williams. molecular therapy 16.9(2008):1515
–
16；bell等人,nat.protoc. 2.12(2007):3153-65；和ding等人,cell.122.3(2005):473-83，所述文献均通过引 用的方式并入本文。
[0680]
sbts包括两个组分：1)含有转基因的转座子和2)转座酶来源。转座酶可以 令转座子从载体质粒(或其他供体dna)转置到靶dna，如宿主细胞染色体/基因 组。例如，转座酶与载体质粒/供体dna结合，从质粒切下转座子(包含转基因)) 并将它插入宿主细胞的基因组中。参见，例如，aronovich等人,上文。
[0681]
示例性转座子包括基于pt2的转座子。参见，例如，grabundzija等人, nucleic acids res.41.3(2013):1829-47；和singh等人,cancer res.68.8(2008): 2961
–
2971，所述文献均通过引用的方式并入本文。示例性转座酶包括tc1/水手 型转座酶，例如，sb10转座酶或sb11转座酶(可以例如从巨细胞病毒启动子表达 的过度活跃性转座酶)。参见，例如，aronovich等人；kebriaei等人；和 grabundzija等人,所述文献均通过引用的方式并入本文。
[0682]
sbts的使用允许高效整合和表达转基因，例如，编码本文所述car的核 酸。本文中提供例如使用转座子系统如sbts，产生稳定表达本文所述car的 细胞(例如，t细胞或nk细胞)的方法。
[0683]
根据本文所述的方法，在一些实施方案中，将一种或多种含有sbts组分 的核酸(例如，质粒)递送至细胞(例如，t细胞或nk细胞)。例如，通过标准核 酸(例如，质粒dna)递送方法(例如，本文所述的方法，例如，电穿孔法、转染 法或脂转染法)递送核酸。在一些实施方案中，核酸含有包含转基因(例如，编码 本文所述car的核酸)的转座子。在一些实施方案中，核酸含有包含转基因(例 如，编码本文所述car的核酸)的转座子以及编码转座酶的核酸序列。在其他 实施方案中，向系统(例如，双质粒系统)提供两种核酸，例如，其中第一质粒含 有包含转基因的转座子和第二质粒含有编码转座酶的核酸序列。例如，将第一 核酸和第二核酸共递送入宿主细胞中。
[0684]
在一些实施方案中，通过使用采取sbts的基因插入法和采取核酸酶(例如， 锌指
核酸酶(zfn)、转录激活物样效应核酸酶(talen)、crispr/cas系统或工 程化大范围核酸酶(meganucleases)再工程化的归巢核酸内切酶)的遗传编辑法的 组合，生成表达本文所述car的细胞(例如，t细胞或nk细胞)。
[0685]
在一些实施方案中，非病毒递送方法的使用允许再编程细胞(例如，t细胞 或nk细胞)和直接输注细胞至受试者中。非病毒载体的优点包括但不限于便利 和成本相对低地产生满足患者群体、储存期间稳定性和缺少免疫原性所要求的 足够量。
[0686]
编码car的核酸构建体
[0687]
本发明还提供编码一种或多种本文所述的car构建体的核酸分子。在一个 方面，核酸分子作为信使rna转录物提供。在一个方面，核酸分子作为dna 构建体提供。
[0688]
因此，在一个方面，本发明涉及编码嵌合抗原受体(car)的分离的核酸分 子，其中car包含cd123结合结构域(例如，人源化或人cd123结合结构域)、 跨膜结构域和胞内信号结构域，所述胞内信号结构域包含刺激结构域(例如，共 刺激信号结构域)和/或初级信号结构域(例如，ζ链)。在一个实施方案中，cd123 结合结构域是本文所述的cd123结合结构域，例如，包含选自seq id no: 157-160、184-215、478、480、483、485和556-587的序列或与其具有95-99％ 同一性的序列的cd123结合结构域。在一个实施方案中，cd123结合结构域包 含人cd123结合结构域，所述人cd123结合结构域包含选自seq id no： 157-160、478、480、483和485的序列。在一个实施方案中，cd123结合结构 域包含人源化cd123结合结构域，所述人源化cd123结合结构域包含选自seqid no：184-215和556-587的序列。在一个实施方案中，跨膜结构域是蛋白质 的跨膜结构域，所述蛋白质例如在本文描述，例如，选自t细胞受体的α、β 或ζ链、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、 cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137和cd154。在一个实施方案中， 跨膜结构域包含seq id no:6的序列或与其具有95-99％同一性的序列。在一 个实施方案中，cd123结合结构域通过铰链区(例如，本文所述的铰链区)与跨 膜结构域连接。在一个实施方案中，铰链区包含seq id no:2或seq id no: 3或seq id no:4或seq id no:5或与其具有95-99％同一性的序列。在一个 实施方案中，分离的核酸分子还包含编码共刺激结构域的序列。在一个实施方 案中，共刺激结构域是蛋白质的功能性信号结构域，所述蛋白质例如在本文描 述，例如，选自：mhc i类分子、tnf受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞 因子受体、整联蛋白、淋巴细胞活化信号分子(slam蛋白)、活化nk细胞受 体、btla、toll配体受体、ox40、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、 cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、4-1bb(cd137)、b7-h3、cds、icam-1、 icos(cd278)、gitr、baffr、light、hvem(lightr)、kirds2、 slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd19、cd4、cd8α、 cd8β、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、 itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11a、 lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、 lfa-1、itgb7、nkg2d、nkg2c、tnfr2、trance/rankl、dnam1 (cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、 ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6 (ntb-a、ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、 selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、cd19a和与 cd83特异性结合的配体。
[0689]
在一个实施方案中，共刺激结构域包含seq id no:7的序列或与其具有 95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，胞内信号结构域包含4-1bb的功能 性信号结构域和cd3
ζ的功能性信号结构域。在一个实施方案中，胞内信号结构 域包含seq id no:7或seq id no:8的序列或与其具有95-99％同一性的序列 和seq id no:9或seq id no:10的序列或与其具有95-99％同一性的序列，其 中包含胞内信号结构域的序列在相同读框中并作为单条多肽链表达。
[0690]
在另一个方面，本发明涉及编码car构建体的分离的核酸分子，所述car 构建体包含seq id no:1的前导序列、具有选自seq id no:157-160、184-215、 478、480、483、485和556-587的序列(或与其具有95-99％同一性的序列)的scfv 结构域、具有seq id no:2或seq id no:3或seq id no:4或seq id no:5 的序列(或与其具有95-99％同一性的序列)的铰链区、具有seq id no:6的序列 (或与其具有95-99％同一性的序列)的跨膜结构域、具有seq id no:7的序列的4-1bb共刺激结构域或具有seq id no:8的序列(或与其具有95-99％同一性的 序列)的cd27共刺激结构域或具有seq id no:43的序列(或与其具有95-99％同 一性的序列)的cd28共刺激结构域或具有seq id no:45的序列(或与其具有 95-99％同一性的序列)的icos共刺激结构域，和具有seq id no:9或seq idno:10的序列(或与其具有95-99％同一性的序列)的cd3ζ刺激结构域。
[0691]
在另一个方面，本发明涉及由该核酸分子编码的分离的多肽分子。在一个 实施方案中，分离的多肽分子包含选自seq id no:98-101和125-156的序列或 与其具有95-99％同一性的序列。
[0692]
在另一个方面，本发明涉及编码嵌合抗原受体(car)分子的核酸分子，所 述嵌合抗原受体分子包含cd123结合结构域、跨膜结构域和包含刺激结构域的 胞内信号结构域，并且其中所述cd123结合结构域包含选自seq id no: 157-160、184-215、478、480、483、485和556-587的序列或与其具有95-99％同 一性的序列。在一个实施方案中，cd123结合结构域包含人cd123结合结构域， 所述人cd123结合结构域包含选自seq id no：157-160、478、480、483和485 的序列或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，cd123结合结构 域包含人源化cd123结合结构域，所述人源化cd123结合结构域包含选自seqid no：184-215和556-587的序列或与其具有95-99％同一性的序列。
[0693]
在一个实施方案中，编码的car分子还包含编码共刺激结构域的序列。在 一个实施方案中，共刺激结构域是蛋白质的功能性信号结构域，所述蛋白质选 自：mhc i类分子、tnf受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整 联蛋白、淋巴细胞活化信号分子(slam蛋白)、活化nk细胞受体、btla、toll 配体受体、ox40、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cds、icam-1、 lfa-1(cd11a/cd18)、4-1bb(cd137)、b7-h3、cds、icam-1、icos(cd278)、 gitr、baffr、light、hvem(lightr)、kirds2、slamf7、nkp80 (klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il2rβ、 il2rγ、il7rα、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、 vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11a、lfa-1、 itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、nkg2d、nkg2c、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、 slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9 (cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、 ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg (cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、cd19a和与cd83特异 性结合的配体。在一个实施方案中，共刺激结构域包含seq id no:7的序列。
[0694]
在一个实施方案中，跨膜结构域是蛋白质的跨膜结构域、所述蛋白质选自t 细胞
受体的α、β或ζ链、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、 cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、mhci类分子、tnf受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号 传导淋巴细胞活化分子(slam蛋白)、活化nk细胞受体、btla、toll配体 受体、ox40、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cds、icam-1、 lfa-1(cd11a/cd18)、4-1bb(cd137)、b7-h3、cds、icam-1、icos(cd278)、 gitr、baffr、light、hvem(lightr)、kirds2、slamf7、nkp80 (klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il2rβ、 il2rγ、il7rα、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、 vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11a、lfa-1、 itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、 itgb7、nkg2d、nkg2c、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、 slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9 (cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、 ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg (cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、cd19a、和特异性结合 cd83的配体。
[0695]
在一个实施方案中，跨膜结构域包含seq id no:6的序列。在一个实施方 案中，胞内信号结构域包含4-1bb的功能性信号结构域和ζ的功能性信号结构域。 在一个实施方案中，胞内信号结构域包含seq id no:7的序列和seq id no:9 的序列，其中包含胞内信号结构域的序列在相同读框中并作为单条多肽链表达。 在一个实施方案中，cd123结合结构域通过铰链区与跨膜结构域连接。在一个 实施方案中，铰链区包含seq id no:2。在一个实施方案中，铰链区包含seq idno:3或seq id no:4或seq id no:5。
[0696]
在另一个方面，本发明涉及编码的car分子，所述car分子包含seq idno:1的前导序列、具有选自seq id no:157-160、184-215、478、480、483、 485、556-587的序列或与其具有95-99％同一性的序列的scfv结构域、seq id no: 2或seq id no:3或seq id no:4或seq id no:5的铰链区、具有seq id no: 6的序列的跨膜结构域、具有seq id no:7的序列的4-1bb共刺激结构域或具有 seq id no:8的序列的cd27共刺激结构域、或具有seq id no:43的序列的 cd28共刺激结构域、或具有seq id no:45的序列的icos共刺激结构域，和具 有seq id no:9或seq id no:10的序列的cd3ζ刺激结构域。在一个实施方案 中，编码的car分子包含选自seq id no:98-101和125-156的序列或与其具有 95-99％同一性的序列。
[0697]
可以使用本领域已知的重组方法获得编码所需分子的核酸序列，如，例如 通过从表达该基因的细胞筛选文库、通过从已知包括该基因的载体衍生该基因、 或通过使用标准技术从含有该基因的细胞和组织直接分离。备选地，可以合成 地产生目的基因，而非克隆地产生。
[0698]
本发明还提供插入了本发明dna的载体。衍生自逆转录病毒(如慢病毒)的 载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期、稳定整合 和其在子代细胞中增殖。慢病毒载体具有胜过衍生自癌-逆转录病毒(如鼠白血病 病毒)的载体的附加优点，因为它们可以转导非增殖性细胞，如肝细胞。它们还 具有附加的低免疫原性优点。逆转录病毒载体也可以例如是γ逆转录病毒载体。 γ逆转录病毒载体可以例如包含启动子、包装信号(ψ)、引物结合位点(pbs)、一 个或多个(例如，两个)长末端重复序列(ltr)和目的转基因，例如，编码car的 基因。γ逆转录病毒载体可以缺少病毒结构性基因如gag、pol和env。示例性γ逆 转录病毒载体包括鼠白血病病毒(mlv)、脾病灶形成病毒(sffv)和骨髓增生性 肉瘤病毒(mpsv)和从它们衍生的载体。其他γ逆转录病毒载体例如在tobias maetzig等
人,“gammaretroviral vectors:biology,technology andapplication”viruses.2011 jun；3(6):677
–
713中描述。
[0699]
在另一个实施方案中，包含编码本发明所需的car的核酸的载体是腺病毒 载体(a5/35)。在另一个实施方案中，可以使用转座子如睡美人、crisper、cas9 和锌指核酸酶完成编码car的核酸的表达。参见下文june等人,2009naturereviews immunology 9.10:704-716，所述文献通过引用的方式并入本文。
[0700]
简言之，一般通过将编码car多肽或其部分的核酸有效连接至启动子并将 构建体并入表达载体中，实现编码car的天然或合成的核酸的表达。载体可以 适合在真核生物中复制和整合。常见的克隆载体含有用于调节所需核酸序列的 表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。
[0701]
使用标准基因递送方案，本发明的表达构建体也可以用于核酸免疫和基因 治疗。用于基因递送的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利号5,399,346、 5,580,859、5,589,466，所述文献通过引用的方式完整并入本文。在另一个实施 方案中，本发明提供基因治疗载体。
[0702]
可以将核酸克隆入众多类型的载体中。例如，可以将核酸克隆入包括但不 限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒的载体中。特别有兴趣的 载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
[0703]
另外，可以将表达载体以病毒载体的形式向细胞提供。病毒载体技术是本 领域熟知的并且例如在sambrook等人,2012,molecular cloning:alaboratory manual,第1-4卷,cold spring harbor press,ny)中及在其 他病毒学和分子生物学手册中描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病 毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少 一种生物中有功能的复制起点、启动子序列、便利的限制性核酸内切酶位点和 一种或多种选择标记(例如，wo 01/96584；wo 01/29058；和美国专利号 6,326,193)。
[0704]
已经开发了众多基于病毒的系统用于转移基因至哺乳动物细胞中。例如， 逆转录病毒提供了用于基因递送系统的便利平台。可以使用本领域已知的技术， 将选择的基因插入载体并且包装在逆转录病毒粒子中。随后可以分离重组病毒 并将其在体内或离体递送至受试者的细胞。众多逆转录病毒系统是本领域已知 的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。众多腺病毒载体是本领域已知的。 在一个实施方案中，使用慢病毒载体。
[0705]
额外的启动子元件(例如，增强子)调节转录起始的频率。一般地，这些位于 起始位点上游30-110bp的区域内，不过已经显示众多启动子也在起始位点下游 含有功能性元件。启动子元件之间的间距往往灵活，从而当各元件反转或相对 于彼此移动时，启动子功能保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降前， 启动子元件之间的间距可以增加至相隔50bp。取决于启动子，各个元件似乎 可以协同或独立地发挥作用以激活转录。
[0706]
能够在哺乳动物t细胞中表达car转基因的启动子的例子是ef1a启动子。 天然ef1a启动子驱动延伸因子-1复合体的α亚基表达，所述α亚基负责酶促递送 氨酰基trna至核糖体。已经在哺乳动物表达质粒中广泛使用了ef1a启动子并且 已经显示有效驱动从克隆至慢病毒载体中的转基因表达car。参见，例如， milone等人,mol.ther.17(8):1453
–
1464(2009)。在一个方面，ef1a启动子包含 作为seq id no:11提供的序列。
[0707]
启动子的另一个例子是立即早期巨细胞病毒(cmv)启动子序列。这个启动 子序列是能够驱动与之有效连接的任何多核苷酸序列高水平表达的组成型强启 动子序列。但是，也可以使用其他组成型启动子序列，所述其他组成型启动子 序列包括但不限于猴病毒40(sv40)早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒(mmtv)、人 类免疫缺陷病毒(hiv)长末端重复序列(ltr)启动子、momulv启动子、鸟类白 血病病毒启动子、埃巴病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子以及人基因 启动子，如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1α启动子、 血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。另外，本发明不应当限于使用组成型启动 子。还构思了诱导型启动子作为本发明的部分。诱导型启动子的使用提供了一 种分子开关，所述分子开关能够在需要这类表达时启动与之有效连接的多核苷 酸序列表达或在不需要这类表达时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限 于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
[0708]
启动子的另一个例子是磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子。在实施方案中，可 能需要截短的pgk启动子(例如，与野生型pgk启动子序列相比时具有一个或多 个，例如1、2、5、10、100、200、300或400个核苷酸缺失的pgk启动子)。下 文提供了示例性pgk启动子的核苷酸序列。
[0709]
wt pgk启动子
[0710]
acccctctctccagccactaagccagttgctccctcggctgacggctgcacgcgaggcctccgaacgtcttacgcct tgtggcgcgcccgtccttgtcccgggtgtgatggcggggtgtggggcggagggcgtggcggggaagggccggcgacg agagccgcgcgggacgactcgtcggcgataaccggtgtcgggtagcgccagccgcgcgacggtaacgagggaccgcg acaggcagacgctcccatgatcactctgcacgccgaaggcaaatagtgcaggccgtgcggcgcttggcgttccttgg aagggctgaatccccgcctcgtccttcgcagcggccccccgggtgttcccatcgccgcttctaggcccactgcgacg cttgcctgcacttcttacacgctctgggtcccagccgcggcgacgcaaagggccttggtgcgggtctcgtcggcgca gggacgcgtttgggtcccgacggaaccttttccgcgttggggttggggcaccataagct
[0711]
(seq id no:597)
[0712]
示例性截短的pgk启动子:
[0713]
pgk100:
[0714]
acccctctctccagccactaagccagttgctccctcggctgacggctgcacgcgaggcctccgaacgtcttacgcct tgtggcgcgcccgtccttgtcccgggtgtgatggcggggtg
[0715]
(seq id no:598)
[0716]
pgk200:
[0717]
acccctctctccagccactaagccagttgctccctcggctgacggctgcacgcgaggcctccgaacgtcttacgcct tgtggcgcgcccgtccttgtcccgggtgtgatggcggggtgtggggcggagggcgtggcggggaagggccggcgacg agagccgcgcgggacgactcgtcggcgataaccggtgtcgggtagcgccagccgcgcgacggtaacg
[0718]
(seq id no:599)
[0719]
pgk300:
[0720]
acccctctctccagccactaagccagttgctccctcggctgacggctgcacgcgaggcctccgaacgtcttacgcct tgtggcgcgcccgtccttgtcccgggtgtgatggcggggtgtggggcggagggcgtggcggggaag
ggccggcgacg agagccgcgcgggacgactcgtcggcgataaccggtgtcgggtagcgccagccgcgcgacggtaacgagggaccgcg acaggcagacgctcccatgatcactctgcacgccgaaggcaaatagtgcaggccgtgcggcgcttggcgttccttgg aagggctgaatccccg
[0721]
(seq id no:600)
[0722]
pgk400:
[0723]
acccctctctccagccactaagccagttgctccctcggctgacggctgcacgcgaggcctccgaacgtcttacgcct tgtggcgcgcccgtccttgtcccgggtgtgatggcggggtgtggggcggagggcgtggcggggaagggccggcgacg agagccgcgcgggacgactcgtcggcgataaccggtgtcgggtagcgccagccgcgcgacggtaacgagggaccgcg acaggcagacgctcccatgatcactctgcacgccgaaggcaaatagtgcaggccgtgcggcgcttggcgttccttgg aagggctgaatccccgcctcgtccttcgcagcggccccccgggtgttcccatcgccgcttctaggcccactgcgacg cttgcctgcacttcttacacgctctgggtcccagccg
[0724]
(seq id no:601)
[0725]
载体还可以例如包括促进分泌的信号序列、多聚腺苷化信号和转录终止子 (例如，来自牛生长激素(bgh)基因)、允许附加体型复制和在原核生物中复制的 元件(例如sv40复制起点和cole1或本领域已知的其他元件)和/或允许选择的元 件(例如，氨苄青霉素耐药基因和/或zeocin标记)。
[0726]
为了评估car多肽或其部分的表达，待引入细胞中的表达载体还可以含有 选择标记基因或报道基因或这两者以促进从寻求用病毒载体转染或感染的细胞 群体鉴定和选择出现表达的细胞。在其他方面，选择标记可以在一种独立的dna 片段上携带并且在共转染法中使用。选择标记和报道基因可以旁侧分布有能够 在宿主细胞中实现表达的适宜调节序列。有用的选择标记例如包括抗生素耐药 性基因，如neo等。
[0727]
报道基因用于鉴定潜在转染的细胞及评价调节序列的功能。通常，报道基 因是这样的基因，所述基因不存在于接受生物或组织中或不由接受生物或组织 表达并且编码其表达由某种轻易可检测特性(例如，酶活性)展示的多肽。在dna 已经引入接受细胞之后的合适时间测定报道基因的表达。合适的报道基因可以 包括编码萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基转移酶、分泌型碱性磷酸酶 的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，ui-tei等人,2000 febs letters 479:79-82)。 合适的表达系统是熟知的并且可以使用已知技术制备或商业地获得。通常，将 显示最高报道基因表达水平的具有最少5'侧翼区的构建体鉴定为启动子。这类启 动子区可以与报道基因连接并用来评价多种物质调节启动子驱动型转录的能 力。
[0728]
在一个实施方案中，载体还可以包含编码第二car的核酸。在一个实施方 案中，第二car包含针对急性髓性白血病细胞上表达的靶(例如，cd33、cd34、 cll-1、flt3或叶酸受体β)的抗原结合结构域。在一个实施方案中，载体包含 编码第一car的核酸序列，所述第一car靶向第一抗原并且包含了具有共刺激 信号结构域但没有初级信号结构域的胞内信号结构域，和编码第二car的核酸 序列，所述第二car靶向第二个不同的抗原并且包含了具有初级信号结构域但 没有共刺激信号结构域的胞内信号结构域。在一个实施方案中，载体包含编码 第一cd123 car的核酸，所述第一cd123 car包含cd123结合结构域、跨膜结 构域和共刺激结构域，和编码第二car的核酸，所述第二car靶向除cd123之 外的抗原(例如，aml细胞上表达的抗原，例如，cd33、cd34、cll-1、flt3 或叶酸受体β)并包含抗原结合结构域、跨
膜结构域和初级信号结构域。在另一 个实施方案中，载体包含编码第一cd123 car的核酸，所述第一cd123 car 包含cd123结合结构域、跨膜结构域和初级信号结构域，和编码第二car的核 酸，所述第二car靶向除cd123之外的抗原(例如，aml细胞上表达的抗原，例 如，cd33、cll-1、cd34、flt3或叶酸受体β)并包含针对该抗原的抗原结合 结构域、跨膜结构域和共刺激信号结构域。
[0729]
在一个实施方案中，载体包含编码本文所述的cd123 car的核酸和编码 抑制性car的核酸。在一个实施方案中，抑制性car包含这样的抗原结合结 构域，所述抗原结合结构域结合正常细胞上存在、但癌细胞上不存在的抗原， 例如，还表达cd123的正常细胞。在一个实施方案中，抑制性car包含抑制 性分子的抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域。例如，抑制性car的胞 内结构域可以是pd1、pd-l1、pd-l2、ctla4、tim3、ceacam(例如、 ceacam-1、ceacam-3和/或ceacam-5)、lag3、vista、btla、tigit、 lair1、cd160、2b4、cd80、cd86、b7-h3(cd276)、b7-h4(vtcn1)、hvem (tnfrsf14或cd270)、kir、a2ar、mhc i类、mhc ii类、gal9、腺苷 和tgfrβ的胞内结构域。
[0730]
在实施方案中，载体可以包含两个或更多个核酸序列，所述核酸序列编码 一种car，例如，本文所述的cd123 car，和第二car，例如，抑制性car 或与除cd123之外的抗原(例如，aml细胞上表达的抗原，例如，cll-1、cd33、 cd34、flt3或叶酸受体β)特异性结合的car。在这类实施方案中，编码car 的两个或更多个核酸序列由单一核酸分子在相同读框中编码并且作为单条多肽 链编码。在这个方面，两个或更多个car，可以例如由一个或多个肽剪切位点(例 如，自剪切位点或胞内蛋白酶的底物)分隔。肽剪切位点的例子包括以下序列， 其中gsg残基是任选的：
[0731]
t2a:(gsg)e g r g s l l t c g d v e e n p g p(seq id no:602)
[0732]
p2a:(gsg)a t n f s l l k q a g d v e e n p g p(seq id no:603)
[0733]
e2a:(gsg)q c t n y a l l k l a g d v e s n p g p(seq id no:604)
[0734]
f2a:(gsg)v k q t l n f d l l k l a g d v e s n p g p(seq id no:605)
[0735]
向细胞引入基因并表达基因的方法是本领域已知的。在表达载体的情况下， 载体可以通过本领域的任何方法轻易地引入宿主细胞(例如，哺乳动物细胞、细 菌细胞、酵母细胞或昆虫细胞)中。例如，表达载体可以通过物理手段、化学手 段或生物学手段转移至宿主细胞中。
[0736]
用于引入多核苷酸至宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀法、脂转染法、 粒子轰击法、微量注射法、电穿孔法等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细 胞的方法是本领域熟知的。参见，例如，sambrook等人,2012,molecularcloning:a laboratory manual,第1-4卷,cold spring harbor press, ny)。用于引入多核苷酸至宿主细胞中的优选方法是磷酸钙转染法。
[0737]
用于引入目的多核苷酸至宿主细胞中的生物学方法包括使用dna载体和 rna载体。病毒载体和尤其逆转录病毒载体已经变成使用最广泛的将基因插入 哺乳动物(例如，人)细胞的方法。其他病毒载体可以衍生自慢病毒、痘病毒、单 纯疱疹病毒i、腺病毒和腺相关病毒等。参见，例如，美国专利号5,350,674和 5,585,362。
[0738]
用于引入多核苷酸至宿主细胞中的化学手段包括胶态分散体系，如大分子 复合物、纳米囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合 胶束和脂质体。用作
体外和体内递送运载体的示例性胶态体系是脂质体(例如， 人工膜囊泡)。现有定向递送核酸的其他方法是可获得的，如用靶向的纳米粒子 或其他合适的亚微米尺度递送系统递送多核苷酸。
[0739]
在利用非病毒递送系统的情况下，示例性递送运载体是脂质体。构思使用 脂质制剂以引入核酸至宿主细胞中(体外，离体或体内)。在另一个方面，核酸可 以与脂质结合。与脂质结合的核酸可以包封于脂质体的水质内部、散布在脂质 体的脂质双层内部、借助与脂质体和寡核苷酸均结合的连接分子与脂质体连接、 包埋于脂质体中、与脂质体复合、分散于含有脂质的溶液中、与脂质混合、与 脂质组合、作为混悬液含于脂质中、含于胶束中或与胶束复合或与脂质结合。 与脂质、脂质/dna或脂质/表达载体结合的组合物不限于溶液中的任何特定结 构。例如，它们可以双层结构存在、作为胶束存在或以“塌陷”结构存在。它们 还可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集物。脂质是脂 肪性物质，其可以是天然存在的脂质或合成的脂质。例如，脂质包括天然出现 在细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂族烃及其衍生物如脂肪酸、醇类、胺、氨 基醇类和醛的化合物类。
[0740]
适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱 (“dmpc”)可以从sigma,st.louis,mo获得；二鲸蜡醇磷酸酯(“dcp”)可以从k &k laboratories获得(plainview、ny)；胆固醇(“choi”)可以从 calbiochem-behring获得；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“dmpg”)和其他脂质可以从 avanti polar lipids,inc.(birmingham,al.)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的 母液可以贮存在约-20℃。使用氯仿作为唯一溶剂，因为它比甲醇更易蒸发。“脂 质体”是类属术语，其涵盖通过产生封闭的脂质双层或聚集物所形成的多种单一 和多层脂质载体。脂质体可以表征为具有磷脂双层膜和内部水介质的囊泡结构。 多层脂质体具有水介质分隔的多个脂质层。当磷脂在过量水溶液中悬浮时，它 们自发形成。脂质组分在形成封闭结构前发生自我重排并在脂质双层之间夹带 水和溶解的溶质(ghosh等人,1991glycobiology 5:505-10)。但是，还涵盖在溶 液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可以采取胶束结构 或仅作为脂质分子的非均匀聚集物存在。还构思了脂质转染胺(lipofectamine)
-ꢀ
核酸复合物。
[0741]
无论该方法是否用来引入外源核酸至宿主细胞中或使细胞暴露于本发明的 抑制剂，为了证实宿主细胞中重组dna序列的存在，可以进行多种测定法。这 类测定法例如包括本领域技术人员熟知的“分子生物学测定法”，如dna印迹和 rna印迹法、rt-pcr和pcr；“生物化学”测定法，如检测特定肽的存在或不 存在，例如，通过免疫手段(elisa法和蛋白质印迹法)或通过本文所述测定法鉴 定属于本发明范围内的物质。
[0742]
本发明还提供一种载体，所述载体包含编码car的核酸分子。在一个方面， 可以将car载体直接转导入细胞，例如，免疫效应细胞，例如，t细胞或nk 细胞。在一个方面，载体是克隆载体或表达载体，例如，载体，包括但不限于 一种或多种质粒(例如，表达质粒、克隆载体、微环、微载体、双微小染色体)、 逆转录病毒构建体和慢病毒载体构建体。在一个方面，载体能够在哺乳动物免 疫效应细胞(例如哺乳动物t细胞或哺乳动物nk细胞)中表达car构建体。 在一个方面，哺乳动物t细胞是人t细胞。
[0743]
细胞来源
[0744]
在扩充和基因修饰或其他修饰之前，细胞来源(例如，免疫效应细胞，例如， t细胞或nk细胞)从受试者获得。术语“受试者”意在包括可以激发免疫应答的 活生物(例如，哺乳
动物)。受试者的例子包括人、犬、猫、小鼠、大鼠及其转基 因物种。可以从众多来源获得t细胞，包括外周血单个核细胞、骨髓、淋巴结 组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和 肿瘤。
[0745]
在本发明的某些方面，可以使用本领域可获得的任何数目的免疫效应细胞 (例如，t细胞或nk细胞)系。在本发明的某些方面，可以使用技术人员已知的 任何种类的技术(如ficoll
tm
分离法)，从采集自受试者的血液成分中获得t细胞。 在一个优选的方面，通过单采血液成分术获得来自个体循环血液的细胞。单采 产物一般含有淋巴细胞，包括t细胞、单核细胞、粒细胞、b细胞、其他有核的 白细胞、红细胞和血小板。在一个方面，可以洗涤通过单采血液成分术采集的 细胞，以除去血浆级分并且以在用于后续加工步骤的适宜缓冲液或培养基中放 置细胞。在本发明的一个方面，用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤细胞。在一个备选 方面，洗涤液缺少钙并且可以缺少镁或可以缺少许多(若非全部)二价阳离子。
[0746]
在钙不存在情况下的初始活化步骤可以导致放大的活化。如本领域普通技 术人员将轻易领会，可以通过本领域技术人员已知的方法，如根据制造商说明 通过使用半自动化“通流”离心机(例如，cobe 2991细胞处理器、baxtercytomate、或haemonetics cell saver 5)，完成洗涤步骤。在洗涤后，细胞可以 重悬于多种生物相容缓冲液中，如，例如，无ca、无mg的pbs、plasmalyte a 或含有或没有缓冲剂的其他盐水溶液。备选地，可以移除单采样品的不想要组 分并且将细胞直接重悬于培养基中。
[0747]
认识到本申请的方法可以利用包含5％或更少(例如2％)人ab血清的培养基 条件，并且利用已知的培养基条件和组合，例如，在smith等人,“ex vivoexpansion of human t cells for adoptive immunotherapy using the novel xeno-free cts immune cell serum replacement”clinical&translationalimmunology(2015)4,e31；doi:10.1038/cti.2014.31中描述的那些。
[0748]
在一个方面，通过裂解红细胞和消耗单核细胞，例如，通过经percoll
tm
梯度离心或通过逆流离心淘析，从外周血淋巴细胞分离t细胞。可以通过正向或 负向选择技术进一步分离特定的t细胞亚群，如cd3+、cd28+、cd4+、cd8+、 cd45ra+和cd45ro+t细胞。例如，在一个方面，通过与抗cd3/抗cd28(例如， 3x28)缀合的珠(如m-450 cd3/cd28 t)温育一段足够正向选择 所需t细胞的时间，分离t细胞。在一个方面，该时间段是约30分钟。在又一个 方面，该时间段范围从30分钟至36小时或更长和二者之间的全部整数值。在又 一个方面，该时间段是至少1、2、3、4、5或6小时。在又一个优选的方面，该 时间段是10至24小时。在一个方面，温育时间时段是24小时。较长的温育时间 可以用来在其中如与其他细胞类型相比存在少量t细胞的任何情况下分离t细 胞，如用于从肿瘤组织或从免疫受损个体分离肿瘤浸润型淋巴细胞(til)。另外， 使用较长的温育时间可以增加捕获cd8+t细胞的效率。因此，通过简单地缩短 或延长该时间，允许t细胞与cd3/cd28珠结合和/或通过增加或减少珠对t细胞 的比率(如本文进一步所述那样)，可以在培养伊始或在培养过程期间的其他时间 点偏好地选择t细胞亚群。额外地，通过增加或减少珠或其他表面上抗cd3和/ 或抗cd28抗体的比率，可以在培养伊始或在其他所需的时间点偏好地选择t细 胞亚群。技术人员将认识到，也可以在本发明的背景下使用多轮选择。在某些 方面，可能想要在活化和扩充过程中执行选择程序并且使用“未选择的”细胞。
ꢀ“
未选择的”细胞也可以接受进一步轮次的选择。
[0749]
可以用抗体的组合，通过负选择过程完成t细胞群体的富集，其中所述抗体 针对负向选择的细胞独有的表面标志物。一种方法是借助负向磁力免疫粘附法 或流式细胞术分选和/或选择细胞，所述负向磁力免疫粘附法或流式细胞术使用 针对负向选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物。例如，为 了通过负向选择富集cd4+细胞，单克隆抗体混合物一般包含针对cd14、cd20、 cd11b、cd16、hla-dr和cd8的抗体。在某些方面，可能想要富集或正向选 择一般表达cd4+、cd25+、cd62lhi、gitr+和foxp3+的调节性t细胞。备选 地，在某些方面，通过抗c25缀合的珠或其他相似的选择方法消耗调节性t细胞。
[0750]
本文所述的方法可以包括例如使用(例如，本文所述的)负选择技术，选择特 定免疫效应细胞(例如，t细胞)亚群，所述亚群是调节性t细胞消耗的群体、 cd25+消耗的细胞。优选地，调节性t细胞消耗的细胞群体含有少于30％、25％、 20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的cd25+细胞。
[0751]
在一个实施方案中，使用抗cd25抗体或其片段或cd25结合配体(il-2)从群 体移除调节性t细胞，例如，cd25+t细胞。在一个实施方案中，抗cd25抗体或 其片段或cd25-结合配体与基材(例如，珠)缀合、或包被在基材(例如，珠)上。 在一个实施方案中，抗cd25抗体或其片段与如本文所述的基材缀合。
[0752]
在一个实施方案中，使用来自miltenyi
tm
的cd25消耗试剂从群体移除调节 性t细胞，例如，cd25+t细胞。在一个实施方案中，细胞对cd25消耗试剂的比 率是1e7个细胞对20ul、或1e7个细胞对15ul、或1e7个细胞对10ul、或1e7个 细胞对5ul、或1e7个细胞对2.5ul、或1e7个细胞对1.25ul cd25消耗试剂。在 一个实施方案中，例如，对于消耗调节性t细胞，例如，cd25+而言，使用大于 500百万个细胞/ml。在又一个方面，使用600、700、800、或900百万个细胞/ml 的细胞浓度。
[0753]
在一个实施方案中，待消耗的免疫效应细胞群体包含约6x109个cd25+t细 胞。在其他方面，待消耗的免疫效应细胞群体包含约1x109个至1x10
10
个 cd25+t细胞和二者之间任何整数值的cd25+t细胞。在一个实施方案中，所产 生的调节性t细胞消耗群体具有2x109个调节性t细胞，例如，cd25+细胞、或 更少(例如，1x109、5x108、1x108、5x107、1x107个或更少cd25+细胞)。
[0754]
在一个实施方案中，使用具有消耗管路套件，例如，管路162-01的clinimac 系统，从群体移除调节性t细胞，例如，cd25+细胞。在一个实施方案中， clinimac系统在消耗设定(如，例如，depletion2.1)上运行。
[0755]
不希望受具体理论约束，在单采血液成分术之前或在产生表达car的细胞 产物期间降低受试者中免疫细胞的负向调节物水平(例如，减少不想要的免疫细 胞(例如，t
reg
细胞)的数目)可以降低受试者复发风险。例如，消耗t
reg
细胞的 方法是本领域已知的。减少t
reg
细胞的方法包括但不限于环磷酰胺、抗gitr抗 体(本文所述的抗gitr抗体)、cd25消耗、及其组合。
[0756]
在一些实施方案中，生产方法包括在产生表达car的细胞之前(例如，消耗) 减少t
reg
细胞的数目。例如，生产方法包括使样品(例如，单采样品)与抗gitr 抗体和/或抗cd25抗体(或其片段、或cd25-结合配体)接触，例如，以在产生表 达car的细胞(例如，t细胞、nk细胞)产物之前消耗t
reg
细胞。
[0757]
在一个实施方案中，在采集细胞以产生表达car的细胞产物之前，将受试 者用减
少t
reg
细胞的一种或多种疗法预治疗，因而相对于表达car的细胞治疗， 降低受试者复发风险。在一个实施方案中，减少t
reg
细胞的方法包括但不限于 向受试者施用以下一种或多种：环磷酰胺、抗gitr抗体、cd25消耗或其组合。 施用环磷酰胺、抗gitr抗体、cd25消耗或其组合中一者或多者可以在输注表 达car的细胞产物之前、其期间或之后进行。
[0758]
在一个实施方案中，在采集细胞以产生表达car的细胞产物之前，将受试 者用环磷酰胺预治疗，因而相对于表达car的细胞治疗，降低受试者复发风险。 在一个实施方案中，在采集细胞以产生表达car的细胞产物之前，将受试者用 抗gitr抗体预治疗，因而相对于表达car的细胞治疗，降低受试者复发风险。
[0759]
在一个实施方案中，待移除的细胞群体既不是调节性t细胞，也不是肿瘤细 胞，而是不利影响cart细胞的扩充和/或功能的细胞，例如，表达cd14、cd11b、 cd33、cd15或由潜在免疫阻抑性细胞表达的其他标记的细胞。在一个实施方 案中，构思了将这类细胞与调节性t细胞和/或肿瘤细胞同时、或在所述消耗后 或按另一个顺序移除。
[0760]
本文所述的方法可以包括多于一个选择步骤，例如，多于一个消耗步骤。 可以例如用抗体的组合，通过负选择过程完成t细胞群体的富集，其中所述抗体 针对负向选择的细胞独有的表面标志物。一种方法是借助负向磁力免疫粘附法 或流式细胞术分选和/或选择细胞，所述负向磁力免疫粘附法或流式细胞术使用 针对负向选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物。例如，为 了通过负向选择富集cd4+细胞，单克隆抗体混合物可以包含针对cd14、cd20、 cd11b、cd16、hla-dr和cd8的抗体。
[0761]
本文所述的方法还可以包括从表达肿瘤抗原(例如，不包含cd25的肿瘤抗 原，例如，cd19、cd30、cd38、cd123、cd20、cd14或cd11b)的群体移除 细胞，旨在因而提供适于表达car(例如，本文所述的car)的调节性t细胞消耗 (例如，cd25+消耗的细胞和肿瘤抗原消耗的细胞)的群体。在一个实施方案中， 将表达肿瘤抗原的细胞与调节性t细胞(例如，cd25+细胞)同时移除。例如，抗 cd25抗体或其片段和抗肿瘤抗原抗体或其片段可以连接至能用来移除细胞的 相同基材(例如，珠)，或抗cd25抗体或其片段或者抗肿瘤抗原抗体或其片段可 以连接至分立的珠，其混合物可以用来移除细胞。在其他实施方案中，移除调 节性t细胞(例如，cd25+细胞)和移除表达肿瘤抗原的细胞是依次进行的，并且 可以例如按任何顺序进行。
[0762]
还提供这些方法，所述方法包括从群体移除表达检查点抑制物(例如，本文 所述的检查点抑制物)的细胞，例如，pd1+细胞、lag3+细胞和tim3+细胞中 的一者或多者，因而提供调节性t细胞消耗(例如，cd25+消耗的细胞)和检查 点抑制物消耗的细胞(例如，pd1+、lag3+和/或tim3+消耗的细胞)的群体。 示例性检查点抑制物包括b7-h1、b7-1、cd160、p1h、2b4、pd1、tim3、 ceacam(例如,ceacam-1、ceacam-3和/或ceacam-5)、lag3、tigit、 ctla-4、btla和lair1。在一个实施方案中，将表达检查点抑制物的细胞 与调节性t细胞(例如，cd25+细胞)同时移除。例如，抗cd25抗体或其片段和 抗检查点抑制物抗体或其片段可以连接至可以用来移除细胞的相同珠，或抗 cd25抗体或其片段或者抗检查点抑制物抗体或其片段可以连接至分立的珠，其 混合物可以用来移除细胞。在其他实施方案中，移除调节性t细胞(例如，cd25+ 细胞)和移除表达检查点抑制物的细胞是依次进行的，并且可以例如按任何顺序 进行。
[0763]
在一个实施方案中，可以选择表达以下一者或多者的t细胞群体：ifn-γ、 tnfα、
il-17a、il-2、il-3、il-4、gm-csf、il-10、il-13、粒酶b和穿孔素、 或其他适宜的分子，例如，其他细胞因子。可以例如通过pct公开号wo 2013/126712中描述的方法，确定用于筛选细胞表达的方法。
[0764]
为了通过正向或负向选择分离所需的细胞群体，细胞和表面(例如粒子，如 珠)的浓度可以变动。在某些方面，可能想要明显减少其中珠和细胞混合在一起 的体积(例如，增加细胞浓度)以确保细胞和珠最大限度接触。例如，在一个方面， 使用20亿个细胞/ml的浓度。在一个方面，使用10亿个细胞/ml的浓度。在又一个 方面，使用大于1亿个细胞/ml。在又一个方面，使用1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、 4.5或5千万个细胞/ml的细胞浓度。在又一个方面，使用75、80、85、90、95或 100百万个细胞/ml细胞浓度。在其他方面，可以使用1.25亿或1.5亿个细胞/ml的 浓度。使用高浓度可以导致增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩充。另外，使 用高细胞浓度允许更高效地捕获可能微弱表达目的靶抗原的细胞(如cd28阴性 t细胞)、或来自其中存在许多肿瘤细胞的样品(例如，白血病血液、肿瘤组织等) 中的细胞。这类细胞群体可能具有治疗价值并且将希望获得。例如，使用高浓 度的细胞允许更高效地选择正常情况下具有更弱cd28表达的cd8+t细胞。
[0765]
在一个相关方面，可能想要使用较低的细胞浓度。通过大幅度稀释t细胞和 表面(例如粒子，如珠)的混合物，粒子和细胞之间的相互作用最小化。这选出表 达高量待与粒子结合的所需抗原的细胞。例如，cd4+t细胞表达较高水平的 cd28并且在稀释的浓度比cd8+t细胞更高效地被捕获。在一个方面，使用的细 胞浓度是5x10e6/ml。在其他方面，所用的浓度可以是约1x105/ml至1x106/ml 和其间的任何整数值。
[0766]
在其他方面，可以将细胞在2-10℃或在室温在摇床上按不同的速度温育长 度不同的时间。
[0767]
用于刺激的t细胞也可以在洗涤步骤后冷冻。不希望受理论约束，通过移除 细胞群体中的粒细胞和一定程度移除单核细胞，冷冻和后续解冻步骤提供更均 匀的产物。在移除血浆和血小板的洗涤步骤后，细胞可以悬浮于冷冻液中。尽 管许多冷冻液和参数是本领域已知的并且将用于这种环境下，一种方法涉及使 用含有20％dmso和8％人血清白蛋白的pbs，或含有10％葡聚糖40和5％右旋 糖、20％人血清白蛋白和7.5％dmso、或31.25％plasmalyte-a、31.25％右旋 糖5％、0.45％nacl、10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％ dmso的培养基或例如含有hespan和plasmalyte a的其他合适的无细胞培养 基，细胞随后以1
°
/分钟的速率冷冻至-80℃并且存储在液氮储罐的蒸气相中。也 可以使用其他受控冷冻方法，以及立即在-20℃或在液氮中不受控冷冻。
[0768]
在某些方面，将冻存的细胞如本文所述那样解冻和洗涤并允许在室温静置1 小时，之后使用本发明的方法激活。
[0769]
在本发明上下文中还构思了在可能需要如本文所述的已扩充细胞时之前的 某个时间段从受试者采集血液样品或单采产物。就此而论，待扩充的细胞来源 可以在需要的任何时间点采集，并且所需的细胞(如免疫效应细胞，例如，t细 胞或nk细胞)可以分离并冷冻供稍后用于将从细胞疗法(例如，t细胞疗法)获益 的任何种类的疾病或病状(如本文所述的那些)的t细胞疗法中。在一个方面，血 液样品或单采物取自总体上健康的受试者。在某些方面，血液样品或单采物取 自总体上健康的受试者，所述受试者面临形成疾病的风险、但是尚未形成疾病， 并且将目的细胞分离并冷冻供稍后使用。在某些方面，可以将免疫效
应细胞(例 如，t细胞或nk细胞)扩充、冷冻并在稍后时间使用。在某些方面，样品从诊断 如本文所述的特定疾病后不久、但在任何治疗之前的患者采集。在又一个方面， 在任何数目的相关治疗模式之前，从受试者的血液样品或单采物分离细胞，所 述的治疗模式包括但不限于药物治疗，如那他珠单抗、依法珠单抗、抗病毒药、 化疗、辐射、免疫抑制剂如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸盐和fk506、 抗体、或其他免疫消耗剂如campath、抗cd3抗体、环磷氮芥、氟达拉滨、 环孢菌素、fk506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、fr901228和照射。
[0770]
在本发明的又一个方面，在留给受试者有功能的t细胞的治疗后马上从患者 获得t细胞。在这个方面，已经观察到在某些癌症治疗、尤其用损伤免疫系统的 药物治疗后，在治疗后不久在患者正常情况下将从治疗中恢复的时间期间，获 得的t细胞的质量可能就其离体扩充能力而言最佳或改善。同样地，在使用本文 所述的方法离体操作后，这些细胞可以处于移植和体内扩充增强的优选状态。 因此，在本发明上下文中构思了，在这个恢复期期间采集血细胞，包括t细胞、 树状细胞或造血谱系的其他细胞。另外，在某些方面，动员(例如，用gm-csf 动员)和整备方案可以用来在受试者中产生这样的条件，其中有利于特定细胞类 型再增殖、再循环、再生和/或扩充，特别在治疗后的限定时间窗口期间有利。 示意性的细胞类型包括t细胞、b细胞、树状细胞和免疫系统的其他细胞。
[0771]
在一个实施方案中，表达car分子(例如，本文所述的car分子)的免疫效 应细胞从已经接受免疫增强性低剂量的mtor抑制剂的受试者获得。在一个实 施方案中，在足够时间的mtor抑制剂后或在充分给予免疫增强性低剂量的 mtor抑制剂后收获待工程化以表达car的免疫效应细胞(例如，t细胞)群体， 从而受试者中的或从受试者收获的pd1阴性免疫效应细胞(例如，t细胞)的水平 或pd1阴性免疫效应细胞(例如，t细胞)/pd1阳性免疫效应细胞(例如，t细胞) 的比率已经至少一过性增加。
[0772]
在其他实施方案中，可以通过与下述量的mtor抑制剂接触，离体处理已 经工程化或将会工程化以表达car的免疫效应细胞(例如，t细胞)群体，所述量 增加pd1阴性免疫效应细胞(例如，t细胞)数目或增加pd1阴性免疫效应细胞(例 如，t细胞)/pd1阳性免疫效应细胞(例如，t细胞)的比率。
[0773]
在一个实施方案中，t细胞群体是二酰甘油激酶(dgk)缺陷的。dgk缺陷 性细胞包括不表达dgk rna或蛋白质或具有降低或抑制的dgk活性的细胞。 可以通过遗传方法产生dgk缺陷性细胞，例如，施用减少或阻止dgk表达的 rna干扰剂(例如，sirna、shrna、mirna)。备选地，可以通过用本文所述 的dgk抑制剂处理，产生dgk缺陷性细胞。
[0774]
在一个实施方案中，t细胞群体是ikaros缺陷的。ikaro缺陷性细胞包括不 表达ikaros rna或蛋白质或具有降低或抑制的ikaro活性的细胞，可以通过遗传 方法产生ikaro缺陷性细胞，例如，施用减少或阻止ikaro表达的rna干扰剂(例 如，sirna、shrna、mirna)。备选地，可以通过用ikaros抑制剂(例如，来那 度胺)处理，产生ikaros缺陷性细胞。
[0775]
在实施方案中，t细胞群体是dgk缺陷的和ikaros缺陷的，例如，不表达 dgk和ikaros、或具有减少或抑制的dgk活性和ikaros活性。这类dgk和ikaros 缺陷性细胞可以通过本文所述的任何方法产生。
[0776]
在一个实施方案中，从受试者获得nk细胞。在另一个实施方案中，nk细 胞是nk细胞系，例如，nk-92细胞系(conkwest)。
[0777]
同种异体(allogeneic)car免疫效应细胞
[0778]
在本文所述的实施方案中，免疫效应细胞可以是同种异体免疫效应细胞， 例如，t细胞或nk细胞。例如，细胞可以是同种异体t细胞，例如，缺少功能 性t细胞受体(tcr)和/或人白细胞抗原(hla)(例如，hla i类和/或hla ii类) 表达的同种异体t细胞。
[0779]
缺少功能性tcr的t细胞可以例如经工程化，从而它在其表面上不表达任何 功能性tcr；经工程化，从而它不表达构成功能性tcr的一个或多个亚基(例如， 经工程化，从而它不表达或显示出减少表达的tcrα、tcrβ、tcrγ、tcrδ、 tcrε和/或tcrζ)；或经工程化，从而它在其表面上产生非常少的功能性tcr。 备选地，t细胞可以表达大幅度受损的tcr，例如，通过表达突变或截短形式的 一个或多个tcr亚基。术语“大幅度受损的tcr”意指这种tcr将不在宿主中激 发不良免疫反应。
[0780]
本文所述的t细胞例如可以如此工程化，从而它不在其表面上表达功能性 hla。例如，本文所述的t细胞可以如此工程化，从而hla(例如，hla i类和/ 或hla ii类)的细胞表面表达下调。在一些方面，可以通过减少或消除β-2微球 蛋白(b2m)表达实现hla的下调。
[0781]
在一些实施方案中，t细胞可以缺少功能性tcr和功能性hla，例如，hlai类和/或hla ii类。
[0782]
可以通过任何合适的手段(包括敲除或敲低tcr或hla的一个或多个亚 基)，获得缺少功能性tcr和/或hla表达的修饰的t细胞。例如，t细胞可以包 括使用sirna、shrna、成簇规律间隔的短回文重复序列(crispr)、转录激活 物样效应子核酸酶(talen)或锌指核酸内切酶(zfn)敲低的tcr和/或hla。
[0783]
在一些实施方案中，同种异体细胞可以是不表达或以低水平表达抑制性分 子的细胞，例如通过本文所述的任何方法。例如，细胞可以是不表达或以低水 平表达抑制性分子的细胞，例如，可以降低表达car的细胞发动免疫效应子反 应的能力的细胞。抑制性分子的例子包括pd1、pd-l1、pd-l2、ctla4、tim3、 ceacam(例如，ceacam-1、ceacam-3和/或ceacam-5)、lag3、vista、 btla、tig、lair1、cd160、2b4、cd80、cd86、b7-h3(cd276)、b7-h4 (vtcn1)、hvem(tnfrsf14或cd270)、kir、a2ar、mhc i类、mhc ii 类、gal9、腺苷和tgfrβ。对抑制性分子的抑制(例如，通过在dna、rna 或蛋白质水平抑制)可以优化表达car的细胞性能。在实施方案中，可以使用 抑制性核酸，例如，抑制性核酸，例如，dsrna，例如，sirna或shrna、成 簇规律间隔的短回文重复序列(crispr)、转录激活物样效应子核酸酶(talen) 或锌指核酸内切酶(zfn)，例如，如本文所述。
[0784]
抑制tcr或hla的sirna和shrna
[0785]
在一些实施方案中，可以在细胞中使用sirna或shrna抑制tcr表达和/或 hla表达，所述的sirna或shrna靶向编码tcr和/或hla和/或本文所述的抑 制性分子(例如，pd1、pd-l1、pd-l2、ctla4、tim3、ceacam(例如、 ceacam-1、ceacam-3和/或ceacam-5)、lag3、vista、btla、tigit、 lair1、cd160、2b4、cd80、cd86、b7-h3(cd276)、b7-h4(vtcn1)、hvem (tnfrsf14或cd270)、kir、a2ar、mhc i类、mhc ii类、gal9、腺苷和 tgfrβ)的核酸。
[0786]
可以使用任何常规表达系统(例如，如慢病毒表达系统)实现在t细胞中表达 sirna和shrna。
[0787]
下调tcr的一种或多种组分表达的示例性shrna例如在美国公开号 2012/0321667中描述。下调hla i类基因和/或hla ii类基因表达的示例性 sirna和shrna例如在美国公
开号us 2007/0036773中描述。
[0788]
抑制tcr或hla的crispr
[0789]
如本文所用的“crispr”或“针对tcr和/或hla的crispr”或“抑制 tcr和/或hla的crispr”指一组成簇规律间隔的短回文重复序列或一个包括 这种重复序列组的系统。如本文所用，“cas”指crispr相关蛋白。crispr/cas
”ꢀ
系统指衍生自crispr和cas的系统，所述系统可以用来沉默或突变tcr和/ 或hla基因和/或本文所述的抑制性分子(例如，pd1、pd-l1、pd-l2、ctla4、 tim3、ceacam(例如，ceacam-1、ceacam-3和/或ceacam-5)、lag3、 vista、btla、tigit、lair1、cd160、2b4、cd80、cd86、b7-h3(cd276)、 b7-h4(vtcn1)、hvem(tnfrsf14或cd270)、kir、a2ar、mhc i类、mhc ii类、gal9、腺苷和tgfrβ)。
[0790]
在大约40％测序的真细菌基因组和90％测序的古细菌中找到了天然存在的 crispr/cas系统。grissa等人(2007)bmc bioinformatics 8:172。这种系统是 一个类型的原核免疫系统，其赋予对外来遗传元件如质粒和噬菌体的抵抗性并 提供一种形式的获得免疫力。barrangou等人(2007)science 315:1709-1712； marragini等人(2008)science 322:1843-1845。
[0791]
已经修饰crispr/cas系统用于真核生物如小鼠或灵长类中的基因编辑(沉 默、增强或改变特定基因)。wiedenheft等人(2012)nature 482:331-8。通过向 真核细胞引入含有特别设计的crispr和一个或多个适宜cas的质粒，实现这一 点。
[0792]
crispr序列，有时称作crispr基因座，包含交替的重复序列和间隔序列。 在天然存在的crispr中，间隔序列通常包含相对于细菌为外来的序列如质粒或 噬菌体序列；在tcr和/或hla crispr/cas系统中，间隔序列衍生自tcr或 hla基因序列。
[0793]
来自crispr基因座的rna组成型表达并由cas蛋白加工成小rna。这些包 含旁侧分布有重复序列的间隔序列。rna引导其他cas蛋白在rna或dna水平 沉默外源性遗传元件。horvath等人(2010)science 327:167-170；makarova等 人(2006)biology direct 1:7。间隔序列因此充当rna分子的模板，类似于 sirna。pennisi(2013)science 341:833-836。
[0794]
由于这些天然出现在许多不同类型的细菌中，crispr的确切布局和cas基 因及产物的结构、功能和数目或多或少地在物种之间不同。haft等人(2005) plos comput.biol.1:e60；kunin等人(2007)genome biol.8:r61；mojica等 人(2005)j.mol.evol.60:174-182；bolotin等人(2005)microbiol.151: 2551-2561；pourcel等人(2005)microbiol.151:653-663；和stern等人(2010) trends.genet.28:335-340。例如，cse(cas亚型，大肠杆菌)蛋白(例如，casa) 形成将crispr rna转录物加工成cascade保留的间隔序列-重复单元的功能复 合体cascade。brouns等人(2008)science 321:960-964。在其他原核生物中， cas6加工crispr转录物。在大肠杆菌中基于crispr的噬菌体失活需要cascade和cas3，但不需要cas1或cas2。激烈火球菌(pyrococcus furiosus)和其 他原核生物中的cmr(cas ramp模块)蛋白与识别并切割互补靶rna的小 crispr rna形成功能性复合体。更简单的crispr系统依赖于cas9蛋白，所 述蛋白是具有两个有效剪切位点(双螺旋的每条链各一个)的核酸酶。cas9和修饰 的crispr基因座rna组合可以用于编辑基因的系统中。pennisi(2013)science341:833-836。
[0795]
crispr/cas系统因此可以用来编辑tcr和/或hla基因(添加或缺失碱基 对)、或引起过早停止，这因此减少tcr和/或hla的表达。crispr/cas系统可 以备选地如同rna干扰那
样使用，以可逆方式关闭tcr和/或hla基因。在哺乳 动物细胞中，例如，rna可以引导cas蛋白质至tcr和/或hla启动子，在空间 上阻断rna聚合酶。
[0796]
使用本领域已知的技术，可以生成抑制tcr和/或hla的人工crispr/cas 系统，例如，美国公开号20140068797和cong(2013)science 339:819-823中描述 的那种。也可以生成本领域已知的抑制tcr和/或hla的其他人工crispr/cas 系统，例如，在tsai(2014)nature biotechnol.,32:6 569-576；美国专利号 8,871,445；8,865,406；8,795,965；8,771,945和8,697,359中描述的那种。
[0797]
抑制tcr和/或hla的talen
[0798]“talen”或“针对hla和/或tcr的talen”或“抑制hla和/或tcr的 talen”指转录激活物样效应核酸酶，一种可以用来编辑hla和/或tcr基因和 /或本文所述的抑制性分子(例如，pd1、pd-l1、pd-l2、ctla4、tim3、 ceacam(例如，ceacam-1、ceacam-3和/或ceacam-5)、lag3、vista、 btla、tigit、lair1、cd160、2b4、cd80、cd86、b7-h3(cd276)、b7-h4 (vtcn1)、hvem(tnfrsf14或cd270)、kir、a2ar、mhc i类、mhc ii 类、gal9、腺苷和tgfrβ)的人工核酸酶。
[0799]
通过tal效应子dna结合结构域融合于dna切割结构域，人工产生 talen。转录激活物样效应(tales)可以经工程化以结合任何目的dna序列， 包括hla或tcr基因的一部分。通过工程化的tale与dna切割结构域组合， 可以产生对任何目的dna序列(包括hla或tcr序列)特异的限制性酶。随后可 以将这些酶引入细胞中，在那里，它们可以用于基因组编辑。boch(2011)naturebiotech.29:135-6；和boch等人(2009)science 326:1509-12；moscou等人(2009) science 326:3501。
[0800]
tale是黄单胞菌属(xanthomonas)细菌分泌的蛋白质。dna结合结构域含 有重复的高度保守的33-34氨基酸序列，第12和第13氨基酸例外。这两个位置高 度可变，显示与特异性核苷酸识别的强相关性。它们因此可以经工程化以结合 至目的dna序列。
[0801]
为了产生talen，将tale蛋白与核酸酶(n)融合，所述核酸酶是野生型或 突变型foki核酸内切酶。已经对foki产生几种突变以便其用于talen中；这些 突变例如改善切割特异性或活性。cermak等人(2011)nucl.acids res.39:e82； miller等人(2011)nature biotech.29:143-8；hockemeyer等人(2011)naturebiotech.29:731-734；wood等人(2011)science 333:307；doyon等人(2010) nature methods 8:74-79；szczepek等人(2007)nature biotech.25:786-793；和 guo等人(2010)j.mol.biol.200:96。
[0802]
foki结构域作为二聚体发挥作用，因而需要取向和间距正确的对靶基因组 中位点具有独特dna结合结构域的两个构建体。tale dna结合结构域和foki 切割结构域之间的氨基酸残基数和两个独立talen结合位点之间的碱基数目 似乎均是实现高水平活性的重要参数。miller等人,(2011)nature biotech.29: 143-8。
[0803]
hla或tcr talen可以在细胞内部使用以产生双链断口(dsb)。如果修复 机制借助非同源末端接合不当地修复断口，则可以在断口位点处引入突变。例 如，不当修复可以引入移码突变。备选地，可以将外来dna随talen一起引入 细胞中；取决于外来dna的序列和染色体序列，这种方法可以用来纠正hla或 tcr基因中的缺陷或向wt hla或tcr基因中引入这种缺陷，因此减少hla或 tcr的表达。
[0804]
可以使用本领域已知的任何方法(包括使用模块化组件的多种方案)，构建对 hla
或tcr中的序列特异的talen。zhang等人(2011)nature biotech.29: 149-53；geibler等人(2011)plos one 6:e19509。
[0805]
抑制hla和/或tcr的锌指核酸酶
[0806]“zfn”或“锌指核酸酶”或“针对hla和/或tcr的zfn”或“抑制hla和/或 tcr的zfn”指锌指核酸酶，它是一种可以用来编辑hla和/或tcr基因和/或本 文所述的抑制性分子(例如，pd1、pd-l1、pd-l2、ctla4、tim3、ceacam (例如，ceacam-1、ceacam-3和/或ceacam-5)、lag3、vista、btla、 tigit、lair1、cd160、2b4、cd80、cd86、b7-h3(cd276)、b7-h4(vtcn1)、 hvem(tnfrsf14或cd270)、kir、a2ar、mhc i类、mhc ii类、gal9、 腺苷和tgfrβ)的人工核酸酶。
[0807]
如同talen，zfn包含与dna结合结构域融合的foki核酸酶结构域(或其 衍生物)。在zfn的情况下，dna结合结构域包含一个或多个锌指。carroll等人 (2011)genetics society of america 188:773-782；和kim等人(1996)proc.natl. acad.sci.usa 93:1156-1160。
[0808]
锌指是由一个或多个锌离子稳定化的小蛋白结构性基序。锌指可以例如包 含cys2his2，并且可以识别大约3bp序列。可以组合特异性已知的多种锌指以产 生识别约6、9、12、15或18bp序列的多指状物多肽。多种选择和模块化装配技 术可用于产生识别特定序列的锌指(及其组合)，包括噬菌体展示、酵母单杂交系 统、细菌单杂交和双杂交系统和哺乳动物细胞。
[0809]
如同talen，zfn必须二聚化以切割dna。因此，需要一对zfn以靶向非 回文性dna位点。两个独立zfn必须结合dna的对侧链，其核酸酶恰当地间隔 分开。bitinaite等人,(1998)proc.natl.acad.sci.usa 95:10570-5。
[0810]
还如同talen，zfn可以在dna中产生双链断口，后者若如果不当地修复 则可以产生移码突变、导致细胞中hla和/或tcr的表达和量减少。zfn也可以 随同源重组一起用于在hla或tcr基因中突变。
[0811]
可以使用本领域已知的任何方法，构建对hla/或tcr中的序列特异的 zfn。cathomen等人(2008)mol.ther.16:1200-7；guo等人(2010)j.mol.biol. 400:96；美国专利公开2011/0158957；和美国专利公开2012/0060230。
[0812]
端粒酶表达
[0813]
尽管不希望受任何具体理论约束，在一些实施方案中，治疗性t细胞在患者 中具有短期留存，原因在于t细胞中端粒缩短；因此，用端粒酶基因转染可以延 长t细胞的端粒并改善t细胞在患者中的持久性。参见carl june,“adoptive tcell therapy for cancer in the clinic”,journal of clinical investigation, 117:1466-1476(2007)。因此，在一个实施方案中，免疫效应细胞(例如，t细胞) 异位表达端粒酶亚基，例如，端粒酶的催化性亚基(例如，tert，例如，htert)。 在一些方面，本公开提供一种产生表达car的细胞的方法，包括使细胞与编码 端粒酶亚基(例如，端粒酶的催化性亚基(例如，tert，例如，htert))的核酸 接触。细胞可以在接触编码car的构建体之前、与之同时或之后与该核酸接触。
[0814]
在一个方面，本公开以一种产生免疫效应细胞(例如，t细胞、nk细胞)群 体的方法为特征。在一个实施方案中，该方法包括：提供免疫效应细胞(例如， t细胞或nk细胞)群体、使免疫效应细胞群体与编码car的核酸接触；和使免疫 效应细胞群体与编码端粒酶亚基
(例如，htert)的核酸在允许car和端粒酶表 达的条件下接触。
[0815]
在一个实施方案中，编码端粒酶亚基的核酸是dna。在一个实施方案中， 编码端粒酶亚基的核酸包含能够驱动端粒酶亚基表达的启动子。
[0816]
在一个实施方案中，htert具有如下的genbank蛋白质idaac51724.1的 氨基酸序列(meyerson等人,“hest2,the putative human telomerase catalytic subunit gene,is up-regulated in tumor cells and during immortalization
”ꢀ
cell第90卷，第4期，1997年8月22日，第785
–
795页)：
[0817]
mpraprcravrsllrshyrevlplatfvrrlgpqgwrlvqrgdpaafralvaqclvcvp wdarpppaapsfrqvsclkelvarvlqrlcergaknvlafgfalldgarggppeafttsv rsylpntvtdalrgsgawglllrrvgddvlvhllarcalfvlvapscayqvcgpplyql gaatqarppphasgprrrlgcerawnhsvreagvplglpapgarrrggsasrslplpkrp rrgaapepertpvgqgswahpgrtrgpsdrgfcvvsparpaeeatslegalsgtrhshpsv grqhhagppstsrpprpwdtpcppvyaetkhflyssgdkeqlrpsfllsslrpsltgarrlv etiflgsrpwmpgtprrlprlpqrywqmrplflellgnhaqcpygvllkthcplraavtp aagvcarekpqgsvaapeeedtdprrlvqllrqhsspwqvygfvraclrrlvppglwgs rhnerrflrntkkfislgkhaklslqeltwkmsvrgcawlrrspgvgcvpaaehrlreei lakflhwlmsvyvvellrsffyvtettfqknrlffyrksvwsklqsigirqhlkrvqlrel seaevrqhrearpalltsrlrfipkpdglrpivnmdyvvgartfrrekraerltsrvkalfs vlnyerarrpgllgasvlglddihrawrtfvlrvraqdpppelyfvkvdvtgaydtipqd rlteviasiikpqntycvrryavvqkaahghvrkafkshvstltdlqpymrqfvahlqet splrdavvieqssslneassglfdvflrfmchhavrirgksyvqcqgipqgsilstllcslcy gdmenklfagirrdglllrlvddfllvtphlthaktflrtlvrgvpeygcvvnlrktvvn fpvedealggtafvqmpahglfpwcgllldtrtlevqsdyssyartsirasltfnrgfkag rnmrrklfgvlrlkchslfldlqvnslqtvctniykilllqayrfhacvlqlpfhqqvwk nptfflrvisdtaslcysilkaknagmslgakgaagplpseavqwlchqafllkltrhrvt yvpllgslrtaqtqlsrklpgttltaleaaanpalpsdfktild(seq id no:606)
[0818]
在一个实施方案中，htert具有与seq id no:606的序列至少80％、85％、 90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的序列。在一个实施方案中，htert 具有seq id no:606的序列。在一个实施方案中，htert在n末端、c末端或 这两者处包含缺失(例如，不多于5、10、15、20、或30个氨基酸的缺失)。在一 个实施方案中，htert在n末端、c末端或这两者处包含转基因氨基酸序列(例 如，不多于5、10、15、20、或30个氨基酸的转基因氨基酸序列)。
[0819]
在一个实施方案中，htert由如下的genbank登录号af018167的核酸序列 (meyerson等人,“hest2,the putative human telomerase catalytic subunit gene,is up-regulated in tumor cells and during immortalization”cell第90 卷，第4期，1997年8月22日，第785
–
795页)编码：
[0820]
1 caggcagcgt ggtcctgctg cgcacgtggg aagccctggc cccggccacc cccgcgatgc
[0821]
61 cgcgcgctcc ccgctgccga gccgtgcgct ccctgctgcg cagccactac cgcgaggtgc
[0822]
121 tgccgctggc cacgttcgtg cggcgcctgg ggccccaggg ctggcggctg gtgcagcgcg
[0823]
181 gggacccggc ggctttccgc gcgctggtgg cccagtgcct ggtgtgcgtg ccctgggacg
[0824]
241 cacggccgcc ccccgccgcc ccctccttcc gccaggtgtc ctgcctgaag gagctggtgg
[0825]
301 cccgagtgct gcagaggctg tgcgagcgcg gcgcgaagaa cgtgctggcc ttcggcttcg
[0826]
361 cgctgctgga cggggcccgc gggggccccc ccgaggcctt caccaccagc gtgcgcagct
tccagactcc
[0852]
1921 gcttcatccc caagcctgac gggctgcggc cgattgtgaa catggactac gtcgtgggag
[0853]
1981 ccagaacgtt ccgcagagaa aagagggccg agcgtctcac ctcgagggtg aaggcactgt
[0854]
2041 tcagcgtgct caactacgag cgggcgcggc gccccggcct cctgggcgcc tctgtgctgg
[0855]
2101 gcctggacga tatccacagg gcctggcgca ccttcgtgct gcgtgtgcgg gcccaggacc
[0856]
2161 cgccgcctga gctgtacttt gtcaaggtgg atgtgacggg cgcgtacgac accatccccc
[0857]
2221 aggacaggct cacggaggtc atcgccagca tcatcaaacc ccagaacacg tactgcgtgc
[0858]
2281 gtcggtatgc cgtggtccag aaggccgccc atgggcacgt ccgcaaggcc ttcaagagcc
[0859]
2341 acgtctctac cttgacagac ctccagccgt acatgcgaca gttcgtggct cacctgcagg
[0860]
2401 agaccagccc gctgagggat gccgtcgtca tcgagcagag ctcctccctg aatgaggcca
[0861]
2461 gcagtggcct cttcgacgtc ttcctacgct tcatgtgcca ccacgccgtg cgcatcaggg
[0862]
2521 gcaagtccta cgtccagtgc caggggatcc cgcagggctc catcctctcc acgctgctct
[0863]
2581 gcagcctgtg ctacggcgac atggagaaca agctgtttgc ggggattcgg cgggacgggc
[0864]
2641 tgctcctgcg tttggtggat gatttcttgt tggtgacacc tcacctcacc cacgcgaaaa
[0865]
2701 ccttcctcag gaccctggtc cgaggtgtcc ctgagtatgg ctgcgtggtg aacttgcgga
[0866]
2761 agacagtggt gaacttccct gtagaagacg aggccctggg tggcacggct tttgttcaga
[0867]
2821 tgccggccca cggcctattc ccctggtgcg gcctgctgct ggatacccgg accctggagg
[0868]
2881 tgcagagcga ctactccagc tatgcccgga cctccatcag agccagtctc accttcaacc
[0869]
2941 gcggcttcaa ggctgggagg aacatgcgtc gcaaactctt tggggtcttg cggctgaagt
[0870]
3001 gtcacagcct gtttctggat ttgcaggtga acagcctcca gacggtgtgc accaacatct
[0871]
3061 acaagatcct cctgctgcag gcgtacaggt ttcacgcatg tgtgctgcag ctcccatttc
[0872]
3121 atcagcaagt ttggaagaac cccacatttt tcctgcgcgt catctctgac acggcctccc
[0873]
3181 tctgctactc catcctgaaa gccaagaacg cagggatgtc gctgggggcc aagggcgccg
[0874]
3241 ccggccctct gccctccgag gccgtgcagt ggctgtgcca ccaagcattc ctgctcaagc
[0875]
3301 tgactcgaca ccgtgtcacc tacgtgccac tcctggggtc actcaggaca gcccagacgc
[0876]
3361 agctgagtcg gaagctcccg gggacgacgc tgactgccct ggaggccgca gccaacccgg
[0877]
3421 cactgccctc agacttcaag accatcctgg actgatggcc acccgcccac agccaggccg
[0878]
3481 agagcagaca ccagcagccc tgtcacgccg ggctctacgt cccagggagg gaggggcggc
[0879]
3541 ccacacccag gcccgcaccg ctgggagtct gaggcctgag tgagtgtttg gccgaggcct
[0880]
3601 gcatgtccgg ctgaaggctg agtgtccggc tgaggcctga gcgagtgtcc agccaagggc
[0881]
3661 tgagtgtcca gcacacctgc cgtcttcact tccccacagg ctggcgctcg gctccacccc
[0882]
3721 agggccagct tttcctcacc aggagcccgg cttccactcc ccacatagga atagtccatc
[0883]
3781 cccagattcg ccattgttca cccctcgccc tgccctcctt tgccttccac ccccaccatc
[0884]
3841 caggtggaga ccctgagaag gaccctggga gctctgggaa tttggagtga ccaaaggtgt
[0885]
3901 gccctgtaca caggcgagga ccctgcacct ggatgggggt ccctgtgggt caaattgggg
[0886]
3961 ggaggtgctg tgggagtaaa atactgaata tatgagtttt tcagttttga aaaaaaaaaa
[0887]
4021 aaaaaaa (seq id no: 607)
[0888]
在一个实施方案中，htert由下述核酸编码，所述核酸具有与seq id no: 607的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的序 列。在一个实施方案中，htert由seq id no: 607的核酸编码。
[0889]
活化和扩充细胞
[0890]
可以通常使用如在例如以下文献中所述的方法活化和扩充细胞：美国专利 6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681； 7,144,
575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874； 6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开号20060121005。
[0891]
通常，可以通过与下述表面接触，扩充本发明的t细胞，所述表面已经与 刺激cd3/tcr复合物相关的信号的物质和刺激t细胞表面上共刺激分子的配 体连接。特别地，可以如本文所述那样，如通过接触于固定在表面上的抗cd3 抗体或其抗原结合片段或抗cd2抗体，或通过接触于蛋白激酶c激活物(例如， 草苔虫内酯)连同钙离子载体，刺激t细胞群体。为了共刺激t细胞表面上的辅 助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，t细胞群体可以在适于刺激t细胞 增殖的条件下与抗cd3抗体和抗cd28抗体接触。为了刺激cd4+t细胞或 cd8+t细胞增殖，可以使用抗cd3抗体和抗cd28抗体。抗cd28抗体的例子 包括9.3、b-t3、xr-cd28(diaclone,france)，可以如本领域共知的 其他方法可能那样使用(berg等人,transplant proc.30(8):3975-3977,1998； haanen等人,j.exp.med.190(9):13191328,1999；garland等人,j.immunolmeth.227(1-2):53-63,1999)。
[0892]
在某些方面，t细胞的初级刺激信号和共刺激信号可以由不同方案提供。例 如，提供每种信号的物质可以处于溶液中或与表面偶联。与表面偶联时，物质 可以与相同表面(即，处于“顺式”形式)偶联或与分立的表面偶联(即，处于“反式
”ꢀ
形式)。备选地，一个物质可以与表面偶联并且另一种物质处于溶液中。在一个 方面，提供共刺激信号的物质与细胞表面结合并且提供初级激活信号的物质处 于溶液中或与表面偶联。在某些方面，两种物质均可以处于溶液中。在一个方 面，物质可以处于可溶性形式，并且随后交联至表面，如表达将会与该物质结 合的fc受体或抗体或其他结合物的细胞。在这个方面，本发明构思了用于活化 和扩充t细胞的人工抗原呈递细胞(aapc)，参见例如，美国专利申请公开号 20040101519和20060034810。
[0893]
在一个方面，两种物质固定在珠上，其中它们固定在相同的珠上，即，“顺 式”，或固定至分立的珠上，即，“反式”。例如，提供初级活化信号的物质是抗 cd3抗体或其抗原结合片段并且提供共刺激信号的物质是抗cd28抗体或其抗 原结合片段；并且两种物质均以等同的分子数量共同固定至相同珠上。在一个 方面，对于cd4+t细胞扩充和t细胞生长，使用与珠结合的每种抗体的1:1比率。 在本发明的某些方面，如此使用与珠结合的抗cd3:cd28抗体的比率，从而如与 使用比率1:1时观察到的扩充相比，观察到t细胞扩充增加。在一个特定方面中， 如与使用比率1:1时观察到的扩充相比，观察到约1倍至约3倍的增加。在一个方 面，与珠结合的cd3:cd28抗体的比率是从100:1至1:100和其间的全部整数值。 在本发明的一个方面，比抗cd3抗体更多的抗cd28抗体与粒子结合，即， cd3:cd28的比率小于1。在本发明的某些方面，与珠结合的抗cd28抗体对抗 cd3抗体的比率大于2:1。在一个特定的方面中，使用1:100与珠结合的 cd3:cd28抗体比率。在一个方面，使用1:75与珠结合的cd3:cd28抗体比率。 在又一个方面，使用1:50与珠结合的cd3:cd28抗体比率。在一个方面，使用1:30 与珠结合的cd3:cd28抗体比率。在一个优选的方面，使用1:10与珠结合的 cd3:cd28抗体比率。在一个方面，使用1:3与珠结合的cd3:cd28抗体比率。在 又一个方面，使用3:1与珠结合的cd3:cd28抗体比率。
[0894]
粒子对细胞比率1:500至500:1和其间任何整数值可以用来刺激t细胞或其 他靶细胞。如本领域普通技术人员可以轻易地领会，粒子对细胞的比率可以取 决于相对于靶细胞的粒度。例如，小规格珠仅能结合一些细胞，而较大的珠能 结合许多细胞。在某些方面，
细胞对粒子的比率范围从1:100至100:1和其间的任 何整数值，并且在其他方面中，该比率包含1:9至9:1和其间的任何整数值、也可 以用来刺激t细胞。导致刺激t细胞的抗cd3偶联粒子和抗cd28偶联粒子对t细 胞的比率可以如上文所示变动，然而某些优选的值包括1:100、1:50、1:40、1:30、 1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、 6:1、7:1、8:1、9:1、10:1和15:1，一个优选的比率是每个t细胞至少1:1粒子。 在一个方面，使用1:1或更小的粒子对细胞比率。在一个特定方面，优选的粒子: 细胞比率是1:5。在其他方面，粒子:细胞比率可以根据刺激的日期变动。例如， 在一个方面，粒子:细胞比率在第1天是1:1至10:1，并且此后每日或每隔1日添加 额外粒子至细胞持续多达10天，按1:1至1:10的最终比率(基于添加日时的细胞计 数)添加。在一个特定方面，粒子:细胞比率在第1刺激日是1:1并且在第三刺激日 和第五刺激日调节至1:5。在一个方面，基于每日或每隔1日添加粒子至第1刺激 日时最终比率1:1，并且在第三刺激日和第五刺激日添加粒子至最终比率1:5。在 一个方面，粒子:细胞比率在第1刺激日是2:1并且在第三刺激日和第五刺激日调 节至1:10。在一个方面，基于每日或每隔1日添加粒子至第1刺激日时最终比率 1:1，并且在第三刺激日和第五刺激日添加粒子至最终比率1:10。本领域技术人 员将理解，多种其他比率可以在本发明中适用。特别地，比率将根据粒度和细 胞尺寸和类型变动。在一个方面，使用的最常见比率在第1天接近1:1、2:1和3:1。
[0895]
在本发明的其他方面，将细胞(如t细胞)与物质包被的珠组合，随后分离珠 和细胞，并且随后培养细胞。在备选方面，在培养之前，不分离物质包被的珠 珠和细胞，而是在一起培养。在又一个方面，首先通过应用某种力(如磁力)浓缩 珠和细胞、导致细胞表面标志物的连接增加，因而诱导细胞刺激作用。
[0896]
例如，可以通过使得与抗cd3和抗cd28连接的顺磁珠(3x28珠)接触t细胞， 连接细胞表面蛋白。在一个方面，将细胞(例如，104个至109个t细胞)和珠(例如， m-450 cd3/cd28t顺磁珠按比率1:1)在缓冲液例如pbs(不含 二价阳离子如钙和镁)中合并。再次，本领域普通技术人员可以轻易地领会，可 以使用任何细胞浓度。例如，靶细胞可能在样品中非常稀少并仅占样品的0.01％ 或整个样品(即，100％)可能包含目的靶细胞。因此，任何细胞数目均属于本发 明上下文的范围内。在某些方面，可能想要明显减少粒子和细胞混合在一起的 体积(即，增加细胞浓度)以确保细胞和粒子最大限度接触。例如，在一个方面， 使用约100亿个细胞/ml、90亿/ml、80亿/ml、70亿/ml、60亿/ml、50亿/ml、或20 亿个细胞/ml的浓度。在一个方面，使用大于1亿个细胞/ml。在又一个方面，使 用1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5千万个细胞/ml的细胞浓度。在又一个方 面，使用75、80、85、90、95或100百万个细胞/ml细胞浓度。在其他方面，可 以使用1.25亿或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致增加的细胞产量、 细胞活化和细胞扩充。另外，使用高细胞浓度允许更高效地捕获可能微弱表达 目的靶抗原的细胞，如cd28阴性t细胞。在某些方面，这类细胞群体可能具有 治疗价值并且将希望获得。例如，使用高浓度的细胞允许更高效地选择正常情 况下较弱cd28表达的cd8+t细胞。
[0897]
在一个实施方案中，扩充用编码car(例如，本文所述的car)的核酸转导 的细胞，例如，通过本文所述的方法扩充。在一个实施方案中，将细胞在培养 下扩充几小时(例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21小时)至约14 天(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)。在一个实施 方案中，将细胞扩充4至9天时间。在一个实施方案中，将细胞扩充8
天或更短(例 如，7、6或5天)时间。在一个实施方案中，将细胞(例如，本文所述的cd123 car 细胞)在培养下扩充5天并且所产生的细胞比相同培养条件下培养扩充9天的相 同细胞更有效力。效力可以例如由多种t细胞功能例如增殖、靶细胞杀伤作用、 细胞因子产生、活化、移行、或其组合定义。在一个实施方案中，与相同培养 条件下培养扩充9天的相同细胞相比，在培养下扩充5天的细胞(例如，本文所述 的cd123 car细胞)显示在抗原刺激时细胞倍增作用增长至少1、2、3或4倍。在 一个实施方案中，将表达本文所述的cd123 car的细胞在培养下扩充5天，并 且与相同培养条件下培养扩充9天的相同细胞相比，所产生的细胞显示出更高的 促炎细胞因子产量，例如，更高的ifn-γ水平和/或gm-csf水平。在一个实施方 案中，与相同培养条件下培养扩充9天的相同细胞相比，在培养下扩充5天的细 胞(例如，本文所述的cd123 car细胞)显示以pg/ml计的促炎细胞因子产量(例 如，ifn-γ水平和/或gm-csf水平)增长至少1、2、3、4、5、10倍或更多。
[0898]
在本发明的一个方面，可以将混合物培养几小时(约3小时)至约14天或期间 的任何小时整数值。在一个方面，可以将混合物培养21天。在本发明的一个方 面，将珠和t细胞在一起培养约8天。在一个方面，将珠和t细胞在一起培养2-3 天。也可能需要几轮刺激，从而t细胞培养时间可以是60天或更长。适于t细胞 培养的条件包括适宜的培养基(例如，极限基本培养基或rpmi培养基1640或 x-vivo15，(lonza))，所述培养基可以含有增殖和生存力必需的因子，包括血清 (例如，胎牛血清或人血清)、白介素-2(il-2)、胰岛素、ifn-γ、il-4、il-7、gm-csf、 il-10、il-12、il-15、tgfβ和tnf-α或技术人员已知的用于细胞生长的任何其 他添加物。用于细胞生长的其他添加物包括但不限于表面活性剂、血浆蛋白粉 (plasmanate)和还原剂如n-乙酰-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括 rpmi1640、aim-v、dmem、mem、α-mem、f-12、x-vivo15和x-vivo20、 optimizer，连同添加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充有足以生长 和扩充t细胞的适宜量的血清(或血浆)或限定的成组激素和/或某种量的细胞因 子。抗生素，例如，青霉素和链霉素仅包含于实验性培养物中，不包含于待输 注入受试者的细胞培养物中。将靶细胞在支持生长所必需的条件下维持，例如， 适宜的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气外加5％co2)。
[0899]
在一个实施方案中，将细胞在适宜的培养基(例如，本文所述的培养基)中扩 充，所述培养基包括导致细胞在14天扩充时间内增加至少200倍(例如，200倍、 250倍、300倍、350倍)(例如，如通过本文所述的方法(如流式细胞术)所测量)的 一种或多种白介素。在一个实施方案中，将细胞在il-15和/或il-7(例如，il-15 和il-7)存在下扩充。
[0900]
在实施方案中，本文所述的方法(例如，生产表达car的细胞的方法)包括 例如使用抗cd25抗体或其片段或cd25结合配体il-2，从细胞群体移除调节性t 细胞，例如，cd25+t细胞。本文中描述了从细胞群体移除调节性t细胞(例如， cd25+t细胞)的方法。在实施方案中，方法(例如，生产方法)还包括：使细胞群 体(例如，其中调节性t细胞(如cd25+t细胞)已经消耗的细胞群体；或先前已经 接触过抗cd25抗体、其片段或cd25结合配体的细胞群体)与il-15和/或il-7接 触。例如，将细胞群体(例如，先前已经接触过抗cd25抗体、其片段或cd25结 合配体的细胞群体)在il-15和/或il-7存在下扩充。
[0901]
在一些实施方案中，本文所述的表达car的细胞与组合物在产生表达car 的细胞期间(例如，离体)接触，所述组合物包含白介素-15(il-15)多肽、白介素
ꢀ-
15受体α(il-15ra)多肽或il-15多肽和il-15ra多肽(例如，hetil-15)的组合。在 实施方案中，本文所述
cart进行相似实验。
[0912]
可以用标准
51
cr-释放测定法评估细胞毒性。参见，例如，milone等人, molecular therapy 17(8):1453-1464(2009)。简而言之，将靶细胞(k562系和原 代前b-all细胞)在37℃用
51
cr(作为nacro4，new england nuclear,boston, ma)加载2小时伴以频繁搅拌，在完全rpmi中洗涤2次并置于微量滴定板中。在 孔中，将效应t细胞与靶细胞在完全rpmi中按不同的效应细胞:靶细胞比率(e:t) 混合。还制备仅含有培养基(自发释放，sr)或1％triton-x100去垢剂溶液(总释 放，tr)的额外孔。在37℃温育4小时后，从每个孔收获上清液。随后使用γ粒子 计数器(packard instrument co.,waltham,ma)测量释放的
51
cr。每条件按至少 三次重复进行并且使用下式计算裂解百分数：裂解％＝(er-sr)/(tr
–
sr)，其 中er代表每种实验条件的
51
cr平均释放。
[0913]
可以用成像技术来评价携瘤动物模型中car的特异性转运和增殖。已经描 述了此类测定法，例如，在barrett等人,human gene therapy 22:1575-1586 (2011)中描述。简而言之，对nod/scid/γc
–
/
–
(nsg)小鼠静脉内注射nalm-6细胞， 7天后，以car构建体电穿孔后4小时，静脉内注射t细胞。t细胞用表达萤火虫 萤光素酶的慢病毒构建体稳定转染并且对小鼠的生物发光成像。备选地，可以 如下测量nalm-6异种移植模型中单次注射car
+ t细胞的治疗功效和特异性：对 nsg小鼠注射经转导以稳定表达萤火虫萤光素酶的nalm-6，7天后，随后单次尾 静脉内注射以cd123 car电穿孔的t细胞。在注射后的各种时间点对动物成像。 例如，可以在第5日(处理前2天)和第8日(car
+
pbl后24小时)生成代表性小鼠中 萤火虫萤光素酶阳性白血病的光子密度热图。
[0914]
其他测定法，包括在本文实施例部分中描述的那些以及本领域已知的那些， 也可以用来评价本发明cd123 car构建体。
[0915]
备选地或联合本文所公开的方法，公开了涉及使用car配体的以下一项或 多项的方法和组合物：检测和/或定量表达car的细胞(例如，体外或体内(例如， 临床监测))；免疫细胞扩充和/或活化；和/或car-特异性选择。在一个示例性实 施方案中，car配体是与car分子结合的抗体，例如，与car的胞外抗原结合 结构域结合的抗体(例如，与抗原结合结构域结合的抗体，例如，抗独特型抗体； 或与胞外结合结构域的恒定区结合的抗体)。在其他实施方案中，car配体是 car抗原分子(例如，如本文所述的car抗原分子)。
[0916]
在一个方面，公开了一种用于检测和/或定量表达car的细胞的方法。例如， car配体可以用来在体外或在体内检测和/或定量表达car的细胞(例如，临床 监测患者中表达car的细胞或向患者给药)。该方法包括：
[0917]
提供car配体(任选地，标记的car配体，例如，包含标签、珠、放射性或 荧光标记的car配体)；
[0918]
获得表达car的细胞(例如，获得含有表达car的细胞的样品，如制造样品 或临床样品)；
[0919]
使表达car的细胞与car配体在发生结合的条件下接触，因而检测存在的 表达car的细胞的水平(例如，量)。可以使用标准技术如facs、elisa等，检 测表达car的细胞与car配体的结合。
[0920]
在另一个方面，公开了一种扩充和/或活化细胞(例如，免疫效应细胞)的方 法。该方法包括：
[0921]
提供表达car的细胞(例如，第一表达car的细胞或瞬时表达car的细胞)；
[0922]
使所述表达car的细胞与car配体(例如，如本文所述的car配体)在其中 发生免疫细胞扩充和/或增殖的条件下接触，因而产生活化和/或扩充的细胞群 体。
[0923]
在某些实施方案中，car配体在(例如，固定至或接合至)底物(例如，非天 然存在的底物)上存在。在一些实施方案中，底物是非细胞底物。非细胞底物可 以是选自例如平板(例如，微量滴定板)、膜(例如，硝酸纤维素膜)、基质、芯片 或珠的固相支持物。在实施方案中，car配体在底物中(例如，在底物表面上) 存在。car配体可以共价或非共价地固定、连接或接合(例如，交联)至底物。 在一个实施方案中，car配体连接(例如，共价连接至)珠。在前述实施方案中， 可以在体外或离体扩充免疫细胞群体。这种方法可以还包括在car分子的配体 存在下培养免疫细胞群体，例如，使用本文所述的任何方法培养。
[0924]
在其他实施方案中，扩充和/或活化细胞的方法还包括添加第二种刺激分 子，例如，cd28。例如，car配体和第二种刺激分子可以固定至底物，例如， 一个或多个珠，因而提供增加的细胞扩充和/或活化。
[0925]
在又一个方面，提供一种用于选择或富集表达car的细胞的方法。该方法 包括使表达car的细胞与如本文所述的car配体接触；并且基于car配体的结 合作用选择细胞。
[0926]
在另外的其他实施方案中，提供一种用于消耗、减少和/或杀伤表达car的 细胞的方法。该方法包括使表达car的细胞与如本文所述的car配体接触；并 且基于car配体的结合作用靶向细胞，因而减少表达car的细胞的数目和/或杀 伤表达car的细胞。在一个实施方案中，car配体偶联至毒性物质(例如，毒素 或细胞消融药物)。在另一个实施方案中，抗独特型抗体可以造成效应细胞活性， 例如，adcc或adc活性。
[0927]
可以在本文所公开的方法中使用的示例性抗car抗体例如在wo 2014/190273中并由jen等人,“chimeric antigen receptor(car)-specificmonoclonal antibody to detect cd19-specific t cells in clinical trials”,plosmarch 2013 8:3e57838描述，所述文献的内容通过引用的方式并入。在一个实 施方案中，抗独特型抗体分子识别抗cd19抗体分子，例如，抗cd19 scfv。例 如，抗独特型抗体分子可以竞争与jena等人,plos march 2013 8:3 e57838中描 述的cd19-特异性car mab克隆第136.20.1号结合；可以具有与cd19-特异性 car mab克隆第136.20.1号相同的cdr(例如使用kabat定义、chothi定义或 kabat定义和chothia定义的组合时，vh cdr1、vh cdr2、chcdr3、vlcdr1、vl cdr2和vl cdr3中一者或多者(例如，全部))；可以具有如cd19
-ꢀ
特异性car mab克隆第136.20.1号那样的一个或多个(例如，2个)可变区，或可 以包含cd19-特异性car mab克隆第136.20.1号。在一些实施方案中，根据jena 等人中描述的一种方法制备抗独特型抗体。在另一个实施方案中，抗独特型抗 体分子是在wo 2014/190273中描述的抗独特型抗体分子。在一些实施方案中， 抗独特型抗体分子具有与wo 2014/190273的抗体分子如136.20.1相同的cdr(例 如，vh cdr1、vh cdr2、chcdr3、vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3中 一者或多者(例如，全部))；可以具有wo 2014/190273的抗体分子的一个或多个 (例如，2个)可变区，或可以包含wo 2014/190273的抗体分子如136.20.1。在其 他实施方案中，抗car抗体与(例如，如wo 2014/190273中所述的)car分子的 胞外结合结构域的恒定区结合。在一些实施方案中，抗car抗体与car分子的 胞外结合结构域的恒定区(例如，重链恒定区(例如，ch2-ch3铰链区)或轻链恒 定区)结合。例如，在一些实施方案中，抗car抗体竞争与wo 2014/190273中描 述的
2d3单克隆抗体的结合，具有与2d3相同的cdr(例如，vh cdr1、vhcdr2、chcdr3、vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3中一者或多者(例如，全 部))，或具有2d3的一个或多个(例如，2个)可变区，或包含如wo 2014/190273 中所述的2d3。
[0928]
在一些方面和实施方案中，本文的组合物和方法针对特定t细胞亚群而优 化，例如，如2014年7月31日提交的美国系列号62/031,699中所述，所述文献的 内容通过引用的方式完整并入本文。在一些实施方案中，与对照t细胞(例如， 表达相同构建体的不同类型(例如，cd8
+
或cd4
+
)的t细胞)相比，优化的t细胞 亚群显示增强的持久性。
[0929]
在一些实施方案中，cd4
+
t细胞包含本文所述的car，所述car包含适于 cd4
+ t细胞(例如，针对其而优化，例如，在其中导致增强的持久性)的胞内信 号结构域，例如，icos结构域。在一些实施方案中，cd8
+
t细胞包含本文所述 的car，所述car包含适于cd8
+ t细胞(例如，针对其而优化，例如，导致其增 强的持久性)的胞内信号结构域，例如，4-1bb结构域、cd28结构域或除icos 结构域之外的另一种共刺激结构域。在一些实施方案中，本文所述的car包含 本文所述的抗原结合结构域，例如，包含特异性结合cd123的抗原结合结构域 的car，例如，表2或表6的car。
[0930]
在一个方面，本文中描述了一种治疗受试者(例如，患有癌症的受试者)的方 法。该方法包括向所述受试者施用有效量的：
[0931]
1)包含car的cd4
+
t细胞(car
cd4+
)
[0932]
所述car包含：
[0933]
抗原结合结构域，例如，本文所述的抗原结合结构域，例如，特异性结合 cd123的抗原结合结构域，例如，表2、表6或表9的抗原结合结构域；
[0934]
跨膜结构域；和
[0935]
胞内信号结构域，例如，第一共刺激结构域，例如，icos结构域；和
[0936]
2)包含car的cd8
+ t细胞(car
cd8+
)，所述car包含：
[0937]
抗原结合结构域，例如，本文所述的抗原结合结构域，例如，特异性结合 cd123的抗原结合结构域，例如，表2、表6或表9的抗原结合结构域；
[0938]
跨膜结构域；和
[0939]
胞内信号结构域，例如，第二种共刺激结构域，例如，4-1bb结构域、cd28 结构域、或除icos结构域之外的另一种共刺激结构域；
[0940]
其中car
cd4+
和car
cd8+
彼此不同。
[0941]
任选地，该方法还包括施用：
[0942]
3)包含car的第二种cd8+t细胞(第二car
cd8+
)，所述car包含：
[0943]
抗原结合结构域，例如，本文所述的抗原结合结构域，例如，与cd123特 异性结合的抗原结合结构域，例如，表2、表6或表9的抗原结合结构域；
[0944]
跨膜结构域；和
[0945]
胞内信号结构域，其中第二car
cd8+
包含在car
cd8+
上不存在的胞内信号 结构域，例如，共刺激信号结构域，并且任选地，不包含icos信号结构域。
[0946]
治疗性应用
[0947]
cd123相关的疾病和/或病症
[0948]
本发明尤其提供了用于治疗与表达cd123相关的疾病或与表达cd123的 细胞相关
的病状，例如，包括增生性疾病如癌症或恶性肿瘤或癌前期疾病如脊 髓发育不良、脊髓发育不良综合征或白血病前期；或与表达cd123的细胞相关 的非癌症相关适应征的组合物和方法，在一个方面，与表达cd123相关的癌症 是血液癌症。在一个方面，血液癌症包括但不限于aml、脊髓发育不良综合征、 all、慢性髓样白血病、母细胞性浆细胞样树状细胞肿瘤、骨髓增生性肿瘤、 霍奇金淋巴瘤等。另外，与表达cd123相关的其他疾病例如包括但不限于与表 达cd123相关的非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前期疾病或增生性疾病。 也可以包括与表达cd123相关的非癌症相关适应征。
[0949]
在一个方面，本发明提供用于治疗与表达cd123相关的疾病的方法。在一 个方面，本发明提供用于治疗其中部分肿瘤为cd123阴性且部分肿瘤为cd123 阳性的疾病的方法。例如，本发明的car可用于治疗已经就与cd123表达升高 相关的疾病而接受治疗的受试者，其中已经就与cd123水平升高而接受治疗的 受试者显示出与cd123水平升高相关的疾病。在实施方案中，本发明的car可 用于治疗已经就与cd123表达相关的疾病而接受治疗的受试者，其中已经接受 与cd123表达相关的治疗的受试者显示出与cd123表达相关的疾病。
[0950]
在一个方面，本发明涉及一种载体，所述载体包含与启动子有效连接的 cd123 car，用于在哺乳动物免疫效应细胞(例如，t细胞或nk细胞)中表达。 在一个方面，本发明提供表达cd123 car的重组t细胞用于治疗表达cd123的 肿瘤，其中表达cd123 car的重组免疫效应细胞(例如，t细胞或nk细胞)称作 表达cd123 car的细胞(例如，cd123 cart或表达cd123 car的nk细胞)。 在一个方面，本发明的cd123 cart能够使肿瘤细胞与本发明的至少一种在其 表面上表达的cd123 car如此接触，从而表达car的细胞(例如，cd123 cart 或表达cd123 car的nk细胞)靶向肿瘤细胞并且抑制肿瘤的生长。
[0951]
在一个方面，本发明涉及一种抑制表达cd123的肿瘤细胞生长的方法，所 述方法包括使肿瘤细胞与本发明的表达cd123 car的细胞(例如，cd123 cart 或表达cd123 car的nk细胞)接触，从而表达car的细胞(例如，cd123 cart 或表达cd123 car的nk细胞)响应于抗原而活化并靶向癌细胞，其中抑制了肿 瘤的生长。
[0952]
在一个方面，本发明涉及一种治疗受试者中癌症的方法。该方法包括向受 试者如此施用本发明的表达cd123 car的细胞(例如，cd123 cart或表达 cd123 car的nk细胞)，从而治疗受试者中的癌症。通过本发明的表达cd123car的细胞(例如，cd123 cart或表达cd123 car的nk细胞)可治疗的癌症的 例子是与表达cd123相关的癌症。通过本发明的表达cd123 car的细胞(例如、 cd123 cart或表达cd123 car的nk细胞)可治疗的癌症的例子包括但不限于 aml、霍奇金淋巴瘤、脊髓发育不良综合征、慢性髓样白血病和其他骨髓增生 性肿瘤、或母细胞性浆细胞样树状细胞肿瘤等。
[0953]
本发明包括一个类型的细胞疗法，其中免疫效应细胞(例如，t细胞或nk细 胞)经基因修饰以表达嵌合抗原受体(car)并且将表达cd123 car的细胞(例 如，cd123 cart或表达cd123 car的nk细胞)输注至有需求的接受者。输注 的细胞能够杀伤接受者中的肿瘤细胞。不同于抗体疗法，car修饰的免疫效应 细胞(例如，car修饰的t细胞或car修饰的nk细胞)能够在体内复制，产生可 以导致持久肿瘤控制的长期持久性。在多个方面，在施用免疫效应细胞(例如， t细胞或nk细胞)至患者后，向患者施用的免疫效应细胞(例如，t细胞或nk细 胞)或其后代持续存在于患者中至少4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个 月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、 18个月、19个月、20个月、21
个月、22个月、23个月、2年、3年、4年或5年。
[0954]
本发明还包括一个类型的细胞疗法，其中免疫效应细胞(例如，t细胞或nk 细胞)经修饰(例如，由体外转录的rna修饰)以瞬时表达嵌合抗原受体(car)并 且将表达car的细胞(例如，car t细胞或car nk细胞)输注至有需求的接受 者。输注的细胞能够杀伤接受者中的肿瘤细胞。因此，在多个方面，在施用免 疫效应细胞(例如，t细胞或nk细胞)至患者后，向患者施用的免疫效应细胞(例 如，t细胞或nk细胞)存在少于1个月，例如，3周、2周、1周。
[0955]
不希望受任何具体理论约束，由car修饰的免疫效应细胞(例如，t细胞或 nk细胞)激发的抗肿瘤免疫应答可以是主动或被动免疫应答、或备选地可以归 因于直接与间接免疫应答。在一个方面，car转导的免疫效应细胞(例如，t细 胞或nk细胞)显示出响应于表达cd123的人癌细胞的特异性促炎细胞因子分泌 和强力溶细胞活性，抵抗可溶性cd123抑制，介导旁观者杀伤作用并介导已建 立的人肿瘤消退。例如，在表达cd123的肿瘤的内部不均一视野内部抗原较少 的肿瘤细胞可能易遭cd123重定向的免疫效应细胞(例如，t细胞或nk细胞)的间 接破坏，其中所述cd123重定向的免疫效应细胞事先已经针对毗邻的抗原阳性 癌细胞反应。
[0956]
在一个方面，本发明的全人car修饰的免疫效应细胞(例如，t细胞或nk细 胞)可以是在哺乳动物中用于离体免疫和/或体内治疗的一种疫苗。在一个方面， 哺乳动物是人。
[0957]
对于离体免疫，在施用细胞(例如，t细胞或nk细胞)至哺乳动物之前在 体外进行至少一种以下操作：i)扩充细胞、ii)引入编码car的核酸至细胞或iii) 冷冻保存细胞。
[0958]
离体程序是本领域熟知的并且在下文更充分地讨论。简而言之，将细胞从 哺乳动物(例如，人)分离并用本文公开的表达car的载体进行基因修饰(即，在 体外转导或转染)。可以将car修饰的细胞施用至哺乳动物接受者以提供治疗益 处。哺乳动物接受者可以是人并且car修饰的细胞可以相对于接受者是自体的。 备选地，细胞可以相对于接受者是同种异体的、同基因的或异种的。
[0959]
离体扩充造血干细胞和祖先细胞的方法在通过引用的方式并入本文的美国 专利号5,199,942中描述，可以应用于本发明的细胞。其他合适的方法是本领域 已知的，因此，本发明不限于离体扩充细胞的任何具体方法。简而言之，t细胞 的离体培养和扩充包括：(1)从外周血收获物或骨髓外植体采集来自哺乳动物的 cd34+造血干细胞和祖先细胞；和(2)离体扩充这类细胞。除美国专利号5,199,942 中描述的细胞生长因子之外，其他因子如flt3-l、il-1、il-3和c-kit配体也可以 用于细胞的培养和扩充。
[0960]
就离体免疫而言除使用基于细胞的疫苗之外，本发明还提供用于体内免疫 以激发患者中针对抗原的免疫应答的组合物和方法。
[0961]
通常，如本文所述的细胞活化和扩充可以用于治疗和预防在免疫受损的个 体中出现的疾病。特别地，本发明的car修饰的免疫效应细胞(例如，t细胞或 nk细胞)用于治疗与表达cd123相关的疾病、病症和病状。在某些方面，本发明 的细胞用于治疗面临形成与表达cd123相关的疾病、病症和病状的风险的患者。 因此，本发明提供用于治疗或预防与表达cd123相关的疾病、病症和病状的方 法，所述方法包括向有需求的受试者施用治疗有效量的本发明的car修饰的免 疫效应细胞(例如，t细胞或nk细胞)。
[0962]
在一个方面，本发明表达car的细胞(cart细胞或表达car的nk细胞)可 以用来治疗增生性疾病如癌症或恶性肿瘤或癌前期疾病如脊髓发育不良、脊髓 发育不良综合征或
白血病前期。在一个方面，与表达cd123相关的癌症是血液 癌症、白血病前期、过度增殖性疾病、增生或发育异常，其以细胞异常生长为 特征。
[0963]
在一个方面，本发明表达car的细胞(cart细胞或表达car的nk细胞)用 来治疗癌症，其中癌症是血液癌症。血液癌症疾病是多种类型侵袭血液、骨髓 和淋巴系统的癌症如白血病和恶性淋巴细胞增生性疾病。
[0964]
在一个方面，本发明的组合物和表达car的细胞(cart细胞或表达car的 nk细胞)特别地可用于治疗髓样白血病、aml及其亚型、慢性髓样白血病(cml)、脊髓发育不良综合征(mds)、骨髓增生性肿瘤(mpn)、组织细胞疾 病和肥大细胞疾病。
[0965]
白血病可以划分成急性白血病和慢性白血病。急性白血病可以进一步划分 为急性髓细胞白血病(aml)和急性淋巴样白血病(all)。慢性白血病包括慢性髓 性白血病(cml)和慢性淋巴样白血病(cll)。其他相关的疾病包括脊髓发育不良 综合征(mds，以前称作“白血病前期”)，其是依据髓样血细胞无效产生(或发育 异常(dysplasia))而统一的血液疾病的多样性集合，和转化成aml的风险。
[0966]
淋巴瘤是一组从淋巴细胞形成的血细胞肿瘤。示例性淋巴瘤包括非霍奇金 淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
[0967]
在aml中，异常分化的长寿命髓样祖先细胞的恶变和失控增殖导致高循环 数目的不成熟血液形式和恶性细胞替换正常骨髓。症状包括疲乏、脸色苍白、 易淤紫和出血、发热和感染；白血病浸润的症状存在于仅约5％患者中(经常作 为皮肤表现)。检验外周血涂片和骨髓具有诊断意义。现有治疗包括实现缓解的 诱导化疗和避免复发的缓解后化疗(伴以或不伴以干细胞移植)。
[0968]
aml具有彼此通过形态、免疫表型和细胞化学区分的众多亚型。基于优势 细胞类型，描述了五个类型，包括髓样型、髓样单核细胞型、单核细胞型、红 细胞样型和巨核细胞型。
[0969]
缓解诱导率是50％至85％。长期无疾病生存据报道在20％至40％患者中出 现并且在用干细胞移植治疗的较年轻患者中增加至40％至50％。
[0970]
预后因素有助于确定治疗方案和强度；通常对具有强烈不良预后特征的患 者给予更强烈形式的疗法，原因是认为潜在益处证明治疗毒性增加有理。最重 要的预后因素是白血病细胞核型；有利的核型包括t(15；17)、t(8；21)和inv16 (p13；q22)。不利因素包括递增的年龄、先前脊髓发育不良期、继发性白血病、 wbc计数高和不存在auer小体(auer rods)。
[0971]
初始疗法尝试诱导缓解并且与all差异最大，因为aml对更少的药物做出 反应。基础诱导治疗方案包括阿糖胞苷连续静脉内输注或大剂量5至7天；在这 个时间期间静脉给予佐柔比星或伊达比星3天。一些方案包括6-硫鸟嘌呤、依托 泊苷、长春新碱和泼尼松，但是不清楚它们的贡献。治疗通常导致明显的骨髓 抑制，伴随感染或出血；在骨髓恢复之前存在明显的延迟时间。在这个时间期 间，细心的预防性和支持性护理至关重要。
[0972]
慢性骨髓性(或髓样)白血病(cml)也称作慢性粒细胞白血病，并且表征为一 种白细胞癌。常见的cml治疗方案包括bcr-abl酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼 达沙替尼和尼洛替尼。bcr-abl酪氨酸激酶抑制剂特别可用于具 有费城染色体易位的cml患者。
[0973]
脊髓发育不良综合征(mds)是以杂乱和无效的造血或血液产生为特征的血 液学医学疾病。因此，血液形成细胞的数目和质量不可逆地下降。一些mds患 者可能形成重度贫血，而其他患者无症状。mds的分类方案是本领域已知的， 具有指定特定血细胞类型(例如，成髓细胞、单核细胞和红细胞前体)的比率或频 率的标准。mds包括难治性贫血、难治性贫血伴环形铁粒幼红细胞(ringsideroblast)、难治性贫血伴过量母细胞、难治性贫血伴转化下的过量母细胞、 慢性骨髓-单核细胞白血病(cml)。
[0974]
mds的治疗随症状的严重程度变动。针对出现重度症状的患者的激进治疗 形式包括骨髓移植和采用血液制品支持(例如，输血)和造血生长因子(例如，促 红细胞生成素)的支持疗法。其他药物频繁地用来治疗mds：5-氮杂胞苷、地西 他滨和来那度胺。在一些情况下，也可以施用铁螯合剂去铁胺和地 拉罗司
[0975]
在另一个实施方案中，本发明表达car的细胞(例如，cart细胞或表达 car的nk细胞)用来治疗伴白血病干细胞的癌症或白血病。例如，白血病干细 胞是cd34
+
/cd38-白血病细胞。
[0976]
本发明尤其提供了用于治疗癌症的组合物和方法。在一个方面，癌症是血 液癌症，包括但不限于白血病(如急性髓细胞白血病、慢性髓性白血病、急性淋 巴样白血病、慢性淋巴样白血病和脊髓发育不良综合征)和恶性淋巴细胞增生性 疾病，包括淋巴瘤(如多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、burkitt 淋巴瘤和小细胞-滤泡淋巴瘤和大细胞-滤泡淋巴瘤)。
[0977]
在一个方面，本发明表达car的细胞(例如，cart细胞或表达car的nk 细胞)可以用来治疗其他癌症和恶性肿瘤，如，但不限于，例如，急性白血病， 包括但不限于例如b细胞急性淋巴样白血病(“b-all”)、t细胞急性淋巴样白血 病(“t-all”)、急性淋巴样白血病(all)；一种或多种慢性白血病，包括但不限 于，例如，慢性髓性白血病(cml)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)；额外的血液 癌症或血液疾病，包括但不限于，例如，b细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆 细胞样树状细胞肿瘤、burkitt淋巴瘤、弥散性大b细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、 多毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡淋巴瘤、恶性淋巴细胞增生性疾病、 malt淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良 和脊髓发育不良综合征、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、 浆细胞样树状细胞肿瘤、waldenstrom巨球蛋白血症和作为依据髓样血细胞无 效产生(或发育异常)联合的多样性血液疾病集合的“白血病前期”等。本发明的 car修饰的免疫效应细胞(例如，t细胞或nk细胞)可以单独施用或作为药物组 合物与稀释剂和/或与其他组分如il-2或其他细胞因子或细胞群体组合施用。
[0978]
本发明还提供用于抑制表达cd123的细胞群体增殖或减少表达cd123的细 胞群体的方法，所述方法包括：使包含表达cd123的细胞的细胞群体与结合至 该表达cd123的细胞的本发明表达car的细胞(例如，cd123 cart细胞或表达 cd123 car的nk细胞)接触。在一个具体方面，本发明提供用于抑制表达cd123 的癌细胞群体增殖或减少表达cd123的癌细胞群体的方法，所述方法包括：使 表达cd123的癌细胞的细胞群体与结合至该表达cd123的细胞的本发明表达 car的细胞(例如，cd123 car t细胞或表达cd123 car的nk细胞)接触。在 一个方面，本发明提供用于抑制表达cd123的癌细胞群体增殖或减少表达 cd123的癌细胞群体的方法，所述方法包括：使表达cd123的癌细胞的细胞群 体与结合至该表达cd123的细
胞的本发明表达car的细胞(例如，cd123 car t 细胞或表达cd123 car的nk细胞)接触。在某些方面，在患有髓样白血病或与 表达cd123的细胞相关的另一种癌的受试者或前述癌的动物模型中，相对于阴 性对照，本发明的表达car的细胞(例如，cd123 cart细胞或表达cd123 car 的nk细胞减少细胞和/或癌细胞的量、数目、数量或百分数至少25％、至少30％、 至少40％、至少50％、至少65％、至少75％、至少85％、至少95％、或至少99％。 在一个方面，受试者是人。
[0979]
本发明还提供用于预防、治疗和/或管理与表达cd123的细胞相关的疾病(例 如，表达cd123的血液癌症或非典型癌)的方法，所述方法包括：向有需求的受 试者施用与表达cd123的细胞结合的本发明表达car的细胞(例如，cd123cart细胞或表达cd123 car的nk细胞)。在一个方面，受试者是人。与表达 cd123的细胞相关的病症的非限制性例子包括自身免疫疾病(如狼疮)、炎性疾病 (如变态反应和哮喘)和癌症(如表达cd123的血液癌症或非典型癌)。
[0980]
本发明还提供用于预防、治疗和/或管理与表达cd123的细胞相关的疾病的 方法，所述方法包括：向有需求的受试者施用与表达cd123的细胞结合的本发 明表达car的细胞(例如，cd123 cart细胞或表达cd123 car的nk细胞)。在 一个方面，受试者是人。
[0981]
本发明提供用于防止与表达cd123的细胞相关的癌复发的方法，所述方法 包括：向有需求的受试者施用与表达cd123的细胞结合的本发明表达car的细 胞(例如，cd123 cart细胞或表达cd123 car的nk细胞)。在一个方面，该方 法包括与有效量的另一种治疗组合向有需求的受试者施用有效量的本文所述的 表达car的细胞(例如，cd123 cart细胞或表达cd123 car的nk细胞)，所述 细胞与表达cd123的细胞结合。
[0982]
骨髓消融术
[0983]
在一个方面，本发明提供了用于骨髓消融的组合物和方法。例如，在一个 方面，本发明提供了用于根除受试者中现有骨髓的至少一部分的组合物和方法。 本文描述了在某些情况下，包含本发明的cd123 car的cart123细胞根除 cd123阳性骨髓髓样祖细胞。
[0984]
在一个方面，本发明提供了一种骨髓消融的方法，该方法包括将本发明的 表达car的细胞(例如，cd123 cart细胞或表达cd123 car的nk细胞)施 用于需要骨髓消融的受试者。例如，本发明的方法可用于根除受试者的一些或 全部现有骨髓，所述受试者患有疾病或疾患，其中骨髓移植或骨髓修复是有益 的治疗策略。在一个方面，在骨髓移植之前在受试者中进行本发明的骨髓消融 方法，包括本文其他地方描述的施用表达car的细胞(例如，cd123 cart细 胞或表达cd123 car的nk细胞)。因此，在一个方面，本发明的方法提供了 在骨髓或干细胞移植之前的细胞调理方案。在一个方面，骨髓移植包括干细胞 的移植。骨髓移植可以包括自体或同种异体细胞的移植。
[0985]
本发明提供了治疗疾病或疾患的方法，该方法包括施用本发明的car表达 细胞(例如，cd123 cart细胞或表达cd123 car的nk细胞)，以根除至少 一部分现有骨髓。该方法可以用作治疗任何其中骨髓移植是有益的疾病或疾患 的至少一部分治疗方案。也就是说，本发明的方法可以用于需要骨髓移植的任 何受试者。在一个方面，包括施用表达car的细胞(例如，cd123 cart细胞 或表达cd123 car的nk细胞)的骨髓消融可用于治疗aml。在某些方面，通 过本发明方法的骨髓消融可用于治疗血液癌症、实体瘤、血液病、代谢紊乱、 hiv、htlv、溶酶体贮积病症和免疫缺陷。
[0986]
本文公开的组合物和方法可用于根除至少一部分现有骨髓以治疗血液癌 症，包括但不限于白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、all、aml、cll、cml、霍奇 金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、和多发性骨髓瘤。
[0987]
本文公开的组合物和方法可用于治疗血液疾病，包括但不限于脊髓发育不 良、贫血、阵发性夜间血红蛋白尿、再生障碍性贫血、获得性纯红细胞性贫血、 戴-布(diamon-blackfan)贫血、范可尼贫血、血细胞减少、巨核细胞性血小板减 少症、骨髓增生性疾病、真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、骨髓纤维 化、血红蛋白病、镰状细胞病、β地中海贫血症等。
[0988]
本文公开的组合物和方法可用于治疗溶酶体贮积病症，包括但不限于脂沉 积症、鞘磷脂沉积症、脑白质营养不良、粘多糖病、糖蛋白病、婴儿神经元蜡 样脂褐质病、詹-比(jansky-bielschowsky)病、尼曼-皮克病、戈谢病、肾上腺脑 白质营养不良、白细胞增多症、克拉伯病、赫尔勒综合征、沙伊综合征、赫尔 勒-舍伊综合征、猎人综合征、桑菲利波综合征、莫尔基奥综合征、马-拉 (maroteaux-lamy)综合征、斯来综合征、粘脂沉积症、岩藻糖脂病、天冬氨酰 葡萄糖尿、α-甘露糖苷病和沃尔曼病。
[0989]
本文公开的组合物和方法可用于治疗免疫缺陷，包括但不限于t细胞缺陷、 组合的t细胞和b细胞缺陷、吞噬细胞病症、免疫失调疾病、先天免疫缺陷、共 济失调毛细血管扩张症、迪乔治综合征、严重联合免疫缺陷(scid)、维-奥(wiskott-aldrich)综合征、科斯特曼综合征、施-戴(shwachman-diamond)综合 征、格里瑟里综合征和nf-κb必需调节物(nemo)缺陷。
[0990]
在一个方面，本发明提供了治疗癌症的方法，其包括骨髓调理，其中受试 者骨髓的至少一部分被表达car的细胞(例如，cd123 cart细胞或表达cd123car的nk细胞)根除。例如，在某些情况下，受试者的骨髓包含可被表达car 的细胞(例如，cd123 cart细胞或表达cd123 car的nk细胞)的活性靶向 和消除的恶性前体细胞。在一个方面，骨髓调理疗法包括在根除天然骨髓后向 受试者施用骨髓或干细胞移植物。在一个方面，骨髓修复疗法与一种或多种其 它抗癌疗法组合，包括但不限于抗肿瘤car疗法、化疗、放射等。
[0991]
在一个方面，在输注骨髓或干细胞移植之前可能需要根除已施用的表达 car的细胞(例如，cd123 cart细胞或表达cd123 car的nk细胞)。可以 使用任何合适的策略或治疗来完成表达car的细胞(例如，cd123 cart细胞 或表达cd123 car的nk细胞)的根除，包括但不限于使用自杀基因、使用rna 编码的car的有限car持续性、或包括抗体或化学疗法的抗t细胞模式。
[0992]
联合疗法
[0993]
本文所述的表达car的细胞可以与其他已知药物和疗法组合使用。如本文 所用，“组合”施用意指，在受试者罹患病症期间向受试者递送两种或更多种不 同治疗，例如，在受试者已经诊断患有该病症后并且在该病症已经治愈或消除 或治疗已经出于其他原因而停止之前，递送两种或更多种治疗。在一些实施方 案中，当开始递送第二治疗时，一种治疗的递送仍然正在进行，从而就施用而 言存在重叠。这有时在本文中称作“同时”或“同步递送”。在其他实施方案中， 一种治疗的递送在开始递送第二种治疗前结束。在任一种情况的一些实施方案 中，治疗因为联合施用而更有效。例如，第二治疗是更有效的，例如，在第二 治疗较少时观察到等同作用，或第二治疗减少症状到更大程度，大于如果第二 治疗在第一
治疗不存在时施用所见的程度、或采用第一治疗时观察到类似的情 况。在一些实施方案中，如此递送，从而与该病症相关的症状或其他参数的减 少大于一种治疗在另一种治疗不存在下递送情况下将会观察到的减少。两种治 疗药的效果可以部分加合、完全加合或超过加合。递送可以是这样的，从而当 递送第二治疗药时，仍然可检测第一治疗药的效果。
[0994]
本文所述的表达car的细胞和至少一种额外的治疗药可以在相同的组合物 中或在分立的组合物中同时施用或依次施用。对于依次施用，本文所述的表达 car的细胞可以首先施用并且额外的药物可以接着施用，或施用顺序可以相反。
[0995]
car疗法和/或其他治疗药、操作或模式可以在活动性疾病时间期间或在缓 解或活动度更小的疾病时间期间施用。car疗法可以在其他治疗前、与该治疗 同时、治疗后或在疾病缓解期间施用。
[0996]
当组合施用时，car疗法和额外的药物(例如，第二或第三药物)或前者全 部可以按这样的量或剂量施用，所述量或剂量高于、低于或等于单独(例如，作 为单药疗法)使用的每种药物的量或剂量。在某些实施方案中，car疗法、额外 的药物(例如，第二或第三药物)或前者全部的施用量或剂量比单独(例如，作为 单药疗法)使用的每种药物的量或剂量低(例如，低至少20％、至少30％、至少40％ 或至少50％)。在其他实施方案中，产生所需作用(例如，治疗癌症)的car治疗、 额外药物(例如，第二或第三药物)或前者全部的量或剂量比实现相同治疗作用所 需要的单独(例如，作为单药疗法)使用的每种药物的量或剂量低(例如，低至少 20％、至少30％、至少40％或至少50％)。
[0997]
在其他方面，本文所述的表达car的细胞可以用在治疗方案中与手术、细 胞因子、放射、或化疗如环磷酰胺、氟达拉滨、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、脱甲 基剂或肽疫苗(如izumoto等人,2008 j neurosurg 108:963-971中描述的那种)组 合使用。
[0998]
在某些情况下，本发明的化合物与其他治疗药如其他抗癌药、抗过敏药、 抗恶心药(或镇吐药)、镇痛药、细胞保护药及其组合来组合。
[0999]
在一个实施方案中，本文所述的表达car的细胞可以与化疗药组合使用。 示例性化疗药包括蒽环类(例如，多柔比星(例如，脂质体多柔比星))、长春碱类 生物碱(例如，长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨)、烷基化剂(例如，环 磷酰胺、达卡巴嗪、美法仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)、免疫细胞抗体(例如， alemtuzamab、吉妥珠单抗、利妥昔单抗、奥法木单抗(ofatumumab)、托西莫 单抗(tositumomab)、贝伦妥单抗(brentuximab))、抗代谢物(包括例如叶酸拮抗 剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂(例如，氟达拉滨))、mtor 抑制剂、tnfr糖皮质激素诱导的tnfr相关蛋白(gitr)激动剂；蛋白酶体抑制 剂(例如，阿克拉霉素a、胶霉毒素或硼替佐米)、免疫调节剂如沙立度胺或沙利 度胺衍生物(例如，来那度胺)。
[1000]
考虑用于联合疗法的一般化疗药包括阿那曲唑比卡鲁胺 硫酸博来霉素白消安白消安注射剂 卡培他滨n4-戊氧羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂 卡莫司汀苯丁酸氮芥顺铂克拉立滨环磷酰胺(或)、阿糖胞苷、嘧啶阿糖 甙
罗莫司汀链佐星和达卡巴嗪额外的示例性烷基化剂包括但不限于奥沙利铂替莫唑胺 (和)；更生霉素(dactinomycin)(也称作放线菌素-d、 )；美法仑(也称作l-pam、l-沙可来新和苯丙氨酸氮芥、)； 六甲蜜胺(altretamine)(也称作六甲基三聚氰胺(hmm)、)；卡莫司汀 苯达莫司汀白消安(和)；卡铂 罗莫司汀(也称作ccnu、)；顺铂(也称作cddp、 和-aq)；苯丁酸氮芥环磷酰胺(和 )；达卡巴嗪(也称作dtic、dic和咪唑甲酰胺、)；六甲 蜜胺(altretamine)(也称作六甲基三聚氰胺(hmm)、)；异环磷酰胺 prednumustine；丙卡巴肼二氯甲二乙胺(也称作氮芥、 氮氯嗪和盐酸氮芥、)；链佐星塞替派(也称作 thiophosphoamide、tespa和tspa、)；环磷酰胺)；环磷酰胺和苯达莫司汀hcl
[1005]
在实施方案中，将本文所述的表达car的细胞与氟达拉滨、环磷酰胺和/ 或利妥昔单抗组合施用至受试者。在实施方案中，将本文所述的表达car的细 胞与氟达拉滨、环磷酰胺和利妥昔单抗(fcr)组合施用至受试者。在实施方案中， 受试者患有cll。例如，受试者第17染色体短臂中具有缺失(del(17p)(例如，在 白血病细胞中)。在其他实例中，受试者没有del(17p)。在实施方案中，受试者 包含在免疫球蛋白重链可变区(igv
h
)基因中包含突变的白血病细胞。在其他实施 方案中，受试者不包含在免疫球蛋白重链可变区(igv
h
)基因中包含突变的白血病 细胞。在实施方案中，氟达拉滨按以下剂量施用：约10-50mg/m2(例如，约10-15、 15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45或45-50mg/m2)，例如，静脉内施用。 在实施方案中，环磷酰胺按以下剂量施用：约200-300mg/m2(例如，约200-225、 225-250、250-275、或275-300mg/m2)，例如，静脉内施用。在实施方案中，利 妥昔单抗按以下剂量施用：约400-600mg/m2(例如，400-450、450-500、500-550 或550-600mg/m2)，例如，静脉内施用。
[1006]
在实施方案中，将本文所述的表达car的细胞与苯达莫司汀和利妥昔单抗 组合施用至受试者。在实施方案中，受试者患有cll。例如，受试者第17染色 体短臂中具有缺失(del(17p)(例如，在白血病细胞中)。在其他实例中，受试者没 有del(17p)。在实施方案中，受试者包含在免疫球蛋白重链可变区(igv
h
)基因中 包含突变的白血病细胞。在其他实施方案中，受试者不包含在免疫球蛋白重链 可变区(igv
h
)基因中包含突变的白血病细胞。在实施方案中，苯达莫司汀按以下 剂量施用：约70-110mg/m2(例如，70-80、80-90、90-100或100-110mg/m2)，例 如，静脉内施用。在实施方案中，利妥昔单抗按以下剂量施用：约400-600 mg/m2(例如，400-450、450-500、500-550或550-600mg/m2)，例如，静脉内施用。
[1007]
在实施方案中，将本文所述的表达car的细胞与利妥昔单抗、环磷酰胺、 多柔比星、长春新碱和/或皮质类固醇(例如，泼尼松)组合施用至受试者。在实 施方案中，将本文所述的表达car的细胞与利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星、 长春新碱和泼尼松(r-chop)组
合施用至受试者。在实施方案中，受试者患有弥 漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)。在实施方案中，受试者具有非大型局限阶段 dlbcl(例如，包括患有小于7cm大小/直径的肿瘤)。在实施方案中，受试者用 与r-chop组合的照射治疗。例如，向受试者施用r-chop(例如，1-6个周期， 例如，1、2、3、4、5或6个周期的r-chop)，随后照射。在一些情况下，在照 射后向受试者施用r-chop(例如，1-6个周期，例如，1、2、3、4、5或6个周期 的r-chop)。
[1008]
在实施方案中，将本文所述的表达car的细胞与依托泊苷、泼尼松、长春 新碱、环磷酰胺、多柔比星和/或利妥昔单抗组合施用至受试者。在实施方案中， 将本文所述的表达car的细胞与依托泊苷、泼尼松、长春新碱、环磷酰胺、多 柔比星和利妥昔单抗(epoch-r)组合施用至受试者。在实施方案中，将本文所 述的表达car的细胞与调整剂量的epoch-r(da-epoch-r)组合施用至受试 者。在实施方案中，受试者患有b细胞淋巴瘤，例如，myc-重排的侵袭性b细胞 淋巴瘤。
[1009]
在实施方案中，将本文所述的表达car的细胞与利妥昔单抗和/或来那度胺 组合施用至受试者。来那度胺((rs)-3-(4-氨基-1-氧代1,3-二氢-2h-异吲哚-2-基) 哌啶-2,6-二酮)是免疫调节剂。在实施方案中，将本文所述的表达car的细胞与 利妥昔单抗和来那度胺组合施用至受试者。在实施方案中，受试者患有滤泡淋 巴瘤(fl)或套细胞淋巴瘤(mcl)。在实施方案中，受试者患有fl并且先前尚未 用癌疗法治疗过。在实施方案中，来那度胺按以下剂量施用：约10-20mg(例如， 10-15或15-20mg)，例如，每日一次。在实施方案中，利妥昔单抗按以下剂量施 用：约350-550mg/m2(例如，350-375、375-400、400-425、425-450、450-475、 或475-500mg/m2)，例如，静脉内施用。
[1010]
示例性mtor抑制剂例如包括坦罗莫司；地磷莫司(正式地称作 deferolimus，(1r,2r,4s)-4-[(2r)-2[(1r,9s,12s,15r,16e,18r,19r,21r,23s,24e, 26e,28z,30s,32s,35r)-1,18-二羟-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基
ꢀ-
2,3,10,14,20-五氧代-11,36-二氧杂-4-氮杂三环并[30.3.1.0
4,9
]三十七碳
ꢀ-
16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧环己基二甲基次膦酸酯，也称作ap23573 和mk8669，并且在pct公开号wo 03/064383中描述)；依维莫司(或 rad001)；雷帕霉素(ay22989，)；simapimod(cas164301-51-3)； emsirolimus，(5-{2,4-双[(3s)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧苯 基)甲醇(azd8055)；2-氨基-8-[反-4-(2-羟乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶 基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8h)-酮(pf04691502，cas1013101-36-4)；和 n
2-[1,4-二氧待-[[4-(4-氧代-8-苯基-4h-1-苯并吡喃-2基)吗啉鎓-4-基]甲氧基]丁 基]-l-精氨酰甘氨酰-l-α-天冬氨酰l-丝氨酸(seq id no:378)，内盐(sf1126， cas936487-67-1)和xl765。
[1011]
示例性免疫调节剂例如包括阿夫土珠单抗(afutuzumab)(从可获 得))；peg化非格司亭来那度胺(cc-5013、雷利米得)； 沙立度胺actimid(cc4047)；和irx-2(包含白介素1、白介素2和 干扰素γ的人细胞因子的混合物，cas951209-71-5，从irx therapeutics可获得)。
[1012]
示例性蒽环类例如包括多柔比星(阿霉素和)；博来霉素 佐柔比星(盐酸佐柔比星、柔红霉素和盐酸红比霉素(rubidomycin)、 )；脂质体佐柔比星(柠檬酸佐柔比星脂质体、)；米托 蒽醌
(dhad、)；表柔比星(ellence
tm
)；伊达比星( idamycin)；丝裂霉素c格尔德霉素；除莠霉素；近灰霉 素(ravidomycin)；和去乙酰近灰霉素(desacetylravidomycin)。
[1013]
示例性长春碱类生物碱例如包括酒石酸长春瑞滨长春新碱 和长春地辛)；长春碱(也称作硫酸长春碱、长春花碱和 vlb、和)；和长春瑞滨
[1014]
示例性蛋白酶体抑制剂包括硼替佐米卡非佐米(px-171-007、 (s)-4-甲基-n-((s)-1-(((s)-4-甲基-1-((r)-2-甲基环氧乙烷-2-基)-1-氧代戊-2-基)氨 基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-2-((s)-2-(2-吗啉代)-4-苯基丁酰氨基)-戊酰胺)； marizomib(npi-0052)；枸橼酸艾沙佐米(ixazomib citrate)(mln-9708)； delanzomib(cep-18770)；和o-甲基-n-[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-l-丝氨酰-o-甲 基-n-[(1s)-2-[(2r)-2-甲基-2-环氧乙烷基]-2-氧代-1-(苯基甲基)乙基-l-丝氨酰胺 (onx-0912)。
[1015]
在实施方案中，将本文所述的表达car的细胞与贝伦妥单抗(brentuximab) 组合施用至受试者。贝伦妥单抗是抗cd30抗体和单甲基澳瑞司他汀e的抗体-药 物缀合物。在实施方案中，受试者患有霍奇金淋巴瘤(hl)，例如，复发性或难 治性hl。在实施方案中，受试者包含cd30+hl。在实施方案中，受试者已经 接受过自体干细胞移植(asct)。在实施方案中，受试者尚未接受asct。在实 施方案中，贝伦妥单抗按以下剂量施用：约1-3mg/kg(例如，约1-1.5、1.5-2、2-2.5、 或2.5-3mg/kg)，例如，静脉内施用，例如，每3周施用一次。
[1016]
在实施方案中，将本文所述的表达car的细胞与贝伦妥单抗和达卡巴嗪组 合或与贝伦妥单抗和苯达莫司汀组合施用至受试者。达卡巴嗪是化学名称为 5-(3,3-二甲基-1-三氮烯基)咪唑-4-甲酰胺的烷基化剂。苯达莫司汀是化学名称为 4-[5-[双(2-氯乙基)氨基]-1-甲基苯并咪唑-2-基]丁酸的烷基化剂。在实施方案中， 受试者患有霍奇金淋巴瘤(hl)。在实施方案中，受试者先前尚未用癌疗法治疗 过。在实施方案中，受试者是至少60岁，例如，60、65、70、75、80、85岁或 更老。在实施方案中，达卡巴嗪按以下剂量施用：约300-450mg/m2(例如，约 300-325、325-350、350-375、375-400、400-425或425-450mg/m2)，例如，静脉 内施用。在实施方案中，苯达莫司汀按以下剂量施用：约75-125mg/m2(例如， 75-100或100-125mg/m2，例如，约90mg/m2)，例如，静脉内施用。在实施方案 中，贝伦妥单抗按以下剂量施用：约1-3mg/kg(例如，约1-1.5、1.5-2、2-2.5、 或2.5-3mg/kg)，例如，静脉内施用，例如，每3周施用一次。
[1017]
在一些实施方案中，将本文所述的表达car的细胞与cd20抑制剂，例如， 抗cd20抗体(例如，抗cd20特异性抗体或双特异性抗体)或其片段组合施用至受 试者。示例性抗cd20抗体包括但不限于利妥昔单抗、奥法木单抗、奥瑞珠单抗 (ocrelizumab)、维妥珠单抗、obinutuzumab、tru-015(trubionpharmaceuticals)、ocaratuzumab和pro131921(genentech)。参见，例如，lim 等人,haematologica.95.1(2010):135-43。
[1018]
在一些实施方案中，抗cd20抗体包括利妥昔单抗。利妥昔单抗是与cd20 结合和造成cd20表达细胞的细胞裂解的嵌合小鼠/人单克隆抗体igg1κ，例如， 如www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s5311lbl.pdf中所 述。
在实施方案中，将本文所述的表达car的细胞与利妥昔单抗组合施用至受 试者。在实施方案中，受试者患有cll或sll。
[1019]
在一些实施方案中，将利妥昔单抗静脉内施用，例如，作为静脉内输注施 用。例如，每次输注提供约500-2000mg(例如，约500-550、550-600、600-650、 650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1100、 1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、 1800-1900、或1900-2000mg)利妥昔单抗。在一些实施方案中，利妥昔单抗按以 下剂量施用：150mg/m2至750mg/m2，例如，约150-175mg/m2、175-200mg/m2、 200-225mg/m2、225-250mg/m2、250-300mg/m2、300-325mg/m2、325-350mg/m2、 350-375mg/m2、375-400mg/m2、400-425mg/m2、425-450mg/m2、450-475mg/m2、 475-500mg/m2、500-525mg/m2、525-550mg/m2、550-575mg/m2、575-600mg/m2、 600-625mg/m2、625-650mg/m2、650-675mg/m2或675-700mg/m2，其中m2表示 受试者的体表面积。在一些实施方案中，利妥昔单抗按至少4天(例如，4、7、 14、21、28、35天或更长)的给药间隔施用。例如，利妥昔单抗按至少0.5周(例 如，0.5、1、2、3、4、5、6、7、8周或更长)的给药间隔施用。在一些实施方案 中，利妥昔单抗按本文所述的剂量和给药间隔施用一段时间，例如，至少2周， 例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20周或更长时间。例如，利妥昔单抗按本文所述的剂量和给药间隔施用每 个治疗周期总计至少4个剂量(例如，每个治疗周期至少4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16个或更多个剂量)。
[1020]
在一些实施方案中，抗cd20抗体包含奥法木单抗。奥法木单抗是分子量大 约149kda的抗cd20igg1κ人单克隆抗体。例如，奥法木单抗使用转基因小鼠 和杂交瘤技术生成并且从重组鼠细胞系(ns0)表达及纯化。参见，例如， www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2009/125326lbl.pdf；和临床试验 识别号nct01363128、nct01515176、nct01626352和nct01397591。在实施 方案中，将本文所述的表达car的细胞与奥法木单抗组合施用至受试者。在实 施方案中，受试者患有cll或sll。
[1021]
在一些实施方案中，将奥法木单抗作为静脉内输注施用。例如，每次输注 提供约150-3000mg(例如，约150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、 400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、 800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1200、1200-1400、1400-1600、 1600-1800、1800-2000、2000-2200、2200-2400、2400-2600、2600-2800或2800-3000 mg)奥法木单抗。在实施方案中，奥法木单抗按起始剂量约300mg、随后2000mg 施用，例如，施用约11个剂量，例如，施用24周。在一些实施方案中，奥法木 单抗按至少4天(例如，4、7、14、21、28、35天或更长)的给药间隔施用。例如， 奥法木单抗按以下给药间隔施用：至少1周，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、24、26、28、20、22、24、26、28、30周或更长时间。在一些 实施方案中，奥法木单抗抗按本文所述的剂量和给药间隔施用一段时间，例如， 至少1周，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、22、24、26、28、30、40、50、60周或更长时间，或1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更长时间，或1、2、3、4、5年或更长时 间。例如，奥法木单抗按本文所述的剂量和给药间隔施用每个治疗周期总计至 少2个剂量(例如，每个治疗周期至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、18、20个或更多个剂量)。
[1022]
在一些情况下，抗cd20抗体包括奥瑞珠单抗。奥瑞珠单抗是人源化抗cd20 单克隆抗体，例如，如临床试验识别号nct00077870、nct01412333、 nct00779220、nct00673920、
nct01194570和kappos等人,lancet. 19.378(2011):1779-87中所述。
[1023]
在一些情况下，抗cd20抗体包括维妥珠单抗。维妥珠单抗是针对cd20的 人源化单克隆抗体。参见，例如，临床试验识别号nct00547066、nct00546793、 nct01101581和goldenberg等人,leuk lymphoma.51(5)(2010):747-55。
[1024]
在一些情况下，抗cd20抗体包括ga101。ga101(也称作obinutuzumab或 ro5072759)是人源化和糖工程化的抗cd20单克隆抗体。参见，例如，robak. curr.opin.investig.drugs.10.6(2009):588-96：588-96；临床试验识别号：nct01995669、nct01889797、nct02229422和nct01414205；和 www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.pdf。
[1025]
在一些情况下，抗cd20抗体包括ame-133v。ame-133v(也称作ly2469298 或ocaratuzumab)是针对的cd20的人源化igg1单克隆抗体，与利妥昔单抗相比， 所述单克隆抗体具有增加的fcγriiia受体亲和力和增强的抗体依赖性细胞毒作 用(adcc)活性。参见，例如，robak等人,biodrugs 25.1(2011):13-25；和 forero-torres等人,clin cancer res.18.5(2012):1395-403。
[1026]
在一些情况下，抗cd20抗体包括pro131921。pro131921是与利妥昔单抗 相比，经工程化以具有更好的fcγriiia结合作用和增强的adcc的人源化抗 cd20单克隆抗体。参见，例如，robak等人,biodrugs 25.1(2011):13-25；和casulo 等人,clin immunol.154.1(2014):37-46；和临床试验识别号nct00452127。
[1027]
在一些情况下，抗cd20抗体包括tru-015。tru-015是从针对cd20的抗体 的结构域衍生的抗cd20融合蛋白。tru-015比单克隆抗体小，但是保留fc介导 的效应子功能。参见，例如，robak等人,biodrugs 25.1(2011):13-25。tru-015 含有与人igg1铰链区连接的抗cd20单链可变片段(scfv)、ch2和ch3结构域， 但是缺少ch1结构域和cl结构域。
[1028]
在一些实施方案中，本文所述的抗cd20抗体缀合于或结合至治疗药，例如， 本文所述的化疗药(例如，环磷氮芥、氟达拉滨、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、去甲 基化剂、肽疫苗、抗肿瘤抗生素、酪氨酸激酶抑制剂、烷基化剂、抗微管或抗 有丝分裂剂)、抗过敏药、抗恶心药(或镇吐药)、止疼药或细胞保护药。
[1029]
在实施方案中，将本文所述的表达car的细胞与b细胞淋巴瘤2(bcl-2)抑制剂 (例如，venetoclax，也称作abt-199或gdc-0199)和/或利妥昔单抗组合施用至 受试者。在实施方案中，将本文所述的表达car的细胞与venetoclax和利妥昔单 抗组合施用至受试者。venetoclax是抑制抗凋亡蛋白bcl-2的小分子。下文显示 venetoclax(4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4.4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-n-({3
-ꢀ
硝基-4-[(四氢-2h-吡喃-4-基甲基)氨基]苯基}磺酰基)-2-(1h-吡咯并[2,3-b]吡啶
ꢀ-
5-基氧)苯甲酰胺)的结构。
[1030][1031]
在实施方案中，受试者患有cll。在实施方案中，受试者患有复发性cll， 例如，先前已经向受试者施用癌疗法。在实施方案中，venetoclax按以下剂量施 用：约15-600mg(例如，15-20、20-50、50-75、75-100、100-200、200-300、300-400、 400-500或500-600mg)，例如，每日一次施用。在实施方案中，利妥昔单抗按以 下剂量施用：约350-550mg/m2(例如，350-375、375-400、400-425、425-450、 450-475、或475-500mg/m2)，例如，静脉内施用，例如，每月一次施用。
[1032]
在一些实施方案中，将本文所述的表达car的细胞与溶瘤性病毒组合施用。 在实施方案中，溶瘤性病毒能够在癌细胞中选择性复制并且触发癌细胞死亡或 延缓其生长。在一些情况下，溶瘤性病毒对非癌细胞无影响或影响最小。溶瘤 性病毒包括但不限于溶瘤性腺病毒、溶瘤性单纯疱疹病毒、溶瘤性逆转录病毒、 溶瘤性细小病毒、溶瘤性痘苗病毒、溶瘤性辛德比斯病毒、溶瘤性流感病毒、 或溶瘤性rna病毒(例如，溶瘤性呼肠孤病毒、溶瘤性新城疫病毒(ndv)，溶瘤 性麻疹病毒或溶瘤性水泡性口炎病毒(vsv))。
[1033]
在一些实施方案中，溶瘤性病毒是us2010/0178684 a1中描述的病毒，例如， 重组溶瘤性病毒，所述文献通过引用的方式完整并入本文。在一些实施方案中， 重组溶瘤性病毒包含编码免疫应答或炎症反应抑制剂的核酸序列(例如，异源核 酸序列)，例如，如us2010/0178684 a1中所述，所述文献通过引用的方式完整 并入本文。在实施方案中，重组溶瘤性病毒，例如，溶瘤性nd，包含促凋亡蛋 白(例如，凋亡素)、细胞因子(例如，gm-csf、干扰素-γ、白介素-2(il-2)、肿 瘤坏死因子-α)、免疫球蛋白(例如，针对ed-b纤连蛋白的抗体)、肿瘤相关抗原、 双特异性衔接头蛋白(例如，针对ndv hn蛋白和t细胞共刺激受体，如cd3或 cd28的双特异性抗体或抗体片段；或人il-2和针对ndv hn蛋白的单链抗体之 间的融合蛋白)。参见，例如，zamarin等人,future microbiol.7.3(2012):347-67， 所述文献通过引用的方式完整并入本文。在一些实施方案中，溶瘤性病毒是us8591881 b2、us 2012/0122185 a1或us 2014/0271677 a1中描述的嵌合溶瘤性 ndv，所述文献各自通过引用的方式并入本文完整地。
[1034]
在一些实施方案中，溶瘤性病毒包含条件复制型腺病毒(cra)，其设计成 完全在癌细胞中复制。参见，例如，alemany等人,nature biotechnol. 18(2000):723-27。在一些实施方案中，溶瘤性腺病毒包括在alemany等人的第725 页上的表1中描述的那种，所述文献通过引用的方式完整并入本文。
[1035]
示例性溶瘤性病毒包括但不限于以下病毒：
[1036]
组b溶瘤性腺病毒(coload1)(psioxus therapeutics ltd.)(参见，例如，临 床试验识别号：nct02053220)；
[1037]
oncos-102(以前称为cgtg-102)，其是包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因 子(gm-csf)的腺病毒(oncos therapeutics)(参见，例如，临床试验识别号： nct01598129)；
[1038]
vcn-01，其是编码人ph20透明质酸酶的基因修饰型溶瘤性人腺病毒(vcn biosciences,s.l.)(参见，例如，临床试验识别号：nct02045602和 nct02045589)；
[1039]
条件复制型腺病毒icovir-5，其是从野生型人腺病毒血清型5(had5)衍生 病毒，已经被修饰成在癌细胞中选择性复制，具有失调节的视网膜母细胞瘤/e2f 途径(institut catal
à
d'oncologia)(参见，例如，临床试验识别号： nct01864759)；
[1040]
celyvir，其包含经溶瘤性腺病毒icovir5感染的骨髓衍生的自体间充质 干细胞(msc)(hospital infantil universitariojes
ú
s,madrid,spain/ramon alemany)(参见，例如，临床试验识别号：nct01844661)；
[1041]
cg0070，其是条件复制型溶瘤性血清型5腺病毒(ad5)，其中人e2f-1启 动子驱动必需e1α病毒基因的表达，因而限制病毒复制和对rb途径-缺陷肿瘤 细胞的细胞毒性(cold genesys,inc.)(参见，例如，临床试验识别号： nct02143804)；或
[1042]
dnx-2401(以前称为δ-24-rgd)，其是这样的腺病毒，所述腺病毒已经过 工程化以在视网膜母细胞瘤(rb)途径缺陷性细胞中选择性复制并更高效地感染 表达某些rgd结合性整联蛋白的细胞(clinica universidad de navarra, universidad de navarra/dnatrix,inc.)(参见，例如，临床试验识别号： nct01956734)。
[1043]
在一些实施方案中，将本文所述的溶瘤性病毒通过注射，例如皮下、动脉 内、静脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射施用。在实施方案中，将本文所述的溶 瘤性病毒按瘤内、经皮、经粘膜、口服、鼻内方式或通过肺施用法施用。
[1044]
在一个实施方案中，将本文所述的表达car的细胞与减少treg细胞群体的 分子组合施用至受试者。减少treg细胞数目(例如，消耗treg细胞)的方法是本领 域已知的并且包括例如cd25消耗法、施用环磷酰胺、调节gitr功能。不希望 受理论约束，认为在单采血液成分术之前或在施用本文所述的表达car的细胞 之前，减少受试者中treg细胞的数目减少了肿瘤微环境中不想要的免疫细胞(例 如，treg)的数目并降低受试者的复发风险。
[1045]
在一个实施方案中，将本文所述的表达car的细胞与靶向gitr和/或调节 gitr功能的分子组合施用至受试者，其中所述靶向gitr和/或调节gitr功能 的分子是例如gitr激动剂和/或消耗调节性t细胞(treg)的gitr抗体。在实施方 案中，将本文所述的表达car的细胞与环磷酰胺组合施用至受试者。在一个实 施方案中，将gitr结合分子和/或调节gitr功能的分子(例如，gitr激动剂和/ 或消耗treg的gitr抗体)在施用表达car的细胞之前施用。例如，在一个实施 方案中，gitr激动剂可以在细胞的单采血液成分术之前施用。在实施方案中， 将环磷酰胺在施用(例如，输注或回输)表达car的细胞之前或在细胞的单采血 液成分术之前施用至受试者。在实施方案中，将环磷酰胺和抗gitr抗体在施用 (例如，输注或回输)表达car的细胞之前或在细胞的单采血液成分术之前施用 至受试者。在一个实施方案中，受试者患有癌症(例如，实体癌或血液癌症如all 或cll)。在一个实施方案中，受试者患有cll。在实施方案中，受试者患有all。 在实施方案中，受试者患有实体癌，例如，本文所述的实体癌。示例性gitr激 动物例如包括gitr融合蛋白和抗gitr抗体(例如，双价抗gitr抗体)，如，例 如，以下文献中描述的gitr融合蛋白；美国专利号6,111,090、欧洲专利号090505b1、美国专利号8,586,023、pct公开号wo 2010/003118和2011/090754， 或例如以下
文献中描述的抗gitr抗体：美国专利号7,025,962、欧洲专利号 1947183b1、美国专利号7,812,135、美国专利号8,388,967、美国专利号8,591,886、 欧洲专利号ep 1866339、pct公开号wo 2011/028683、pct公开号wo2013/039954、pct公开号wo 2005/007190、pct公开号wo 2007/133822、pct 公开号wo 2005/055808、pct公开号wo 99/40196、pct公开号wo2001/03720、pct公开号wo 99/20758、pct公开号wo 2006/083289、pct公 开号wo 2005/115451、美国专利号7,618,632和pct公开号wo 2011/051726。
[1046]
在一个实施方案中，本文所述的表达car的细胞与gitr激动剂(例如，本 文所述的gitr激动剂)组合施用至受试者。在一个实施方案中，将gitr激动剂 在表达car的细胞之前施用。例如，在一个实施方案中，gitr激动剂可以在细 胞的单采血液成分术之前施用。
[1047]
在一个实施方案中，将本文所述的表达car的细胞与mtor抑制剂(例如， 本文所述的mtor抑制剂，例如，雷帕霉素类似物(rapalog)如依维莫司)组合施 用至受试者。在一个实施方案中，将mtor抑制剂在表达car的细胞之前施用。 例如，在一个实施方案中，mtor抑制剂可以在细胞的单采血液成分术之前施 用。
[1048]
在一个实施方案中，将本文所述的表达car的细胞与蛋白质酪氨酸磷酸酶 抑制剂(例如，本文所述的蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂)组合施用至受试者。在一 个实施方案中，蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂是shp-1抑制剂，例如，本文所述的 shp-1抑制剂，如，例如，葡萄糖酸锑盐。在一个实施方案中，蛋白质酪氨酸磷 酸酶抑制剂是shp-2抑制剂。
[1049]
在一个实施方案中，本文所述的表达car的细胞可以与激酶抑制剂组合使 用。在一个实施方案中，激酶抑制剂是cdk4抑制剂(例如，本文所述的cdk4 抑制剂，例如，cd4/6抑制剂，如，例如，6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪
ꢀ-
1-基-吡啶-2-基氨基)-8h-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮盐酸盐(也称作帕布昔利布或 pd0332991)。在一个实施方案中，激酶抑制剂是btk抑制剂，例如，本文所述 的btk抑制剂，如，例如，依鲁替尼。在一个实施方案中，激酶抑制剂是mtor 抑制剂，例如，本文所述的mtor抑制剂，如，例如，雷帕霉素、雷帕霉素类 似物、osi-027。mtor抑制剂可以例如是mtorc1抑制剂和/或mtorc2抑制 剂，例如，本文所述的mtorc1抑制剂和/或mtorc2抑制剂。在一个实施方案 中，激酶抑制剂是mnk抑制剂，例如，本文所述的mnk抑制剂，如，例如， 4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。mnk抑制剂可以例如是mnk1a、 mnk1b、mnk2a和/或mnk2b抑制剂。在一个实施方案中，激酶抑制剂是dgk 抑制剂，例如，本文所述的dgk抑制剂，如，例如，dgkinh1(d5919)或dgkinh2 (d5794)。在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自以下的cdk4抑制剂：aloisinea；夫拉平度(flavopiridol)或hmr-1275、2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(3s,4r)-3
-ꢀ
羟-1-甲基-4-哌啶基]-4-色烯酮；克里唑替尼(pf-02341066)；2-(2-氯苯基)-5,7-二 羟基-8-[(2r,3s)-2-(羟甲基)-1-甲基-3-吡咯烷基]-4h-1-苯并吡喃-4-酮，盐酸盐 (p276-00)；1-甲基-5-[[2-[5-(三氟甲基)-1h-咪唑-2-基]-4-吡啶基]氧]-n-[4-(三氟甲 基)苯基]-1h-苯并咪唑-2-胺(raf265)；indisulam(e7070)；roscovitine (cyc202)；帕布昔利布(pd0332991)；dinaciclib(sch727965)；n-[5-[[(5-叔丁 基唑-2-基)甲基]硫代]噻唑-2-基]哌啶-4-甲酰胺(bms387032)；4-[[9-氯-7-(2,6
-ꢀ
二氟苯基)-5h-嘧啶并[5,4-d][2]苯并吖庚因-2-基]氨基]-苯甲酸(mln8054)； 5-[3-(4,6-二氟-1h-苯并咪唑-2-基)-1h-吲唑-5-基]-n-乙基-4-甲基-3-吡啶甲胺 (ag-024322)；4-(2,6-二氯苯甲酰氨基)-1h-吡唑-3-羧酸n-(哌啶-4-基)酰胺 (at7519)；4-[2-甲基-1-(1-甲基乙基)-1h-咪唑-5-基]-n-[4-(甲磺酰基)
苯基]-2-嘧 啶胺(azd5438)和xl281(bms908662)。
[1050]
在一个实施方案中，激酶抑制剂是cdk4抑制剂，例如，帕布昔利布 (palbociclib)(pd0332991)，并且帕布昔利布以约50mg、60mg、70mg、75mg、 80mg、90mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、 135mg(例如，75mg、100mg或125mg)的剂量每日施用一段时间，例如，每日 施用持续28天周期的14-21天，或每日施用持续21天周期的7-12天。在一个实施 方案中，施用1、2、3、4、5，6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的帕布昔 利布。
[1051]
在实施方案中，将本文所述的表达car的细胞与细胞周期蛋白依赖性激酶 (cdk)4或6抑制剂(例如，本文所述的cdk4抑制剂或cdk6抑制剂)组合施用至 受试者。在实施方案中，将本文所述的表达car的细胞与cdk4/6抑制剂(例如， 靶向cdk4和cdk6二者的抑制剂)(例如，本文所述的cdk4/6抑制剂)组合施用 至受试者。在一个实施方案中，受试者患有mcl。mcl是对目前可用疗法响应 不良(即，基本上不可治愈)的侵袭性癌症。在许多mcl病例中，细胞周期蛋白 d1(cdk4/6的调节蛋白)在mcl细胞中表达(例如，归因于涉及免疫球蛋白基因 和细胞周期蛋白d1基因的染色体易位)。因此，在不受理论约束的情况下，认为 mcl细胞对cdk4/6抑制作用高度敏感，特异性高(即，对正常免疫细胞的影响 最小)。cdk4/6抑制剂单独具有治疗mcl的一些功效，但是仅实现部分缓解， 复发率高。示例性cdk4/6抑制剂是下文显示其结构的lee011(也称作 ribociclib)。
[1052][1053]
不受理论约束，认为联合cdk4/6抑制剂(例如，本文所述的lee011或其他 cdk4/6抑制剂)施用本文所述的表达car的细胞可以实现更高的反应性，例如， 与仅施用cdk4/6抑制剂相比，例如，缓解率更高和/或复发率更低。
[1054]
在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自以下的btk抑制剂：依鲁替尼 (pci-32765)；gdc-0834；rn-486；cgi-560；cgi-1764；hm-71224；cc-292； ono-4059；cnx-774；和lfm-a13。在一个优选实施方案中，btk抑制剂不 减少或不抑制白介素-2诱导型激酶(itk)的激酶活性，并且选自gdc-0834； rn-486；cgi-560；cgi-1764；hm-71224；cc-292；ono-4059；cnx-774； 和lfm-a13。
[1055]
在一个实施方案中，激酶抑制剂是btk抑制剂，例如，依鲁替尼 (pci-32765)。在实施方案中，将本文所述的表达car的细胞与btk抑制剂(例 如，依鲁替尼)组合施用至受试者。在实施方案中，将本文所述的表达car的细 胞与依鲁替尼(也称作pci-32765)组合施用至受试者。下文显示依鲁替尼(1-[(3r)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基]丙-2
-ꢀ
烯-1-酮)的结构。
[1056]
ch＝ch-；或-ch2-ch2-ch2-；
[1067]
r6和r7彼此独立地代表h、任选地被羟基取代的c1-c6烷基、任选地被卤 素或羟基取代的c3-c6环烷基或卤素；
[1068]
r8、r9、r，r’，r10和r11彼此独立地代表h或任选地被c1-c6烷氧基取 代的c1-c6烷基；或r8、r9、r、r’、r10和r11的任意两者连同与它们结合的 碳原子可以形成3
–
6元饱和碳环；
[1069]
r12是氢或任选地被卤素或c1-c6烷氧基取代的c1-c6烷基；
[1070]
或r12和以下任一者：r8、r9、r、r’、r10或r11连同与它们结合的原子 可以形成4、5、6或7元氮杂环，所述环可以任选地被卤素、氰基、羟基、c1-c6 烷基或c1-c6烷氧基取代；
[1071]
n是0或1；并且
[1072]
r13是任选地被c1-c6烷基、c1-c6烷氧基或n,n-二-c1-c6烷氨基取代的 c2-c6链烯基；任选地被c1-c6烷基或c1-c6烷氧基取代的c2-c6炔基；或任选 地被c1-c6烷基取代的氧化c2-c6烯(c2-c6alkylenyl oxide)。
[1073]
在一些实施方案中，式i的btk抑制剂选自：n-(3-(5-((1-丙烯酰氧吖丁啶-3
-ꢀ
基)氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺； ((e)-n-(3-(6-氨基-5-((1-(丁-2-烯酰)吖丁啶-3-基)氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯 基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；n-(3-(6-氨基-5-((1-丙炔酰吖丁啶-3-基)氧基)嘧啶-4
-ꢀ
基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；n-(3-(6-氨基-5-((1-(丁-2-炔酰吖 丁啶-3-基)氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺； n-(3-(5-((1-丙烯酰氧哌啶-4-基)氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙 基-2-氟苯甲酰胺；n-(3-(6-氨基-5-(2-(n-甲基丙烯酰氨基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5
-ꢀ
氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；((e)-n-(3-(6-氨基-5-(2-(n-甲基丁-2-烯 氨基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；n-(3-(6-氨基
ꢀ-
5-(2-(n-甲基丙炔氨基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲 酰胺；((e)-n-(3-(6-氨基-5-(2-(4-甲氧基-n-甲基丁-2-烯氨基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5
-ꢀ
氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；n-(3-(6-氨基-5-(2-(n-甲基丁-2-炔氨基) 乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；n-(2-((4-氨基
ꢀ-
6-(3-(4-环丙基-2-氟苯甲酰胺)-5-氟-2-甲基苯基)嘧啶-5-基)氧基)乙基)-n-甲基环 氧乙烷-2-甲酰胺；n-(2-((4-氨基-6-(3-(6-环丙基-8-氟-1-氧代异喹啉-2(1h)-基)苯 基)嘧啶-5-基)氧基)乙基)-n-甲基丙烯酰胺；n-(3-(5-(2-丙烯酰胺乙氧基)-6-氨基 嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；n-(3-(6-氨基-5-(2-(n-乙基 丙烯酰胺)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；n-(3-(6
-ꢀ
氨基-5-(2-(n-(2-氟乙基)丙烯酰胺)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基
ꢀ-
2-氟苯甲酰胺；n-(3-(5-((1-丙烯酰胺环丙基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2
-ꢀ
甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；((s)-n-(3-(5-(2-丙烯酰胺丙氧基)-6-氨基嘧啶
ꢀ-
4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；((s)-n-(3-(6-氨基-5-(2-(丁-2
-ꢀ
炔氨基)丙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺； ((s)-n-(3-(6-氨基-5-(2-(n-甲基丙烯酰氨基)丙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯 基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；((s)-n-(3-(6-氨基-5-(2-(n-甲基丁-2-炔氨基)丙氧基) 嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；n-(3-(6-氨
二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯 基-4h-1-苯并吡喃-2-基)吗啉鎓-4-基]]甲氧基]丁基]-l-精氨酰甘氨酰-l-α-天冬 氨酰l-丝氨酸-(seq id no:706)，内盐(sf1126)；和xl765。
[1076]
在一个实施方案中，激酶抑制剂是mtor抑制剂，例如，雷帕霉素，并且 雷帕霉素以约3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg(例如，6mg) 的剂量每日施用一段时间，例如，每日施用持续21天周期，或每日施用持续28 天周期。在一个实施方案中，施用1、2、3、4、5，6、7、8、9、10、11、12或 更多个周期的雷帕霉素。在一个实施方案中，激酶抑制剂是mtor抑制剂，例 如，依维莫司，并且依维莫司以约2mg、2.5mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7 mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg(例如，10mg) 的剂量每日施用一段时间，例如，每日施用持续28天周期。在一个实施方案中， 施用1、2、3、4、5，6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的依维莫司。
[1077]
在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自以下的mnk抑制剂：cgp052088； 4-氨基-3-(对-氟苯基氨基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶(cgp57380)；尾孢酰胺； etc-1780445-2；和4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。
[1078]
在实施方案中，将本文所述的表达car的细胞与磷脂酰肌醇3-激酶(pi3k) 抑制剂(例如，本文所述的pi3k抑制剂，例如，吉利德(idelalisib)或duvelisib)和/ 或利妥昔单抗组合施用至受试者。在实施方案中，将本文所述的表达car的细 胞与吉利德和利妥昔单抗组合施用至受试者。在实施方案中，将本文所述的表 达car的细胞与duvelisib和利妥昔单抗组合施用至受试者。吉利德(也称作 gs-1101或cal-101；gilead)是阻断pi3kδ同工型的小分子。下文显示吉利德(5
-ꢀ
氟-3-苯基-2-[(1s)-1-(7h-嘌呤-6-基氨基)丙基]-4(3h)-喹唑啉酮)的结构。
[1079][1080]
duvelisib(也称作ipi-145；infinity pharmaceuticals and abbvie)是阻断 pi3k-δ,γ的小分子。下文显示duvelisib的结构(8-氯-2-苯基-3-[(1s)-1-(9h-嘌呤
ꢀ-
6-基氨基)乙基]-1(2h)-异喹啉酮)。
[1081][1082]
在实施方案中，受试者患有cll。在实施方案中，受试者患有复发的cll， 例如，先前已经向受试者施用过癌疗法(例如，先前施用过抗cd20抗体或先前施 用过依鲁替尼)。例如，受试者在第17染色体短臂中具有缺失(del(17p)(例如，在 白血病细胞中)。在其他实例中，受试者没有del(17p)。在实施方案中，受试者 包含在免疫球蛋白重链可变区(igv
h
)基
因中包含突变的白血病细胞。在其他实施 方案中，受试者不包含在免疫球蛋白重链可变区(igv
h
)基因中包含突变的白血病 细胞。在实施方案中，受试者在第11染色体长臂中具有缺失(del(11q))。在其他 实施方案中，受试者没有del(11q)。在实施方案中，吉利德按以下剂量施用：约 100-400mg(例如，100-125、125-150、150-175、175-200、200-225、225-250、 250-275、275-300、325-350、350-375、或375-400mg)，例如，bid施用。在实 施方案中，duvelisib按以下剂量施用：约15-100mg(例如，约15-25、25-50、50-75、 或75-100mg)，例如，一日2次施用。在实施方案中，利妥昔单抗按以下剂量施 用：约350-550mg/m2(例如，350-375、375-400、400-425、425-450、450-475、 或475-500mg/m2)，例如，静脉内施用。
[1083]
在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自以下的磷脂酰肌醇3-激酶(pi3k)和 mtor的双重抑制剂：2-氨基-8-[反-4-(2-羟乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶 基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8h)-酮(pf-04691502)；n-[4-[[4-(二甲基氨基)-1
-ꢀ
哌啶基]羰基]苯基]-n'-[4-(4,6-二-4-吗啉基-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]脲 (pf-05212384，pki-587)；2-甲基-2-{4-[3-甲基-2-氧代-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氢-1h
-ꢀ
咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基}丙腈(bez-235)；apitolisib(gdc-0980，rg7422)； 2,4-二氟-n-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺 (gsk2126458)；8-(6-甲氧基-3-基)-3-甲基-1-(4-(哌嗪-1-基)-3-(三氟甲基)苯 基)-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-2(3h)-酮马来酸(nvp-bgt226)；3-[4-(4-吗啉基吡啶 并[3',2':4,5]呋喃并[3,2-d]嘧啶-2-基]酚(pi-103)；5-(9-异丙基-8-甲基-2-吗啉代
ꢀ-
9h-嘌呤-6-基)嘧啶-2-胺(vs-5584，sb2343)；和n-[2-[(3,5-二甲氧苯基)氨基]喹 啉-3-基]-4-[(4-甲基-3-甲氧苯基)羰基]氨基苯磺酰胺(xl765)。
[1084]
在实施方案中，将本文所述的表达car的细胞与间变性淋巴瘤激酶(alk) 抑制剂组合施用至受试者。示例性alk激酶抑制剂包括但不限于克里唑替尼 (pfizer)、色瑞替尼(novartis)、艾乐替尼(alectinib)(chugai)、brigatinib(也称作 ap26113；ariad)、entrectinib(ignyta)、pf-06463922(pfizer)、 tsr-011(tesaro)(参见，例如，临床试验识别号nct02048488)、cep-37440(teva) 和x-396(xcovery)。在一些实施方案中，受试者患有实体癌，例如，本文所述 的实体癌，例如，肺癌。
[1085]
克里唑替尼的化学名称是3-[(1r)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶
ꢀ-
4-基吡唑-4-基)吡啶-2-胺。色瑞替尼的化学名称是5-氯-n
2-[2-异丙氧基-5-甲基
ꢀ-
4-(4-哌啶基)苯基]-n
4-[2-(异丙基磺酰基)苯基]-2,4-嘧啶二胺。艾乐替尼的化学名 称是9-乙基-6.6-二甲基-8-(4-吗啉代哌啶-1-基)-11-氧代-6,11-二氢-5h-苯并[b]咔 唑-3-甲腈。brigatinib的化学名称是5-氯-n
2-{4-[4-(二甲基氨基)-1-哌啶基]-2-甲氧 苯基}-n
4-[2-(二甲基氧磷基)苯基]-2,4-嘧啶。entrectinib的化学名称是n-(5-(3,5
-ꢀ
二氟苄基)-1h-吲唑-3-基)-4-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-((四氢-2h-吡喃-4-基)氨基)苯甲 酰胺。pf-06463922的化学名称是(10r)-7-氨基-12-氟-2,10,16-三甲基-15-氧代
ꢀ-
10,15,16,17-四氢-2h-8,4-(甲桥)吡唑并[4,3-h][2,5,11]-苯并二氮杂十四(熳)环
ꢀ-
3-甲腈。cep-37440的化学结构是(s)-2-((5-氯-2-((6-(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基)-1
-ꢀ
甲氧基-6,7,8,9-四氢-5h-苯并[7]环庚烯-2-基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)-n-甲基苯甲 酰胺。x-396的化学名称是(r)-6-氨基-5-(1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基)-n-(4-(4
-ꢀ
甲基哌嗪-1-羰基)苯基)哒嗪-3-甲酰胺。
therapeutics,llc))二者的组合进行组合施用至受试者。hetil-15是 il-15和il-15ra的异二聚非共价复合物。hetil-15例如在美国8,124,084、美国 2012/0177598、美国2009/0082299、美国2012/0141413和美国2011/0081311中描 述，所述文献通过引用的方式并入本文。在实施方案中，皮下施用het-il-15。 在实施方案中，受试者患有癌症，例如，实体癌，例如，黑素瘤或结肠癌。在 实施方案中，受试者患有转移性癌症。
[1092]
在实施方案中，向患有本文所述的疾病(例如，血液疾病，例如，aml或 mds)的受试者施用与药物(例如细胞毒药物或化疗药、生物治疗药(例如，抗体， 例如，单克隆抗体或细胞治疗药)或抑制剂(例如，激酶抑制剂))组合的本文所述 的表达car的细胞。在实施方案中，向受试者施用与细胞毒药物(例如、cpx-351 (celator pharmaceuticals)、阿糖胞苷、佐柔比星、vosaroxin(sunesispharmaceuticals)、sapacitabine(cyclacel pharmaceuticals)、伊达比星、或米托 蒽醌)组合的本文所述的表达car的细胞。cpx-351是按5:1摩尔比包含阿糖胞苷 和佐柔比星的脂质体制剂。在实施方案中，向受试者施用与低甲基化药物(例如， dna甲基转移酶抑制剂，例如，阿扎胞苷或地西他滨)组合的本文所述的表达 car的细胞。在实施方案中，向受试者施用与生物治疗药(例如，抗体或细胞治 疗药，例如，225ac-林妥珠单抗(lintuzumab)(actimab-a；actiniumpharmaceuticals)、iph2102(innate pharma/bristol myers squibb)， sgn-cd33a(seattle genetics)或吉妥珠单抗奥加米星(mylotarg；pfizer))组合的 本文所述的表达car的细胞。sgn-cd33a是包含与抗cd33抗体连接的吡咯并 苯二氮卓二聚体的抗体-药物缀合物(adc)。actimab-a是用锕标记的抗cd33抗 体(林妥珠单抗(lintuzumab))。iph2102是靶向杀伤免疫球蛋白样受体(kir)的单 克隆抗体。在实施方案中，向受试者施用与flt3抑制剂(例如，索拉非尼(bayer)、 米哚妥林(midostaurin)(novartis)、奎扎替尼(quizartinib)(daiichi sankyo)、 crenolanib(arog pharmaceuticals)、plx3397(daiichi sankyo)、akn-028 (akinion pharmaceuticals)或asp2215(astellas))组合的本文所述的表达car的 细胞。在实施方案中，向受试者施用与异柠檬酸脱氢酶(idh)抑制剂(例如， ag-221(celgene/agios)或ag-120(agios/celgene))组合的本文所述的表达car 的细胞。在实施方案中，向受试者施用与细胞周期调节物(例如，polo样激酶 1(plk1)的抑制剂，例如，volasertib(boehringer ingelheim)；或细胞周期蛋白依 赖性激酶9(cdk9)的抑制剂(例如，阿伏西地(tolero pharmaceuticals/sanofiaventis))组合的本文所述的表达car的细胞。在实施方案中，向受试者施用与b 细胞受体信号传导网络抑制剂(例如，b细胞淋巴瘤2(bcl-2)的抑制剂，例如， venetoclax(abbvie/roche)；或bruton酪氨酸激酶(btk)的抑制剂，例如，依鲁替 尼(pharmacyclics/johnson&johnson janssen pharmaceutical))组合的本文所 述的表达car的细胞。在实施方案中，向受试者施用与m1氨基肽酶抑制剂(例 如，tosedostat(cti biopharma/vernalis))；组蛋白脱乙酰基酶(hdac)抑制剂(例 如，pracinostat(mei pharma))；多重激酶抑制剂(例如，rigosertib(onconovatherapeutics/baxter/symbio))；或肽cxcr4反向激动剂(例如，bl-8040 (biolinerx))组合的本文所述的表达car的细胞。在实施方案中，向受试者施用 与靶向除cd123之外抗原(例如，cll-1、bcma、cd33、cd19、flt-3或叶 酸受体β)的表达car的细胞组合的靶向cd123的表达car的细胞。
[1093]
在另一个实施方案中，受试者在移植细胞(例如，同种异体干细胞移植物) 前接受本发明的表达cd123 car的细胞组合物的输注。在优选的实施方案中， 表达cd123-car的细
胞瞬时表达cd123 car，例如，通过mrna cd123 car 的电穿孔，由此在输注供体干细胞之前终止cd123的表达以避免植入失败。
[1094]
一些患者可能在施用期间或之后对本发明的化合物和/或其他抗癌药出现过 敏反应；因此，经常施用抗过敏药以最大限度减少过敏反应的风险。合适的抗 过敏药包括皮质类固醇类，如地塞米松(例如，)、倍氯米松(例如， )、氢化可的松(也称作可的松、氢化可的松琥珀酸钠、氢化可的松磷 酸钠，并且以商品名称磷酸氢化可的松，hydrocort 和出售)、泼尼松龙(prednisolone)(以商品名称 和出售)、泼尼松(以商品名称 liquidliquid和出售)、甲基泼尼松龙(也 称作6-甲基泼尼松龙、醋酸甲泼尼龙、甲泼尼龙琥珀酸钠，以商品名称 和出售)；抗 组胺药，如苯海拉明(例如，)、安泰乐和赛庚啶；及支气管扩张药， 如β-肾上腺素能药受体激动剂、沙丁胺醇(albuterol)(例如，)以及特布 他林
[1095]
一些患者可能在施用本发明化合物和/或其他抗癌药期间和之后出现恶心； 因此，使用镇吐药防止恶心(反胃)和呕吐。合适的镇吐药包括阿瑞吡坦 昂丹司琼hcl格拉司琼劳拉西泮地塞米松乙二磺酸卡索匹坦(和 )及其组合。
[1096]
在治疗阶段期间，经常开具减轻疼痛体验的药物以令患者更舒适。经常使 用常见的非处方镇痛药，如然而、阿片类镇痛药物如氢可酮/扑热息 痛(paracetamol)或氢可酮/对乙酰氨基酚(例如，)、吗啡(例如， 或)、羟考酮(例如，或)、盐酸羟吗 啡酮和芬太尼(例如，)也可用于中度或重度疼痛。
[1097]
为了努力保护正常细胞免受治疗毒性并限制器官毒性，细胞保护药(如神经 保护药，自由基清除剂，心脏保护剂(cardioprotectors)，蒽环类溢出中和剂，营 养剂等)可以作为辅助疗法使用。合适的细胞保护药包括氨磷汀谷氨 酰胺、地美司钠(dimesna)美司钠(mesna)右雷佐生 (或)、扎利罗登和亚叶酸(leucovovin)(也称作钙亚 叶酸(leucovovin)、嗜橙菌因子和亚叶酸)。
[1098]
通过代码、通用名或商标标识的活性化合物的结构可以取自标准概要“默克 索引”实际版或取自数据库，例如国际专利(例如ims world publications)。
[1099]
可以与本发明化合物组合使用的上文提到的化合物可以如本领域(如上文 援引的文件中)所述那样制备并作施用。
[1100]
在一个实施方案中，本发明提供了包含本发明的至少一种化合物(例如，本 发明
化合物)或其可药用盐连同适于单独或与其他抗癌药一起施用至人类或动 物受试者的可药用载体的药物组合物。
[1101]
在一个实施方案中，本发明提供治疗患有细胞增生性疾病，如癌症的人类 或动物受试者的方法。本发明提供治疗需要这种治疗的人或动物受试者的方法， 所述方法包括向受试者单独或与其他抗癌药一起施用治疗有效量的本发明的化 合物(例如，本发明化合物)或其可药用盐。
[1102]
特别地，各组合物将作为联合疗法配制在一起施用或分别地施用。
[1103]
在联合疗法中，本发明的化合物和其他抗癌药可以同时、同步或无特定时 间限制下依次施用，其中这类施用在患者身体内提供治疗有效水平的两种化合 物。
[1104]
在一个优选的实施方案中，本发明的化合物和其他抗癌药通常以任何顺序 通过输注或口服依次施用。给药方案可以取决于疾病阶段、患者的身体健康状 况、各个药物的安全特征和各个药物的耐受性以及施用该组合的主治医生和医 疗执业者熟知的其他标准。本发明的化合物和其他抗癌药可以彼此间隔数分钟、 数小时、数天或甚至数周施用，这取决于正在用于治疗的特定周期。此外，该 周期可能包括在治疗周期期间将一种药物比另一种更经常地施用及每次施用药 物时以不同剂量施用。
[1105]
在本发明的另一个方面，提供试剂盒，所述试剂盒包括本发明的一种或多 种化合物和如本文中公开的组合配偶体。代表性试剂盒包括(a)本发明的化合物 或其可药用盐，(b)至少一种组合配偶体，例如，如上文所示，因而这类试剂盒 可以包含包装插页或其他标示，包括施用说明。
[1106]
本发明的化合物也可以与已知的治疗方法组合用来例如有助于施用激素或 尤其放疗。本发明的化合物尤其可以作为放射增敏剂使用，特别用于治疗对放 疗法显示低劣敏感性的肿瘤。
[1107]
在一个实施方案中，可以向受试者施用减少或改善与施用表达car的细胞 相关的副作用的药物。与施用表达car的细胞相关的副作用包括但不限于crs 和嗜血细胞性淋巴组织细胞增多症(hlh)，又称作巨噬细胞活化综合征(mas)。 crs的症状包括高热、恶心、一过性低血压、缺氧等。crs可以包括临床体征 和症状如发热、疲乏、厌食、肌痛、关节痛、恶心、呕吐和头痛。crs可以包 括临床皮肤体征和症状如皮疹。crs可以包括胃肠道临床体征和症状如恶心、 呕吐和腹泻。crs可以包括呼吸系统临床体征和症状如呼吸急促和低血氧症。crs可以包括心血管临床体征和症状，如心动过速、脉压加宽、低血压、心输 出量增加(早期)和心输出量可能削弱(晚期)。crs可以包括凝血临床体征和症 状，如升高的d-二聚体、低纤维蛋白原血症，伴以或不伴以出血。crs可以包 括肾临床体征和症状如氮质血症。crs可以包括肝临床体征和症状，如转氨酶 升高和高胆红素血症。crs可以包括神经系统临床体征和症状，如头痛、精神 状态改变、意识模糊、谵妄、找词困难或明显失语症、幻觉、颤抖、辨距障碍、 步态改变和发作。
[1108]
因此，本文所述的方法可以包括施用本文所述的表达car的细胞至受试者 并且进一步施用一种或多种药物以管理因表达car的细胞治疗产生的可溶性因 子水平升高。在一个实施方案中，受试者中升高的可溶性因子是ifn-γ、tnfα、 il-2和il-6中的一者或多者。在一个实施方案中，受试者中升高的因子是il-1、 gm-csf、il-10、il-8、il-5和fraktalkine中的一者或多者。因此，施用以治 疗这种副作用的药物可以是中和这些可溶
性因子中一者或多者的药物。在一个 实施方案中，中和这些可溶性形式的一者或多者的药物是抗体或抗原结合片段。 这类药物的例子包括但不限于类固醇(例如，皮质类固醇)、tnfα的抑制剂和il-6 的抑制剂。tnfα抑制剂的例子是抗tnfα抗体分子，如，英夫单抗(infliximab)、 阿达木单抗(adalimumab)、聚乙二醇赛妥珠单抗(certolizumab pegol)和戈利木 单抗(golimumab)。tnfα抑制剂的另一个例子是融合蛋白如entanercept。tnfα 的小分子抑制剂包括但不限于黄嘌呤衍生物(例如己酮可可碱)和安非他酮。il-6 抑制剂的例子是抗il-6抗体分子如托珠单抗(tocilizumab)(toc)、sarilumab、 elsilimomab、cnto328、ald518/bms-945429、cnto136、cpsi-2364、 cdp6038、vx30、argx-109、fe301和fm101。在一个实施方案中，抗il-6 抗体分子是托珠单抗。基于il-1r的抑制剂的例子是阿那白滞素。
[1109]
在一些实施方案中，向受试者施用皮质类固醇，如，例如，甲基泼尼松龙、 氢化可的松等。
[1110]
在一些实施方案中，向受试者施用血管加压剂，如，例如，去甲肾上腺素、 多巴胺、去氧肾上腺素、肾上腺素、加压素或其组合。
[1111]
在一个实施方案中，可以向受试者施用退热药。在一个实施方案中，可以 向受试者施用镇痛药。
[1112]
在一个实施方案中，可以向受试者施用增强表达car的细胞活性的物质。 例如，在一个实施方案中，药物可以是抑制抑制性分子的药物，例如，药物是 检查点抑制物。在一些实施方案中，抑制性分子(例如，程序性死亡1(pd1))可以 降低表达car的细胞发动免疫效应子反应的能力。抑制性分子的例子包括pd1、 pd-l1、ctla4、tim3、lag3、vista、btla、tigit、lair1、cd160、 2b4和tgfrβ。对抑制性分子的抑制(例如，通过在dna、rna或蛋白质水平抑 制)可以优化表达car的细胞性能。在实施方案中，例如，如本文所述，抑制性 核酸(例如，抑制性核酸，例如，dsrna，例如，sirna或shrna)、成簇规律间 隔的短回文重复序列(crispr)、转录激活物样效应子核酸酶(talen)或锌指核 酸内切酶(zfn)可以用来在表达car的细胞中抑制抑制性分子的表达。在一个 实施方案中，抑制剂是shrna。在一个实施方案中，抑制表达car的细胞内部 的抑制性分子。在这些实施方案中，对抑制性分子表达抑制的dsrna分子与编 码car的组分(例如，全部组分)的核酸连接。
[1113]
在一个实施方案中，编码dsrna分子(其抑制调节或调控(例如，抑制)t细胞 功能的分子表达)的核酸分子有效连接至启动子，例如，h1-或u6-衍生的启动子， 从而抑制调节或调控(例如，抑制)t细胞功能的分子表达的dsrna分子表达，例 如，在表达car的细胞内部表达。参见，例如tiscornia g.,“development of lentiviral vectors expressing sirna,”第3章,引自gene transfer:delivery and expression of dna and rna(编者friedmann和rossi).cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,ny,usa,2007；brummelkamp tr等人, (2002)science 296:550
–
553；miyagishi m等人,(2002)nat.biotechnol.19: 497
–
500。在一个实施方案中，编码dsrna分子(其抑制调节或调控(例如，抑制)t 细胞功能的分子表达)的核酸分子存在于相同的载体(例如，慢病毒载体)上，所 述载体包含编码car组分(例如，其全部组分)的核酸分子。在这种实施方案中， 编码dsrna分子(其抑制调节或调控(例如，抑制)t细胞功能的分子表达)的核酸 分子相对于编码car组分(例如，其全部组分)的核酸的5’或3’位于载体(例如， 慢病毒载体)上。编码dsrna分子
(其抑制调节或调控(例如，抑制)t细胞功能的 分子表达)的核酸分子可以按照编码car组分(例如，其全部组分)的核酸相同或 不同的方向转录。
[1114]
在一个实施方案中，编码dsrna分子(其抑制调节或调控(例如，抑制)t细胞 功能的分子表达)的核酸分子存在于除包含编码car组分(例如，其全部组分)的 核酸分子的载体之外的载体上。在一个实施方案中，编码dsrna分子(其抑制调 节或调控(例如，抑制)t细胞功能的分子表达)的核酸分子在表达car的细胞内 部瞬时表达。在一个实施方案中，编码dsrna分子(其抑制调节或调控(例如，抑 制)t细胞功能的分子表达)的核酸分子是稳定整合入表达car的细胞的基因组 中。图51a-51e描述了载体的例子，所述载体表达car组分(例如，其全部组分) 和抑制调节或调控(例如，抑制)t细胞功能的分子表达的dsrna分子。
[1115]
下文提供可用于抑制调节或调控(例如，抑制)t细胞功能的分子表达的 dsrna分子的例子，其中调节或调控(例如，抑制)t细胞功能的分子是pd-1。
[1116]
在下表16中提供pdcd1(pd1)rnai剂(从小鼠pdcd1基因序列 nm_008798.2中其位置衍生)的名称，以及代表dna序列的seq id no: 216-263。该表中有义(s)序列和反义(as)序列均作为19聚序列和21聚序列呈现。 还指出，位置(pos，例如，176)从小鼠pdcd1基因序列nm_008798.2中的位置 编号衍生。seq id no以12个组显示，所述组对应于“有义19”seq id no: 608-619；“有义21”seq id no:620-631；“反义21”seq id no:632-643；“反 义19”seq id no:644-655。
[1117]
表16.小鼠pdcd1(pd1)shrna序列
[1118]
[1119][1120]
在下表17中提供pdcd1(pd1)rnai剂(衍生自它们在人pdcd1基因序列中 的位置)的名称，以及代表dna序列的seq id no:264-311。有义(s)序列和反义 (as)序列均作为19聚序列和21聚序列呈现。seq id no以12个组显示，所述组 对应于“有义19”seq id no:656-667；“有义21”seq id no:668-679；“反义 21”seq id no:680-691；“反义19”seq id no:692-703。
[1121]
表17.人pdcd1(pd1)shrna序列
[1122]
20120114649中公开的抗pd-1抗体。
[1127]
在一个实施方案中，抗pd-1抗体或其片段是如在题为“antibody molecules to pd-1 and uses thereof”的us 2015/0210769中描述的抗pd-1抗体分子，通过 引用整体并入本文。在一个实施方案中，抗pd-1抗体分子包含来自选自以下任 一的抗体的重链可变区和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或 六个cdr(或集合所有cdr)：bap049-hum01、bap049-hum02、 bap049-hum03、bap049-hum04、bap049-hum05、bap049-hum06、 bap049-hum07、bap049-hum08、bap049-hum09、bap049-hum10、 bap049-hum11、bap049-hum12、bap049-hum13、bap049-hum14、 bap049-hum15、bap049-hum16、bap049-clone-a、bap049-clone-b、 bap049-clone-c、bap049-clone-d或bap049-clone-e；或如在us 2015/0210769的表1中所述，或由表1中的核苷酸序列编码的序列，或与任何上述 序列基本上同一的序列(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、 99％或更高同一性)；或紧密相关的cdr，例如同一或具有至少一个氨基酸改 变、但不超过两个、三个或四个改变(例如置换、缺失或插入，例如保守置换) 的cdr。
[1128]
在另一个实施方案中，抗pd-1抗体分子包含来自本文所述抗体(例如选自 以下任意的抗体)的至少一个、两个、三个或四个可变区：bap049-hum01、 bap049-hum02、bap049-hum03、bap049-hum04、bap049-hum05、 bap049-hum06、bap049-hum07、bap049-hum08、bap049-hum09、 bap049-hum10、bap049-hum11、bap049-hum12、bap049-hum13、 bap049-hum14、bap049-hum15、bap049-hum16、bap049-clone-a、 bap049-clone-b、bap049-clone-c、bap049-clone-d或bap049-clone-e；或 如在us 2015/0210769的表1中所述，或由表1中的核苷酸序列编码的序列，或与 任何上述序列基本上同一的序列(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、 97％、98％、99％或更高同一性)。
[1129]
tim3(t细胞免疫球蛋白-3)也负向调节t细胞功能，特别在ifn-g分泌的 cd4+辅助t细胞1和cd8+t细胞毒性1细胞中，并且在t细胞消耗中发挥至关重 要的作用。抑制tim3和其配体(例如，半乳糖凝集素-9(gal9)、磷脂酰丝氨酸(ps) 和hmgb1)之间的相互作用可以增加免疫应答。tim3和其配体的抗体、抗体片 段和其他抑制剂是本领域可获得的并且可以与本文所述的cd19 car组合使 用。例如，靶向tim3的抗体、抗体片段、小分子或肽抑制剂与tim3的igv结构 域结合以抑制与其配体的相互作用。抑制tim3的抗体和肽在wo 2013/006490 和us 20100247521中公开。其他抗tim3抗体包括rmt3-23的人源化形式(ngiow 等人,2011,cancer res,71:3540-3551中公开)和克隆8b.2c12(monney等人, 2002,nature,415:536-541中公开)。抑制tim3和pd-1的双特异性抗体在us20130156774中公开。
[1130]
在一个实施方案中，抗tim3抗体或其片段是如在题为“antibody moleculesto tim3and uses thereof”的us 2015/0218274中描述的抗tim3抗体分子，通 过引用整体并入本文。在一个实施方案中，抗tim3抗体分子包含来自选自以下 任一的抗体的重链可变区和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个 或六个cdr(或集合所有cdr)：abtim3、abtim3-hum01、abtim3-hum02、 abtim3-hum03、abtim3-hum04、abtim3-hum05、abtim3-hum06、 abtim3-hum07、abtim3-hum08、abtim3-hum09、abtim3-hum10、abtim3-hum11、abtim3-hum12、abtim3-hum13、abtim3-hum14、 abtim3-hum15、abtim3-hum16、abtim3-hum17、abtim3-hum18、 abtim3-hum19、abtim3-hum20、abtim3-hum21、abtim3-hum22、 abtim3-hum23；或如在us2015/0218274的表1-4中所述，或由表1-4中的核苷 酸序列编码的
序列，或与任何上述序列基本上同一的序列(例如至少80％、85％、 90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性)；或紧密相关的cdr， 例如相同或具有至少一个氨基酸改变、但不超过两个、三个或四个改变(例如 置换、缺失或插入，例如保守置换)的cdr。
[1131]
在另一个实施方案中，抗tim3抗体分子包含来自本文所述抗体(例如选自 以下任意的抗体)的至少一个、两个、三个或四个可变区：abtim3、 abtim3-hum01、abtim3-hum02、abtim3-hum03、abtim3-hum04、 abtim3-hum05、abtim3-hum06、abtim3-hum07、abtim3-hum08、 abtim3-hum09、abtim3-hum10、abtim3-hum11、abtim3-hum12、 abtim3-hum13、abtim3-hum14、abtim3-hum15、abtim3-hum16、 abtim3-hum17、abtim3-hum18、abtim3-hum19、abtim3-hum20、 abtim3-hum21、abtim3-hum22、abtim3-hum23；或如在us2015/0218274 的表1-4中所述，或由表1-4中的核苷酸序列编码的序列，或与任何上述序列基本 上同一的序列(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％ 或更高同一性)。
[1132]
在其他实施方案中，增强表达car的细胞活性的物质是ceacam抑制剂 (例如，ceacam-1、ceacam-3和/或ceacam-5抑制剂)。在一个实施方案 中，ceacam的抑制剂是抗ceacam抗体分子。示例性抗ceacam-1抗体在 wo 2010/125571、wo 2013/082366、wo 2014/059251和wo 2014/022332中描 述，例如，单克隆抗体34b1、26h7和5f4；或其重组形式，例如，如us 2004/0047858、us7,132,255和wo 99/052552中所述。在其他实施方案中，抗 ceacam抗体与ceacam-5结合，如zheng等人,plos one.2010 sep 2；5(9). pii:e12529(doi:10:1371/journal.pone.0021146)中所述，或与ceacam-1和 ceacam-5交叉反应，例如，如wo 2013/054331和us 2014/0271618中所述。
[1133]
不希望受理论约束，认为癌胚抗原细胞黏附分子(ceacam)(如 ceacam-1和ceacam-5)至少部分地介导对抗肿瘤免疫应答的抑制(参见，例 如，markel等人,j immunol.2002 mar 15；168(6):2803-10；markel等人,jimmunol.2006 nov 1；177(9):6062-71；markel等人,immunology.2009 feb；126(2):186-200；markel等人,cancer immunol immunother.2010feb；59(2):215-30；ortenberg等人,mol cancer ther.2012 jun；11(6):1300-10； stern等人,j immunol.2005 jun 1；174(11):6692-701；zheng等人,plos one. 2010 sep 2；5(9).pii:e12529)。例如，已经将ceacam-1描述为tim-3的异嗜性 配体及在tim-3介导的t细胞耐受性和消耗中发挥作用(参见，例如，wo2014/022332；huang等人,(2014)nature doi:10.1038/nature13848)。在实施方案 中，共同阻断ceacam-1和tim-3已经显示在异种移植结直肠癌模型中增强抗 肿瘤免疫应答(参见，例如，wo 2014/022332；huang等人,(2014),上文)。在其 他实施方案中，共同阻断ceacam-1和pd-1降低t细胞耐受性，例如，如wo2014/059251中所述那样。因此，ceacam抑制剂可以与本文所述的其他免疫调 节剂(例如，抗pd-1和/或抗tim-3抑制物)一起使用，以增强针对癌(例如，黑素 瘤、肺癌(例如，nsclc)、膀胱癌、结肠癌、卵巢癌以及如本文所述的其他癌) 的免疫应答。
[1134]
lag3(淋巴细胞活化基因-3或cd223)是在活化的t细胞和b细胞上表达的 细胞表面分子，其中已经显示所述细胞表面分子在cd8+t细胞消耗中发挥作用。 lag3和其配体的抗体、抗体片段和其他抑制剂是本领域可获得的并且可以与本 文所述的cd19 car组合使用。例如，bms-986016(bristol-myers squib)是靶向 lag3的单克隆抗体。imp701(immutep)是拮抗剂lag3抗体并且 imp731(immutep和glaxosmithkline)是消耗性lag3抗体。其他lag3抑制剂包 括imp321(immutep)，所述imp321是lag3的可溶性部分和与mhc ii
类分子结 合并激活抗原呈递细胞(apc)的ig的重组融合蛋白。其他抗体例如在wo2010/019570中公开。
[1135]
在一些实施方案中，增强表达car的细胞活性的物质可以例如是包含第一 结构域和第二结构域的融合蛋白，其中第一结构域是抑制性分子或其片段，并 且第二结构域是与正向信号相关的多肽，例如，包含如本文所述的胞内信号结 构域的多肽。在一些实施方案中，与正向信号相关的多肽可以包含cd28、cd27、 icos的共刺激结构域，例如，cd28、cd27和/或icos的胞内信号结构域和/或 (例如，本文所述的)(例如，cd3ζ的)初级信号结构域。在一个实施方案中，融合 蛋白是由表达car的相同细胞表达。在另一个实施方案中，融合蛋白由不表达 cd123 car的细胞(例如，t细胞)表达。
[1136]
在一个实施方案中，增强本文所述的表达car的细胞活性的物质是 mir-17-92。
[1137]
在一个实施方案中，增强本文所述的car活性的物质是细胞因子。细胞因 子具有与t细胞扩充、分化、存活和稳态相关的重要功能。可以对接受本文所述 的表达car的细胞的受试者施用的细胞因子包括：il-2、il-4、il-7、il-9、il-15、 il-18和il-21或其组合。在优选的实施方案中，施用的细胞因子是il-7、il-15、 或il-21或其组合。细胞因子可以一天一次或一天超过一次施用，例如，一天2 次、一天3次、或一天4次。可以将细胞因子施用多于一天，例如将细胞因子施 用2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周或4周。例如，将细胞因子一天一 次施用7天。
[1138]
在实施方案中，细胞因子与表达car的t细胞组合施用。细胞因子可以与 表达car的t细胞同时或同步施用，例如，在同一天施用。细胞因子可以配制 在与表达car的t细胞相同的药物组合物中，或可以配制在分离的药物组合物 中。备选地，细胞因子可以在施用表达car的t细胞后不久施用，例如，在施 用表达car的t细胞后1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天施用。在细胞因子 按进行超过一天的给药方案施用的实施方案中，细胞因子给药方案的第1天可以 在与施用表达car的t细胞的同一天、或细胞因子给药方案的第1天可以是在施 用表达car的t细胞后的1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。在一个实施方 案中，在第1天，将表达car的t细胞施用至受试者并且在第2天，将细胞因子 一天一次施用接下来的7天。在一个优选实施方案中，与表达car的t细胞组合 施用的细胞因子是il-7、il-15或il-21。
[1139]
在其他实施方案中，将细胞因子在施用表达car的细胞后一段时间施用， 例如，在施用表达car的细胞后至少2周、3周、4周、6周、8周、10周、12周、 4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、或1年或更长 时间施用。在一个实施方案中，将细胞因子在评估受试者对表达car的细胞的 反应后施用。例如，根据本文所述的剂量和治疗方案，向受试者施用表达car 的细胞。在施用表达car的细胞后2周、3周、4周、6周、8周、10周、12周、4 个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、或1年或更长 时间，使用本文所述的任何方法，评估受试者对表达car的细胞疗法的反应， 包括对肿瘤生长的抑制、减少循环的肿瘤细胞、或肿瘤消退。可以向针对表达 car的细胞疗法未显示出足够反应的受试者施用细胞因子。施用细胞因子至针 对表达car的细胞疗法具有次优反应的受试者改善了表达car的细胞的功效 或抗癌活性。在一个优选实施方案中，在施用表达car的细胞后施用的细胞因 子是il-7。
[1140]
与cd19抑制剂的组合
[1141]
本文公开的方法和组合物可以与cd19抑制剂组合使用。在一些实施方案 中，同时
或一同或相继施用含有cd123car的细胞和cd19抑制剂(例如，表 达结合cd19的car分子(例如结合本文所述的结合cd19的car分子)的 一种或多种细胞)。
[1142]
在一些实施方案中，将含有cd123car的细胞和cd19抑制剂同时或一同 地输注到受试者中，例如在相同的输注体积中混合。例如，将含有cd123car 的细胞群体和含有cd19car的细胞混合在一起。备选地，施用共表达 cd123car和cd19car的细胞群体。在其它实施方案中，同时施用包括例如 在预定时间间隔内(例如，彼此间隔在15、30或45分钟内)分别施用含cd123 car的细胞和cd19抑制剂。
[1143]
在一些实施方案中，含有cd123 car的细胞的起始和cd19抑制剂的起始 彼此在1、2、3、4、6、12、18或24小时内，或彼此在1、2、3、4、5、10、 15、20、25、30、35、40、60、80或100天内。在一些实施方案中，含有cd123 car的细胞递送的结束和cd19抑制剂递送的结束彼此在1、2、3、4、6、12、18或24小时内，或彼此在1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、60、 80或100天内。在一些实施方案中，在含有cd123 car的细胞递送(例如输 注)和cd19抑制剂递送(例如输注)的结束之间施用方面的重叠是至少1、2、 3、4、5、10、15、20、25、30分钟。在一个实施方案中，在含有cd123 car 的细胞之前施用cd19抑制剂。在其他实施方案中，在cd19抑制剂之前施用 含有cd123 car的细胞。
[1144]
在一些实施方案中，在受试者中存在cd19抑制剂(例如，表达cd19 car 分子的一种或多种细胞)(例如，经历扩充的细胞)的同时施用含有cd123 car 的细胞。在其它实施方案中，在受试者中存在含有cd123 car的细胞(例如， 经历扩充的细胞)的同时施用cd19抑制剂(例如，表达cd19 car分子的一 种或多种细胞)。
[1145]
cd19抑制剂包括但不限于表达cd19 car的细胞，例如cd19 cart细 胞或抗cd19抗体(例如抗cd19单或双特异性抗体)或其片段或缀合物。
[1146]
在一个实施方案中，将本文所述的表达car的细胞与cd19 car细胞(例 如cart细胞)(例如，ctl019，例如，如wo2012/079000中所述，其通过 引用并入本文)组合施用给受试者。
[1147]
在其它实施方案中，将本文所述的表达car的细胞与cd19 car细胞(例 如cart细胞)组合施用于受试者，所述cd19 car细胞包含如 wo2014/153270中所述的人源化抗原结合结构域(例如wo2014/153270的表 3)，通过引用并入本文。
[1148]
cd19抑制剂(例如，第一表达cd19 car的细胞)和第二表达cd123 car 的细胞可以由相同的细胞类型或不同的类型表达。例如，在一些实施方案中， 表达cd19 car的细胞是cd4+t细胞，表达cd123 car的细胞是cd8+t 细胞，或者表达cd19 car的细胞是cd8+t细胞，表达cd123 car的细胞 是cd4+t细胞。在其他实施方案中，表达cd19 car的细胞是t细胞，表达 cd123 car的细胞是nk细胞，或者表达cd19 car的细胞是nk细胞，表 达cd123 car的细胞是t细胞。在其他实施方案中，表达cd19 car的细胞 和表达cd123 car的细胞都是nk细胞或都是t细胞，例如都是cd4+t细 胞，或都是cd8+t细胞。在其他实施方案中，单个细胞表达cd19 car和cd123car，并且该细胞是例如nk细胞或t细胞，例如cd4+t细胞或cd8+t细 胞。
[1149]
第一car和第二car可以包含相同或不同的胞内信号结构域。例如，在 一些实施方案中，cd19 car包含cd3ζ信号结构域，cd123 car包含共刺 激结构域，例如41bb、cd27或cd28共刺激结构域，而在一些实施方案中， cd19 car包含共刺激结构域，例如，41bb、cd27或cd28共刺激结构域， 并且cd123 car包含cd3ζ信号结构域。在其它实施方案中，cd19 car
和 cd123 car的每一个包含相同类型的初级信号结构域，例如cd3ζ信号结构 域，但是cd19 car和cd123 car包含不同的共刺激结构域，例如(1)cd19car包含41bb共刺激结构域，cd123 car包含不同的共刺激结构域，例如 cd27共刺激结构域，(2)cd19 car包含cd27共刺激结构域，cd123 car 包含不同的共刺激结构域，例如41bb共刺激结构域，3)cd19 car包含41bb 共刺激结构域，cd123 car包含cd28共刺激结构域，(4)cd19 car包含 cd28共刺激结构域，cd123 car包含不同的共刺激结构域，例如41bb共刺 激结构域，(5)cd19 car包含cd27共刺激结构域，cd123 car包含cd28 共刺激结构域，或(6)cd19 car包含cd28共刺激结构域，cd123 car包 含cd27共刺激结构域。在另一个实施方案中，细胞包含car，所述car包 含cd19抗原结合结构域和cd123抗原结合结构域，例如双特异性抗体。
[1150]
在实施方案中，受试者患有急性髓性白血病(aml)，例如cd19阳性aml 或cd19阴性aml。在实施方案中，受试者患有cd19+淋巴瘤，例如cd19+ 非霍奇金淋巴瘤(nhl)、cd19+fl或cd19+dlbcl。在实施方案中，受 试者患有复发性或难治性cd19+淋巴瘤。在实施方案中，在施用(例如输注) cd19 cart细胞之前、同时或之后向受试者施用淋巴细胞消耗化疗。在一个实 例中，在施用cd19 cart细胞之前向受试者施用淋巴细胞消耗化疗。例如， 淋巴细胞消耗化疗在cd19 cart细胞输注之前1-4天(例如，1、2、3或4天) 结束。在实施方案中，施用多剂量的cd19 cart细胞，例如，如本文所述。 例如，单剂量包含约5
×
108个cd19 cart细胞。在实施方案中，在施用(例 如输注)本文所述的表达car的细胞(例如非表达cd19 car的细胞)之前、 同时或之后向受试者施用淋巴细胞消耗化疗。在实施方案中，在施用(例如输 注)非表达cd19 car的细胞(例如本文所述的非表达cd19 car的细胞)之 前、同时或之后向受试者施用cd19 cart。
[1151]
在一些实施方案中，将本文所述的表达car的细胞与表达cd19 car的 细胞(例如ctl019，例如，如wo2012/079000中所述，通过引用并入本文) 组合施用于受试者，用于治疗与cd123表达相关的疾病，例如，本文所述的癌 症。不受理论的束缚，据信表达cd19 car的细胞与表达car的细胞组合施 用，通过靶向早期谱系癌细胞(例如癌症干细胞)、调节免疫应答、消耗调节 性b细胞和/或改善肿瘤微环境来改善本文所述的表达car的细胞的功效。例 如，表达cd19 car的细胞靶向表达早期谱系标志物的癌细胞，例如癌干细胞 和表达cd19的细胞，而本文所述的表达car的细胞靶向表达晚期谱系标志物 (例如cd123)的癌细胞。该预调节方法可以改善本文所述的表达car的细 胞的功效。在这样的实施方案中，在施用(例如输注)本文所述的表达car的 细胞之前、同时或之后施用表达cd19 car的细胞。
[1152]
在实施方案中，本文所述的表达car的细胞还表达靶向cd19的car， 例如cd19 car。在一个实施方案中，将表达本文所述的car和cd19 car 的细胞施用于受试者，用于治疗本文所述的癌症，例如aml。在一个实施方案 中，一种或两种car分子的配置包括初级胞内信号结构域和共刺激信号结构 域。在另一个实施方案中，car分子之一或两者的配置包括初级胞内信号结构 域和两个或多个，例如2、3、4或5个或更多个共刺激信号结构域。在这样的 实施方案中，本文所述的car分子和cd19 car可以具有相同或不同的初级 胞内信号结构域、相同或不同的共刺激信号结构域、或相同数目或不同数目的 共刺激信号结构域。备选地，本文所述的car和cd19 car配置为分拆的car， 其中car分子之一包含抗原结合结构域和共刺激结构域(例如，4-1bb)，而 另一car分子包含抗原结合结构域和初级胞内信号结构域(例如，cd3ζ)。
[1153]
在一个实施方案中，本文所述的car和第二car，例如cd19 car，在 相同的载体上或在两个不同的载体上。在本文所述的car和第二car例如cd19 car在相同载体上的实施方案中，编码本文所述的car和第二car(例 如cd19 car)的核酸序列在相同的框架中，通过一个或多个肽切割位点，例 如p2a分开。
[1154]
在其它实施方案中，本文公开的表达car的细胞与抗cd19抗体抑制剂组 合施用。在一个实施方案中，抗cd19抗体是如wo2014/153270(例如 wo2014/153270的表3)中所述的人源化抗原结合结构域，其通过引用并入本 文，或其缀合物。其它示例性抗cd19抗体或其片段或缀合物包括但不限于博 纳吐单抗、sar3419(sanofi)、medi-551(medimmune llc)、combotox、 dt2219arl(masonic cancer center)、mor-208(也称为xmab-5574； morphosys)、xmab-5871(xencor)、mdx-1342(bristol-myers squibb)、 sgn-cd19a(seattle genetics)和afm11(affimed therapeutics)。参见， 例如，hammer.mabs.4.5(2012):571
–
77。博纳吐单抗是双特异性抗体，其由 两个scfv组成，一个scfv结合cd19和一个scfv结合cd3。博纳吐单抗指导 t细胞攻击癌细胞。参见，例如，hammer等人；clinical trial identifier no. nct00274742and nct01209286。medi-551是人源化抗cd19抗体，其具有 被改造的fc以具有增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)。参见， 例如，hammer等人；和clinical trial identifier no.nct01957579。combotox 是结合cd19和cd22的免疫毒素的混合物。免疫毒素由scfv抗体片段融合至 去糖基化的蓖麻毒蛋白a链组成。参见，例如，hammer等人；和herrera等 人j.pediatr.hematol.oncol.31.12(2009):936-41；schindler等人br.j. haematol.154.4(2011):471-6。dt2219arl是靶向cd19和cd22的双特异性 免疫毒素，其包含两个scfv和截短的白喉毒素。参见，例如，hammer等人； 和clinical trial identifier no.nct00889408。sgn-cd19a是抗体-药物缀合物 (adc)，其由抗cd19人源化单克隆抗体连接合成的细胞毒性细胞杀伤物质， 单甲基auristatin f(mmaf)组成。参见，例如，hammer等人；和clinical trialidentifier nos.nct01786096和nct01786135。sar3419是抗cd19抗体-药物 缀合物(adc)，其包含通过可切割接头与美登素衍生物缀合的抗cd19人源 化单克隆抗体。参见，例如，younes等人j.clin.oncol.30.2(2012):2776-82；hammer等人；clinical trial identifier no.nct00549185；和blanc等人clincancer res.2011；17:6448-58。xmab-5871是fc工程化的、人源化的抗cd19 抗体。参见，例如，hammer等人。mdx-1342是具有增强的adcc的人fc
-ꢀ
工程化的抗cd19抗体。参见，例如，hammer等人。在实施方案中，抗体分 子是双特异性抗cd19和抗cd3分子。例如，afm11是靶向cd19和cd3的 双特异性抗体。参见，例如，hammer等人；和clinical trial identifier no. nct02106091。在一些实施方案中，本文所述的抗cd19抗体与治疗剂缀合或 以其它方式结合，所述治疗剂，例如化疗剂、肽疫苗(如在izumoto等人2008jneurosurg 108：963-971中所述的)、免疫抑制剂、或免疫消融剂，例如环孢 菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯、fk506、campath、抗cd3抗体、 细胞毒素、氟达拉滨、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇、fr901228或细胞因子。
[1155]
与低剂量的mtor抑制剂组合
[1156]
本文所述的方法使用免疫增强性低剂量的mtor抑制剂，例如，变构性 mtor抑制剂，包含雷帕霉素类似物如rad001。施用免疫增强性低剂量的 mtor抑制剂(例如，该剂量不足以完全抑制免疫系统，但足以改善免疫功能) 可以优化受试者中免疫效应细胞(例如，t
细胞或表达car的细胞)的性能。美国 专利申请号2015/01240036中描述了用于测量mtor抑制作用的方法、剂量、治 疗方案和合适的药物组合物，所述文献因而通过引用的方式并入。
[1157]
在一个实施方案中，施用免疫增强性低剂量的mtor抑制剂可以导致以下 一个或多个结果：
[1158]
i)pd-1阳性免疫效应细胞数目减少；
[1159]
ii)pd-1阴性免疫效应细胞数目增加；
[1160]
iii)pd-1阴性免疫效应细胞/pd-1阳性免疫效应细胞的比率增加；
[1161]
iv)原初t细胞数目增加；
[1162]
v)以下一种或多种标记物的表达增加：例如，在记忆t细胞(例如，记忆t细 胞前体)上的cd62l
高
、cd127
高
、cd27
+
和bcl2；
[1163]
vi)记忆t细胞(例如，记忆t细胞前体)上klrg1的表达减少；或
[1164]
vii)记忆t细胞前体的数目增加，所述记忆t细胞前体例如是具有以下特征的 任一个或其组合的细胞：cd62l
高
增加、cd127
高
增加、cd27
+
增加、klrg1减 少和bcl2增加；
[1165]
并且其中例如，如与未治疗的受试者相比，前述任一项例如i)、ii)、iii)、iv)、 v)、vi)或vii)的变化出现，例如，至少暂时出现。
[1166]
在另一个实施方案中，例如，如与未处理的表达car的细胞或未治疗的受 试者相比，施用免疫增强性低剂量的mtor抑制剂导致(例如，在培养物中或在 受试者中)表达car的细胞的增殖增加或延长。在实施方案中，增加的增殖与表 达car的细胞的数目增加相关。实施例9和10中描述了用于测量增加或延长的增 殖的方法。在另一个实施方案中，例如，如与未处理的表达car的细胞或未治 疗的受试者相比，施用免疫增强性低剂量的mtor抑制剂导致(例如，在培养物 中或在受试者中)表达car的细胞增加癌细胞杀伤作用。在实施方案中，增加的 癌细胞杀伤作用与肿瘤体积缩减相关。实施例2中描述了用于测量增加的癌细胞 杀伤作用的方法。
[1167]
在一个实施方案中，表达car分子(例如，本文所述的car分子)的细胞与 免疫增强性低剂量的mtor抑制剂(例如，变构性mtor抑制剂，例如，rad001 或催化性mtor抑制剂)组合施用。例如，施用免疫增强性低剂量的mtor抑制 剂可以在施用本文所述的表达car的细胞之前启动；在施用本文所述的表达 car的细胞之前完成；与施用本文所述的表达car的细胞同时启动；与施用本 文所述的表达car的细胞重叠；或在施用本文所述的表达car的细胞后继续。
[1168]
备选地或额外地，施用免疫增强性低剂量的mtor抑制剂可以优化待工程 化以表达本文所述的car分子的免疫效应细胞。在这类实施方案中，从受试者 收获待工程化以表达本文所述的car分子的免疫效应细胞(例如，t细胞或nk细 胞))之前，启动或完成了免疫增强性低剂量的mtor抑制剂(例如，变构抑制剂 (例如，rad001)或催化性抑制剂)的施用。
[1169]
在另一个实施方案中，待工程化以表达本文所述的car分子的免疫效应细 胞(例如，t细胞或nk细胞)，例如，从受试者收获后，或表达car的免疫效应 细胞(例如，t细胞或nk细胞)，例如，在施用至受试者之前，可以在存在免疫 增强性低剂量的mtor抑制剂时培养。
[1170]
在一个实施方案中，向受试者施用免疫增强性低剂量的mtor抑制剂包括 例如，每周一次，例如，在速释剂型中施用0.1至20、0.5至10、2.5至7.5、3至6 或约5mg rad001，或其生物等效剂量。在一个实施方案中，向受试者施用免 疫增强性低剂量的mtor抑制剂包括例
如每周一次，例如，在缓释剂型中施用 0.3至60、1.5至30、7.5至22.5、9至18或约15mg rad001，或其生物等效剂量。
[1171]
在一个实施方案中，mtor抑制剂的剂量与至少5％但是不多于90％、至少 10％但是不多于90％、至少15％但是不多于90％、至少20％但是不多于90％、 至少30％但是不多于90％、至少40％但是不多于90％、至少50％但是不多于 90％、至少60％但是不多于90％、至少70％但是不多于90％、至少5％但是不多 于80％、至少10％但是不多于80％、至少15％但是不多于80％、至少20％但是 不多于80％、至少30％但是不多于80％、至少40％但是不多于80％、至少50％ 但是不多于80％、至少60％但是不多于80％、至少5％但是不多于70％、至少10％ 但是不多于70％、至少15％但是不多于70％、至少20％但是不多于70％、至少 30％但是不多于70％、至少40％但是不多于70％、至少50％但是不多于70％、 至少5％但是不多于60％、至少10％但是不多于60％、至少15％但是不多于60％、 至少20％但是不多于60％、至少30％但是不多于60％、至少40％但是不多于 60％、至少5％但是不多于50％、至少10％但是不多于50％、至少15％但是不多 于50％、至少20％但是不多于50％、至少30％但是不多于50％、至少40％但是 不多于50％、至少5％但是不多于40％、至少10％但是不多于40％、至少15％但 是不多于40％、至少20％但是不多于40％、至少30％但是不多于40％、至少35％ 但是不多于40％、至少5％但是不多于30％、至少10％但是不多于30％、至少15％ 但是不多于30％、至少20％但是不多于30％、或至少25％但是不多于30％的 mtor抑制作用相关或提供这种mtor抑制作用。
[1172]
mtor抑制作用的程度可以表述为或对应于p70s6激酶抑制作用的程度， 例如，mtor抑制作用的程度可以通过p70s6激酶活性下降的水平(例如，通过 p70s6激酶底物的磷酸化下降)来确定。可以通过多种方法评价mtor抑制作用 的水平，如通过boulay测定法测量p70s6激酶活性，如美国专利申请号 2015/01240036中描述，所述文献因而通过引用的方式并入，或如美国专利号 7,727,950中描述，所述文献因而通过引用的方式并入；通过蛋白质印迹法测量 磷酸化s6的水平；或评价pd1阴性免疫效应细胞对pd1阳性免疫效应细胞比率的 变化。
[1173]
如本文所用，术语“mtor抑制剂”指在细胞中抑制mtor激酶的化合物或 配体、或其可药用盐。在一个实施方案中，mtor抑制剂是变构抑制剂。变构 性mtor抑制剂包括中性三环状化合物雷帕霉素(西罗莫司(sirolimus))、雷帕霉 素相关化合物，所述雷帕霉素相关化合是与雷帕霉素具有结构和功能相似性的 化合物，例如包括雷帕霉素衍生物、雷帕霉素类似物(也称作雷帕类似物)和抑制 mtor活性的其他大环内酯类化合物。在一个实施方案中，mtor抑制剂是催 化性抑制剂。
[1174]
雷帕霉素是吸水链霉菌(streptomyces hygroscopicus)产生的已知大环内酯 类抗生素，其具有式a中所示的结构。
[1175][1176]
参见例如mcalpine,j.b.,等人,j.antibiotics(1991)44:688；schreiber,s.l. 等人,j.am.chem.soc.(1991)113:7433；美国专利号3,929,992。存在针对雷帕 霉素提出的多种编号方案。为避免混淆，当本文中命名特定雷帕霉素类似物时， 参考使用式a编号方案的雷帕霉素给出名称。
[1177]
可用于本发明中的雷帕霉素类似物例如是o-取代的类似物，其中雷帕霉素 的环己基环上的羟基由其中r1是羟烷基、羟烷氧基烷基、酰氨基烷基或氨烷基 的or1替换；例如，如us 5,665,772和wo 94/09010中所述的rad001，也称作依 维莫司，所述每篇文献的内容通过引用的方式并入。
[1178]
其他合适的雷帕霉素类似物包括在26-或28-位置处取代的那些。雷帕霉素类 似物可以是上文提到的类似物的差向异构体，特别地，在位置40、28或26取代 的类似物的差向异构体，并且可以任选地进一步氢化，例如，如us6,015,815、 wo 95/14023和wo 99/15530中所述，所述文献的内容通过引用的方式并入，例 如abt578，也称作佐他莫司或在us 7,091,213、wo 98/02441和wo 01/14387 中描述的雷帕霉素类似物，所述文献的内容通过引用的方式并入，例如， ap23573，也称作地磷莫司。
[1179]
来自us 5,665,772的适用于本发明中的雷帕霉素类似物的例子包括但不限 于40-o-苄基-雷帕霉素、40-o-(4
’-
羟甲基)苄基-雷帕霉素、40-o-[4
’-
(1,2-二羟乙 基)]苄基-雷帕霉素、40-o-烯丙基-雷帕霉素、40-o-[3
’-
(2,2-二甲基-1,3-二氧戊环
ꢀ-
4(s)-基)-丙-2
’-
烯-1
’-
基]-雷帕霉素、(2’e,4’s)-40-o-(4’,5
’-
二羟戊-2
’-
烯-1
’-
基)
-ꢀ
雷帕霉素、40-o-(2-羟)乙氧羰基甲基-雷帕霉素、40-o-(2-羟)乙基-雷帕霉素、 40-o-(3-羟)丙基-雷帕霉素、40-o-(6-羟)己基-雷帕霉素、40-o-[2-(2-羟)乙氧基] 乙基-雷帕霉素、40-o-[(3s)-2,2-二甲基二氧戊环-3-基]甲基-雷帕霉素、 40-o-[(2s)-2,3-二羟丙-1-基]-雷帕霉素、40-o-(2-乙酰氧)乙基-雷帕霉素、40-o-(2
-ꢀ
尼克酰基氧)乙基-雷帕霉素、40-o-[2-(n-吗啉代)乙酰氧]乙基-雷帕霉素、 40-o-(2-n-咪唑基乙酰氧)乙基-雷帕霉素、40-o-[2-(n-甲基-n
’-
哌嗪基)乙酰氧] 乙基-雷帕霉素、39-o-去甲基-39,40-o,o-亚乙基-雷帕霉素、(26r)-26-二氢
ꢀ-
40-o-(2-羟)乙基-雷帕霉素、40-o-(2-氨基乙基)-雷帕霉素、40-o-(2-乙酰氨基乙 基)-雷帕霉素、40-o-(2-尼克酰胺基乙基)氨基甲酸)-雷帕霉素、40-o-(2-(n-甲基 咪唑-2
’-
基乙氧羰基酰胺基)乙基)-雷帕霉素、40-o-(2-乙氧羰基氨基乙基)-雷帕霉 素、40-o-(2-甲苯基亚磺酰氨基乙基)-雷帕霉素和40-o-[2-(4’,5
’-
二羰乙氧基
ꢀ-1’
,2’,3
’-
三唑-1
’-
基)-乙基]-雷帕霉素。
[1180]
可用于本发明中的其他雷帕霉素类似物是这些类似物，其中雷帕霉素的环 己基环上的羟基和/或在28位置处的羟基替换为羟基酯基团，例如，us re44,768 中存在的雷帕霉素类似物，例如坦罗莫司。
[1181]
可用于前述发明中的其他雷帕霉素类似物包括那些类似物，其中在16位置 处的甲氧基替换为另一个取代基，优选地(任选地羟基取代的)炔氧基、苄基、邻 甲氧苄基或氯苄基和/或其中删除在39位置处的甲氧基连同39碳，从而雷帕霉素 的环己基环变成缺少39位置甲氧基的环戊基环；例如，如wo 95/16691和wo96/41807中所述，所述文献的内容通过引用的方式并入。可以进一步修饰类似物， 从而在雷帕霉素的40位置处的羟基被烷基化和/或32-羰基被还原。
[1182]
来自wo 95/16691的雷帕霉素类似物包括但不限于16-去甲氧基-16-(戊-2-炔 基)氧-雷帕霉素、16-去甲氧基-16-(丁-2-炔基)氧-雷帕霉素、16-去甲氧基-16-(炔 丙基)氧-雷帕霉素、16-去甲氧基-16-(4-羟-丁-2-炔基)氧-雷帕霉素、16-去甲氧基
ꢀ-
16-苄氧基-40-o-(2-羟乙基)-雷帕霉素、16-去甲氧基-16-苄氧基-雷帕霉素、16
-ꢀ
去甲氧基-16-邻-甲氧苄基-雷帕霉素、16-去甲氧基-40-o-(2-甲氧乙基)-16-戊-2
-ꢀ
炔基)氧-雷帕霉素、39-去甲氧基-40-去氧-39-甲酰基-42-去甲-雷帕霉素、39-去甲 氧基-40-去氧-39-羟甲基-42-去甲-雷帕霉素、39-去甲氧基-40-去氧-39-羧基-42
-ꢀ
去甲-雷帕霉素、39-去甲氧基-40-去氧-39-(4-甲基-哌嗪-1-基)羰基-42-去甲-雷帕 霉素、39-去甲氧基-40-去氧-39-(吗啉-4-基)羰基-42-去甲-雷帕霉素、39-去甲氧 基-40-去氧-39-[n-甲基,n-(2-吡啶-2-基-乙基)]氨甲酰基-42-去甲-雷帕霉素和39
-ꢀ
去甲氧基-40-去氧-39-(对甲苯磺酰腙甲基)-42-去甲-雷帕霉素。
[1183]
来自wo 96/41807的雷帕霉素类似物包括但不限于32-去氧-雷帕霉素、 16-o-戊-2-炔基-32-去氧-雷帕霉素、16-o-戊-2-炔基-32-去氧-40-o-(2-羟-乙基)
-ꢀ
雷帕霉素、16-o-戊-2-炔基-32-(s)-二氢-40-o-(2-羟乙基)-雷帕霉素、32(s)-二氢
ꢀ-
40-o-(2-甲氧基)乙基-雷帕霉素和32(s)-二氢-40-o-(2-羟乙基)-雷帕霉素。
[1184]
另一个合适的雷帕霉素类似物是如us 2005/0101624中所述的咗他莫司，所 述文献的内容通过引用的方式并入。
[1185]
rad001，另外称作依维莫司具有化学名称 (1r,9s,12s,15r,16e,18r,19r,21r,23s,24e,26e,28e,30s,32s,35r)-1,18-二羟
ꢀ-
12-{(1r)-2-[(1s,3r,4r)-4-(2-羟乙氧基)-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙基}-19,30-二 甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-11,36-二氧杂-4-氮杂-三环并[30.3.1.04,9]三十 七碳-16,24,26,28-四烯-2,3,10,14,20-五酮。
[1186]
变构性mtor抑制剂的其他例子包括西罗莫司(sirolimus)(雷帕霉素、 ay-22989)、40-[3-羟-2-(羟甲基)-2-甲基丙酸酯]-雷帕霉素(也称作坦罗莫司或 cci-779)和地磷莫司(ap-23573/mk-8669)。变构性mtor抑制剂的其他例子包 括佐他莫司(abt578)和咗他莫司。
[1187]
备选地或额外地，已经发现atp-竞争性催化性mtor抑制剂直接靶向 mtor激酶结构域并靶向mtorc1和mtorc2二者。也有比这类变构性mtor 抑制剂如雷帕霉素更有效的mtorc1抑制剂，因为它们调节雷帕霉素耐药性 mtorc1输出，如4ebp1-t37/46磷酸化和帽依赖性翻译。
[1188]
催化性抑制剂包括：bez235或2-甲基-2-[4-(3-甲基-2-氧代-8-喹啉-3-基-2,3
-ꢀ
二氢-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-苯基]-丙腈或单甲苯磺酸盐形式(bez235的合成 在wo 2006/122806中描述；ccg168(另外称作azd-8055，chresta,c.m.等人, cancer res,2010,70(1),288-298)；其具有化学名称{5-[2,4-双-((s)-3-甲基-吗啉
ꢀ-
4-基)-吡啶并[2,3d]嘧啶-7-基]-2-甲氧基-苯基}-甲醇；3-[2,4-双[(3s)-3-甲基吗啉
ꢀ-
4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基]-n-甲基苯甲酰胺(wo 09104019)；3-(2-氨基苯并[d] 唑-5-基)-1-异丙基-1h-吡唑[3,4-d]嘧啶-4-胺(wo 10051043和wo2013023184)；a n-(3-(n-(3-((3,5-二甲氧苯基)氨基)喹啉-2-基)氨磺酰)苯基)-3
-ꢀ
甲氧基-4-甲基苯甲酰胺(wo 07044729和wo 12006552)；pki-587(venkatesan, a.m.,j.med.chem.,2010,53,2636-2645)，其具有化学名称1-[4-[4-(二甲基氨基) 哌啶-1-羰基]苯基]-3-[4-(4,6-二吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]脲；gsk-2126458 (acs med.chem.lett.,2010,1,39-43)，其具有化学名称2,4-二氟-n-{2-甲氧基
ꢀ-
5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺；5-(9-异丙基-8-甲基-2-吗啉代
ꢀ-
9h-嘌呤-6-基)嘧啶-2-胺(wo 10114484)；和(e)-n-(8-(6-氨基-5-(三氟甲基)吡啶
ꢀ-
3-基)-1-(6-(2-氰丙-2-基)吡啶-3-基)-3-甲基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-2(3h)-亚基)单 氰胺(wo 12007926)。
[1189]
催化性mtor抑制剂的其他例子包括8-(6-甲氧基-吡啶-3-基)-3-甲基-1-(4
-ꢀ
哌嗪-1-基-3-三氟甲基-苯基)-1,3-二氢-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-酮(wo 2006/122806) 和ku-0063794(garcia-martinez jm等人,biochem j.,2009,421(1),29-42)。 ku-0063794是雷帕霉素的哺乳动物靶(mtor)的特异性抑制剂。wye-354是催 化性mtor抑制剂的另一个例子(yu k等人,(2009).biochemical,cellular,andin vivo activity of novel atp-competitive and selective inhibitors of themammalian target of rapamycin.cancer res.69(15):6232-6240)。
[1190]
根据本发明可用的mtor抑制剂还包括前述任一者的前药、衍生物、可药 用盐或其类似物。
[1191]
可以配制mtor抑制剂，如rad001，以基于本文所述的特定剂量，基于本 领域充分建立的方法递送。特别地，美国专利号6,004,973(通过引用的方式并入 本文)提供了随本文所述的mtor抑制剂可用的制剂的例子。
[1192]
评价car有效性或样品适宜性的方法和生物标志物
[1193]
在另一个方面，本发明的特征在于一种评价或监测表达car的细胞疗法(例 如，cd123 car疗法)在受试者(例如，患有癌症(例如，血液癌症)的受试者)中 的有效性或car疗法(例如，cd123 car疗法)用样品的适宜性(例如，单采样 品)的方法。该方法包括获得car疗法有效性或样品适宜性的值，其中所述值 表示表达car的细胞疗法的有效性或适宜性。
[1194]
在实施方案中，car疗法有效性或样品适宜性的值包括测量以下一项、两 项、三项、四项、五项、六项或更多项(全部项)：
[1195]
(i)样品(例如，单采样品或生产的表达car的细胞产物样品)中以下一者、 两者、三者或更多者(例如，全部)的水平或活性：静息型t
eff
细胞、静息型t
reg
细胞、较年轻的t细胞(例如，较年轻的的cd4细胞或cd8细胞、或γ/δt细 胞)或早期记忆t细胞或它们的组合；
[1196]
(ii)样品(例如，单采样品或生产的表达car的细胞产物样品)中以下一者、 两者、
三者或更多者(例如，全部)的水平或活性：活化型t
eff
细胞、活化型t
reg
细胞、较年老的t细胞(例如，较年老的cd4细胞或cd8细胞)或晚期记忆t 细胞或其组合；
[1197]
(iii)样品(例如，单采样品或生产的表达car的细胞产物样品)中免疫细胞 消耗标志物，例如，一种、两种或更多种免疫检查点抑制物(例如，pd-1、pd-l1、 tim-3和/或lag-3)的水平或活性。在一个实施方案中，免疫细胞具有消耗表 型，例如，共表达至少两个消耗标志物，例如，共表达pd-1和tim-3。在其他 实施方案中，免疫细胞具有消耗表型，例如，共表达至少两个消耗标志物，例 如，共表达pd-1和lag-3。
[1198]
(iv)样品(例如，单采样品或生产的表达car的细胞产物样品)中cd27和/ 或cd45ro-(例如，cd27+cd45ro-)免疫效应细胞例如在cd4+或cd8+t细 胞群体中的水平或活性；
[1199]
(v)1、2、3、4、5、10、20或更多种选自ccl20、il-17a和/或il-6、pd-1、 pd-l1、lag-3、tim-3、cd57、cd27、cd122、cd62l、klrg1的生物标 记物的水平或活性；
[1200]
(vi)表达car的细胞产物样品(例如，表达cd123的细胞产物样品)中的细 胞因子水平或活性(例如，细胞因子库的质量)；或
[1201]
(vii)生产的表达car的细胞产物样品中表达car的细胞的转导效率。
[1202]
在本文所公开的任何方法的一些实施方案中，表达car的细胞疗法包含多 个表达car的免疫效应细胞(例如，群体)，例如，多个t细胞或nk细胞(例 如，群体)，或其组合。在一个实施方案中，表达car的细胞疗法是cd123 car 疗法。
[1203]
在本文所公开的任何方法的一些实施方案中，(i)-(vii)中一者或多者的测量 从获自受试者的单采样品获得。可以在输注或回输之前评价单采样品。
[1204]
在本文所公开的任何方法的一些实施方案中，(i)-(vii)中一者或多者的测量 从生产的表达car的细胞产物样品(例如，表达cd123 car的细胞产物样品) 获得。可以在输注或回输之前评价生产的表达car的细胞产物。
[1205]
在本文所公开的任何方法的一些实施方案中，在接受表达car的细胞疗法 之前、接受期间或接受之后评价受试者。
[1206]
在本文所公开的任何方法的一些实施方案中，(i)-(vii)中一者或多者的测量 评价了一种或多种基因表达、流式细胞术或蛋白质表达的特征。
[1207]
在本文所公开的任何方法的一些实施方案中，该方法还包括基于(i)-(vii)中 一者或多者的测量，将受试者鉴定为反应者、非反应者、复发者或非复发者。
[1208]
在本文所公开的任何方法的一些实施方案中，如与非反应者相比，反应者 (例如，完全反应者)具有或经鉴定为具有gzmk、ppf1bp2或原初t细胞中一 者、两者或更多者(全部)的更高水平或活性。
[1209]
在本文所公开的任何方法的一些实施方案中，如与反应者相比，非反应者 具有或经鉴定为具有il22、il-2ra、il-21、irf8、il8、ccl17、ccl22、 效应t细胞或调节性t细胞中一者、两者、三者、四者、五者、六者、七者、 或更多者(例如，全部)的更高水平或活性。
[1210]
在一个实施方案中，复发者是这样的患者，所述患者与非复发者相比具有 或经鉴定为具有增加的以下一个或多个(例如，2、3、4个或全部)基因表达水 平：mir199a1、mir1203、uc021ovp、itm2c和hla-dqb1和/或与非复发 者相比具有或经鉴定为具有减少的以下一个或多个(例如，2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11个或全部)基因表达水平：ppial4d、
ttty10、 txlng2p、mir4650-1、kdm5d、usp9y、prky、rps4y2、rps4y1、 ncrna00185、sult1e1和eif1ay。
[1211]
在本文所公开的任何方法的一些实施方案中，与参比值(例如，非反应者 cd8+t细胞百分数)相比，完全反应者具有或经鉴定为具有更大(例如，统计显 著更大)的cd8+t细胞百分数。
[1212]
在本文所公开的任何方法的一些实施方案中，与参比值(例如，非反应者 cd27+cd45ro-免疫效应细胞数目)相比，完全反应者具有或经鉴定为具有例 如在cd8+群体中更大的cd27+cd45ro-免疫效应细胞百分数。
[1213]
在本文所公开的任何方法的一些实施方案中，与参比值(例如，非反应者 cd4+t细胞百分数)相比，完全反应者或部分反应者具有或经鉴定为具有更大 (例如，统计显著更大)的cd4+t细胞百分数。
[1214]
在本文所公开的任何方法的一些实施方案中，与参比值(例如，非反应者的 静息型t
eff
细胞、静息型t
reg
细胞、较年轻的t细胞(例如，较年轻的的cd4 细胞或cd8细胞)或早期记忆t细胞数目)相比，完全反应者具有或经鉴定为具 有以下一者、两者、三者或更多者(例如，全部)的更大百分数：静息型t
eff
细 胞、静息型t
reg
细胞、较年轻的t细胞(例如，较年轻的的cd4细胞或cd8 细胞、或γ/δt细胞)或早期记忆t细胞或它们的组合；
[1215]
在本文所公开的任何方法的一些实施方案中，与参比值(例如，反应者的活 化型t
eff
细胞、活化型t
reg
细胞、较年老的t细胞(例如，较年老的cd4细胞 或cd8细胞)或晚期记忆t细胞数目)相比，非反应者具有或经鉴定为具有以下 一者、两者、三者或更多者(例如，全部)的更大百分数：活化型t
eff
细胞、活 化型t
reg
细胞、较年老的t细胞(例如，较年老的cd4细胞或cd8细胞)或晚 期记忆t细胞或它们的组合。
[1216]
在本文所公开的任何方法的一些实施方案中，非反应者具有或经鉴定为具 有更大百分数的免疫细胞消耗标志物，例如，一种、两种或更多种免疫检查点 抑制物(例如，pd-1、pd-l1、tim-3和/或lag-3)。在一个实施方案中，与来 自反应者的表达pd-1或lag-3的免疫效应细胞的百分数相比，非反应者具有 或经鉴定为具有更大的表达pd-1，pd-l1，或lag-3的免疫效应细胞(例如， cd4+t细胞和/或cd8+t细胞)(例如，表达car的cd4+细胞和/或cd8+t细 胞)的百分数。
[1217]
在一个实施方案中，非反应者具有或经鉴定为具有更大的具有消耗表型的 免疫细胞(例如，共表达至少两种消耗标志物(例如，共表达pd-1、pd-l1和/或 tim-3)的免疫细胞)的百分数。在其他实施方案中，非反应者具有或经鉴定为具 有更大的具有消耗表型的免疫细胞(例如，共表达至少两种消耗标志物(例如，共 表达pd-1和lag-3)的免疫细胞)的百分数。
[1218]
在本文所公开的任何方法的一些实施方案中，与表达car的细胞疗法的反 应者(例如，完全反应者)相比，非反应者在表达car的细胞群体(例如，cd123 car+细胞群体)中具有或经鉴定为具有更大的pd-1/pd-l1+/lag-3+细胞百分 数。
[1219]
在本文所公开的任何方法的一些实施方案中，部分反应者在表达car的细 胞群体(例如，cd123 car+细胞群体)中具有或经鉴定为具有比反应者更高的 pd-1/pd-l1+/lag-3+细胞百分数。
[1220]
在本文所公开的任何方法的一些实施方案中，非反应者在表达car的细胞 群体
(例如，cd123 car+细胞群体)中具有或经鉴定为具有pd1/pd-l1+car+ 消耗表型和lag3的共表达。
[1221]
在本文所公开的任何方法的一些实施方案中，与反应者(例如，完全反应者) 相比，非反应者在表达car的细胞群体(例如，cd123 car+细胞群体)中具有 或经鉴定为具有更大的pd-1/pd-l1+/tim-3+细胞百分数。
[1222]
在本文所公开的任何方法的一些实施方案中，部分反应者在表达car的细 胞群体(例如，cd123 car+细胞群体)中具有或经鉴定为具有比反应者更高的 pd-1/pd-l1+/tim-3+细胞百分数。
[1223]
在本文所公开的任何方法的一些实施方案中，单采样品中存在的cd8+ cd27+cd45ro-t细胞是受试者对表达car的细胞疗法(例如，cd123 car疗 法)反应的阳性预测指标。
[1224]
在本文所公开的任何方法的一些实施方案中，单采样品中pd1+car+和 lag3+或tim3+t细胞的高百分数是受试者对表达car的细胞疗法(例如， cd123 car疗法)反应的不良预后预测指标。
[1225]
在本文所公开的任何方法的一些实施方案中，反应者(例如，完全或部分反 应者)具有以下一项、两项、三项或更多项(或全部)特征：
[1226]
(i)与参比值(例如，非反应者cd27+免疫效应细胞数目)相比，具有更大的 cd27+免疫效应细胞数目；
[1227]
(ii)与参比值(例如，非反应者cd8+t细胞数目)相比，具有更大的cd8+t 细胞数目；
[1228]
(iii)与参比值相比(例如，非反应者的表达一种或多种检查点抑制物的免疫 细胞数目)，具有较低数目的表达一种或多种检查点抑制物(例如，选自pd-1、 pd-l1、lag-3、tim-3或klrg-1，或它们的组合的检查点抑制物)的免疫细 胞；或
[1229]
(iv)与参比值(例如，非反应者的静息型t
eff
细胞、静息型t
reg
细胞、原初 cd4细胞、未刺激的记忆细胞或早期记忆t细胞数目)相比，具有以下一者、两 者、三者或更多者(例如，全部)的更大百分数：静息型t
eff
细胞、静息型t
reg
细胞、原初cd4细胞、未刺激的记忆细胞或早期记忆t细胞或其组合。
[1230]
在本文所公开的任何方法的一些实施方案中，(vi)的细胞因子水平或活性选 自细胞因子ccl20/mip3a、il17a、il6、gm-csf、ifnγ、il10、il13、il2、 il21、il4、il5、il9或tnfα或其组合中的一者、两者、三者、四者、五者、 六者、七者、八者或更多者(例如，全部)。细胞因子可以选自il-17a、ccl20、 il2、il6或tnfα中的一者、两者、三者、四者或更多者(例如，全部)。在一 个实施方案中，增加的细胞因子水平或活性选自il-17a和ccl20中的一者或 两者，表示反应性增加或复发减少。
[1231]
在本文所公开的任何方法的一些实施方案中，在(vii)中15％或更高的转导 效率表示反应性增加或复发减少。
[1232]
在本文所公开的任何方法的一些实施方案中，在(vii)中小于15％的转导效 率表示反应性减少或复发增加。
[1233]
在实施方案中，可以根据临床标准进一步评价借助本文方法鉴定的反应者、 非反应者、复发者或非复发者。例如，完全反应者具有或经鉴定为对治疗显示 出完全反应(例
如，完全缓解)的患有疾病(例如，癌症)的受试者。如本文所述， 可以例如使用或cheson等人,j clin oncol 17:1244(1999)和 cheson等人,“revised response criteria for malignant lymphoma”,j clinoncol 25:579-586(2007)(所述两份文献均通过引用的方式完整并入本文)，鉴定完 全反应。部分反应者具有或经鉴定为对治疗显示出部分反应(例如，部分缓解) 的患有疾病(例如，癌症)的受试者。可以例如，使用或如本文所述 的cheson标准鉴定部分反应。非反应者具有或经鉴定为患有对治疗不显示出反 应的患有疾病(例如，癌症)的受试者，例如，该患者具有稳定病情或进行性病情。 可以例如，使用或如本文所述的cheson标准鉴定非反应者。
[1234]
备选地或与本文所公开的方法组合时，响应于所述值，进行以下一项、两 项、三项、四项或更多项：
[1235]
例如向反应者或非复发者实施表达car的细胞疗法；
[1236]
实施改变给药的表达car的细胞疗法；
[1237]
改变表达car的细胞疗法的方案或时间过程；
[1238]
例如向非反应者或部分反应者施用与表达car的细胞疗法(例如，检查点 抑制物，例如，本文所述的检查点抑制物)组合的额外药物；
[1239]
向非反应者或部分反应者实施在表达car的细胞疗法治疗之前增加受试 者中较年轻的t细胞数目的疗法；
[1240]
例如，针对鉴定为非反应者或部分反应者的受试者，调整表达car的细胞 疗法的生产工艺，例如，在引入编码car的核酸之前富集较年轻的t细胞， 或增加转导效率；
[1241]
例如，针对非反应者或部分反应者或复发者，实施替代疗法；或
[1242]
如果受试者是或经鉴定为非反应者或复发者，减少t
reg
细胞群体和/或t
reg
基因特征标识，例如，通过一种或多种cd25消耗，施用环磷酰胺、抗gitr 抗体或其组合做到。
[1243]
在某些实施方案中，用抗gitr抗体预治疗受试者。在某个实施方案中， 在输注或回输之前用抗gitr抗体治疗受试者。
[1244]
生物聚合物递送方法
[1245]
在一些实施方案中，一种或多种如本文中公开的表达car的细胞可以通过 生物聚合物支架，例如，生物聚合物植入物施用或递送至受试者。生物聚合物 支架可以支持或增强本文所述的表达car的细胞的递送、扩充和/或分散。生物 聚合物支架包含可以是天然存在或合成的生物相容性(例如，基本上不诱导炎性 反应或免疫应答)和/或生物可降解性聚合物。
[1246]
合适的生物聚合物的例子包括但不限于单独或按任何浓度和以任何比率与 任何其他聚合物组分组合的琼脂、琼脂糖、藻酸盐、藻酸盐/磷酸钙粘固剂(cpc)、 β-半乳糖苷酶(β-gal)、(1,2,3,4,6-五乙酰a-d-半乳糖)、纤维素、壳多糖、壳聚 糖、胶原蛋白、弹性蛋白、明胶、透明质酸胶原蛋白、羟基磷灰石、聚(3-羟丁 酸酯-共-3-羟-己酸酯)(phbhhx)、聚(丙交酯)、聚(己内酯)(pcl)、聚(丙交酯
-ꢀ
共-乙交酯)(plg)、聚环氧乙烷(peo)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(plga)、聚环氧丙 烷(ppo)、聚乙烯醇)(pva)、丝、大豆蛋白和大豆蛋白分离物。可以用促进黏附 或移行促进的分子(例如，与淋巴细胞的胶原蛋白受体结合的胶原蛋白拟似肽和 /或增强待递送细胞的递送、扩充或功能(例如，抗癌活性)的刺激分子)增强或修 饰
生物聚合物。生物聚合物支架可以是可注射物，例如，凝胶或半固体，或固 态组合物。
[1247]
在一些实施方案中，将本文所述的表达car的细胞铺种到生物聚合物支架 上，之后递送至受试者。在实施方案中，生物聚合物支架还包含本文所述的一 种或多种额外治疗药(例如，另一表达car的细胞、抗体、或小分子)或增强表 达car的细胞活性的物质，例如，掺入支架的生物聚合物或与支架的生物聚合 物缀合。在实施方案中，将生物聚合物支架在肿瘤处或在足以介导抗肿瘤作用 的肿瘤附近注射(例如，瘤内注射)或手术植入。生物聚合物组合物和用于递送它 们的方法的额外例子在stephan等人,nature biotechnology,2015,33:97-101；和 wo 2014/110591中描述。
[1248]
药物组合物和治疗
[1249]
本发明的药物组合物可以包含与一种或多种药学或生理学可接受载体、稀 释剂或赋形剂组合的如本文所述的表达car的细胞，例如，多种表达car的细 胞。这类组合物可以包含缓冲液如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；糖如葡 萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗 氧化剂；螯合剂如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。在一 个方面，配制本发明的组合物以便静脉内施用。
[1250]
本发明的药物组合物可以按适于待治疗(或预防)疾病的方式施用。施用的量 和频率将由这类因素决定，如患者的状况和患者疾病的类型和严重性，不过适 宜的剂量可以通过临床试验确定。
[1251]
在一个实施方案中，药物组合物基本上不含(例如，不存在)可检测水平的杂 质，例如，所述杂质选自内毒素、支原体(mycoplasma)、有复制能力的慢病毒 (rcl)、p24、vsv-g核酸、hiv gag、残余抗cd3/抗cd28包被的珠、小鼠抗体、 汇集的人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、载体包装细胞或质粒组 分、细菌和真菌。在一个实施方案中，细菌是选自以下的至少一种：粪产碱杆 菌(alcaligenes faecalis)、白假丝酵母(candida albicans)、大肠杆菌(escherichia coli)、流感嗜血杆菌(haemophilus influenza)、脑膜炎奈瑟球菌(neisseria meningitides)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌 (staphylococcus aureus)、肺炎链球菌(streptococcus pneumonia)和化脓性链球 菌(streptococcus pyogenes)a群。
[1252]
当指出“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时， 待施用的本发明组合物的精确量可以由医师在考虑年龄、体重、肿瘤尺寸、感 染或转移程度和患者(受试者)状况的个体差异时确定。通常可以声称，本文所述 的包含t细胞的药物组合物可以按104至109个细胞/kg体重，在一些情况下105至 106个细胞/kg体重(包括这些范围内部的全部整数值)的剂量施用。也可以按这些 剂量施用t细胞组合物多次。细胞可以通过使用免疫疗法中公知的输注技术施用 (参见，例如，rosenberg等人,new eng.j.of med.319:1676,1988)。
[1253]
在一些实施方案中，car细胞(例如，cd123 car细胞)的剂量包含约1x 106、1.1x106、2x106、3.6x106、5x106、1x107、1.8x107、2x107、5x107、 1x108、2x108或5x108个细胞/kg。在一些实施方案中，car细胞(例如，cd123 car细胞)的剂量包含至少约1x106、1.1x106、2x106、3.6x106、5x106、1x 107、1.8x107、2x107、5x107、1x108、2x108或5x108个细胞/kg。在一些实 施方案中，car细胞(例如，cd123 car细胞)的剂量包含多至约1x106、1.1 x106、2x106、3.6x106、5x106、1x107、1.8x107、2x107、5x107、1x108、 2x108或5x108个细胞/kg。在一些实施
方案中，car细胞(例如，cd123 car 细胞)的剂量包含约1.1
×
10
6-1.8
×
107个细胞/kg。在一些实施方案中，car细 胞(例如，cd123 car细胞)的剂量包含约1x107、2x107、5x107、1x108、 2x108、5x108、1x109、2x109或5x109个细胞。在一些实施方案中，car细 胞(例如，cd123 car细胞)的剂量包含至少约1x107、2x107、5x107、1x108、 2x108、5x108、1x109、2x109或5x109个细胞。在一些实施方案中，car细 胞(例如，cd123 car细胞)的剂量包含多至约1x107、2x107、5x107、1x108、 2x108、5x108、1x109、2x109或5x109个细胞。
[1254]
细胞可以通过使用免疫疗法中公知的输注技术施用(参见，例如，rosenberg 等人,new eng.j.of med.319:1676,1988)。
[1255]
在某些方面，可以需要施用活化的t细胞至受试者并且随后接着回抽血液 (或进行单采血液成分术)，根据本发明活化来自其中的t细胞并向患者回输这些 活化和扩充的t细胞。这个过程可以每数周实施多次。在某些方面，可以活化来 自10cc至400cc抽血的t细胞。在某些方面，活化来自20cc、30cc、40cc、50cc、 60cc、70cc、80cc、90cc或100cc抽血的t细胞。
[1256]
施用受试者的组合物可以按任何便利方式实施，包括气溶胶吸入、注射、 摄入、输血、植入或移植。本文所述的组合物可以经动脉、皮下、真皮内、瘤 内、淋巴结内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射、或腹腔内施用至患者。在 一个方面，通过真皮内或皮下注射向患者施用本发明的表达car的细胞(例如 t细胞或nk细胞)的组合物。在一个方面，通过静脉内注射施用本发明表达car 的细胞(例如，t细胞或nk细胞)组合物。可以将表达car的细胞(例如，t细胞 或nk细胞)的组合物直接注射至肿瘤、淋巴结或感染部位中。
[1257]
在一个特定的示例性方面，受试者可以接受白细胞去除术，其中将白细胞 收集、富集或离体消耗以选择和/或分离目的细胞，例如，免疫效应细胞(例如， t细胞或nk细胞)。可以通过本领域已知的方法扩充和处理这些免疫效应细胞 (例如，t细胞或nk细胞)分离物，从而可以引入本发明的一个或多个car构建 体，因而产生本发明表达car的细胞(例如，car t细胞或表达car的nk细胞)。 有需求的受试者可以随后接受高剂量化疗的标准治疗，接着进行外周血干细胞 移植。在某些方面，在移植后或与移植同时地，受试者接受扩充的本发明表达 car的细胞(例如，car t细胞或表达car的nk细胞)的输注。在一个额外的方 面，将扩充的细胞在手术前或在之后施用。
[1258]
待施用至患者的上述疗法的剂量将随正在治疗的病症的确切性质和治疗的 接受者变动。可以根据本领域接受的惯例进行人类施用剂量的放大。对于成年 患者，campath的剂量例如通常将在1至约100mg范围内，通常每日施用1天 和30天之间的时间。优选的每日剂量是1至10mg每日，不过在一些情况下，使 用多达每日40mg的更大剂量(美国专利号6,120,766中所述)。
[1259]
在一个实施方案中，将car引入免疫效应细胞(例如，t细胞或nk细胞)中， 例如，使用体外转录引入，并且受试者(例如，人)接受初始施用本发明的表达 car的细胞(例如，car t细胞或表达car的nk细胞)以及一次或多次后续施用 本发明的表达car的细胞(例如，car t细胞或表达car的nk细胞)，其中一次 或多次后续施用是先前施用后少于15天，例如，14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天施用。在一个实施方案中，将本发明的表达car的细胞(例如， car t细胞或表达car的nk细胞)每周多于一次施用至受试者(例如，人)，例如， 将本发明表达car的细胞(例如，car t细胞或表达car的nk细胞)每周2、3、 或4次施用。在一个
实施方案中，受试者(例如，人类受试者)每周接受表达car 的细胞(例如，car t细胞或表达car的nk细胞)的多于一次的施用(例如，每周 2、3或4次施用)(本文也称作一个周期)，随后一周不施用表达car的细胞(例如， car t细胞或表达car的nk细胞)，并且随后将表达car的细胞(例如，car t 细胞或表达car的nk细胞)一次或多次额外施用(例如，每周多于一次施用表达 car的细胞(例如，car t细胞或表达car的nk细胞))施用至受试者。在另一 个实施方案中，受试者(例如，人类受试者)接受多于一个周期的表达car的细 胞(例如，car t细胞或表达car的nk细胞)并且每个周期之间的时间少于10、 9、8、7、6、5、4或3天。在一个实施方案中，表达car的细胞(例如，car t 细胞或表达car的nk细胞)每隔1日施用，每周施用3次。在一个实施方案中， 将本发明的表达car的细胞(例如，car t细胞或表达car的nk细胞)施用至少 二、三、四、五、六、七、八或更多周。
[1260]
在一个方面，使用慢病毒载体(如慢病毒)生成表达cd123 car的细胞(例 如，car t细胞或表达car的nk细胞)。以这种方式生成的表达car的细胞(例 如，car t细胞或表达car的nk细胞)具有稳定的car表达。
[1261]
在一个方面，使用病毒载体(如γ逆转录病毒载体，例如，本文所述的γ逆转 录病毒载体)生成表达car的细胞，例如，cart或表达car的nk细胞。使用 这些载体生成的表达car的细胞，例如cart或表达car的nk细胞可以具有稳 定的car表达。
[1262]
在一个方面，表达car的细胞(例如，car t细胞或表达car的nk细胞) 在转导后瞬时表达car载体4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15天。 可以通过递送rna car载体实现car的瞬时表达。在一个方面，将car rna 通过电穿孔法转导入细胞(例如，t细胞或nk细胞)中。
[1263]
使用瞬时表达car的细胞(例如，car t细胞或表达car的nk细胞)(尤其 用携带鼠scfv的car)治疗的患者中可出现的潜在问题是多次治疗后的变态反 应。
[1264]
在不受这个理论约束的情况下，认为这种变态反应可能由患者形成抗car 体液应答(即，具有抗ige同种型的抗car抗体)引起。认为当存在10至14天抗原 暴露间断期的情况下，产生抗体的患者细胞发生从(不引起变态反应的)igg同种 型至ige同种型的类别转换。
[1265]
如果患者在短暂car疗法(如由rna转导产生的那些)过程期间面临产生抗 car抗体反应的高风险，表达car的细胞(例如，car t细胞或表达car的nk 细胞)输注间断期不应当持续超过10至14天。
实施例
[1266]
通过参考以下实验实施例进一步详述本发明。除非另外说明，否则仅出于 说明目的提供这些实施例并且它们不意在起到限制作用。因此，本发明无论如 何不应当解释为受以下实施例限制，反而应当解释为涵盖因本文提供的教授内 容变得显而易见的任何和全部变型。
[1267]
在不进一步描述的情况下，认为使用前文描述和以下示意性实施例，本领 域普通技术人员可以制得并利用本发明的化合物并实施要求保护的方法。以下 工作实施例具体地指出本发明的多个方面并且不得解释为以任何方式限制本公 开的剩余部分。
[1268]
实施例1：人car构建体
[1269]
分离完全人抗cd123单链可变片段。将抗cd123 scfv克隆到具有cd3ζ 链和4-1bb共刺激分子的慢病毒car表达载体中。通过在stbl3细胞中的细 菌转化扩增含有car的质粒
(“发明详述”中提供的表1)，随后使用无内毒 素的qiagen plasmid maki试剂盒的maxiprep。使用标准技术在293t细胞中 产生慢病毒上清液。
[1270]
vl和vh结构域在scfv中出现的顺序是不同的(即，vl-vh或vh-vl 取向)，并且其中三个或四个拷贝的“g4s”(seq id no：25)亚单位，其 中每个亚单位包含序列ggggs(seq id no：25)(例如，(g4s)3(seq id no：28)或(g4s)4(seq id no：27))，连接可变结构域以产生整个scfv 结构域，如表2(在“发明详述”中提供)所示。
[1271]
car构建体的序列及其结构域序列在“发明详述”中列出。人car构建 体的分析如在例如实施例2、3和6中所描述的进行。
[1272]
实施例2：具有人scfv的cart的分析和体外活性
[1273]
使用含有由nfat启动子驱动的萤光素酶报告基因的jurkat细胞系(称为 jnl细胞)评估人抗cd123 car构建体的活性。测量本文所述的四个人car 构建体(cd123 car1-4)和鼠cd123 car构建体1172和1176的cd123 car 活性。以下提供1172和1176构建体的氨基酸序列，并进一步描述和表征在 pct/us2014/017328中。
[1274]
1172构建体:cd123 4-1bbcd3z-car(氨基酸序列)(seq id no:707)
[1275]
malpvtalllplalllhaarpgsdivltqspaslavslgqratiscrasesvdnygntfmhwyqqkpgq ppklliyrasnlesgiparfsgsgsrtdftltinpveaddvatyycqqsnedpptfgagtklelkggggsg gggssgggsqiqlvqsgpelkkpgetvkisckasgyiftnygmnwvkqapgksfkwmgwintytgest ysadfkgrfafsletsastaylhindlknedtatyfcarsggydpmdywgqgtsvtvssassgtttpap rpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkll yifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvl dkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtyd alhmqalppr
[1276]
1176构建体:cd123 4-1bbcd3z-car(26292)(氨基酸序列)(seq id no:708)
[1277]
malpvtalllplalllhaarpgsdvqitqspsylaaspgetitincrasksiskdlawyqekpgktnklli ysgstlqsgipsrfsgsgsgtdftltisslepedfamyycqqhnkypytfgggtkleikggggsggggssg ggsqvqlqqpgaelvrpgasvklsckasgytftsywmnwvkqrpdqglewigridpydsethynqkfk dkailtvdkssstaymqlssltsedsavyycargnwddywgqgttltvssassgtttpaprpptpaptia sqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmr pvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpe mggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalpp r
[1278]
car活性测量为该nfat驱动的报告基因的活化。将含有cart构建体 的慢病毒上清液加入到jnl细胞中用于转导。转导后4-6天，通过如下所述的 facs评估jnl细胞的car表达，或者将转导后的jnl细胞与靶阳性细胞系 (molm3，工程化为表达cd123的k562细胞(cd123-k562))或靶阴性细 胞系(k562)以效应细胞(jnl)对靶细胞系(e:t)的比率为3:1混合，以触 发活化(图1)。在共孵育20小时后，使用envision仪器上的bright-glo
tm
萤光素酶测定法测量萤光素酶信号，如图2所示。
[1279]
基于在对表达cd123的(“cd123+)的靶的应答中，cd123 car转导的 t细胞(“cart-cd123”或“cart-cd123t细胞”)的效应t细胞应答的 数量和质量，选择最优的抗cd123 car构建体。效应t细胞应答包括但不限 于细胞扩充、增殖、倍增、细胞因子产生和靶细胞杀伤或溶细胞活性(脱颗粒)。
[1280]
cart-cd123的产生
[1281]
使用编码人scfv的慢病毒转移载体来产生包装在vsvg假型的慢病毒颗粒 中的基因组物质。将慢病毒转移载体dna与三种包装组分vsvg、gag/pol和 rev以及脂质转染胺试剂混合，以将它们一起转染到lenti-x 293t细胞 (clontech)中。
[1282]
30小时后，收集培养基，过滤并在-80℃保存。通过以来自正常单采血供体 (apheresed donor)的血液开始产生治疗性cart-cd123，其中通过负选择t 细胞、cd4+和cd8+淋巴细胞获得这些供体的原初t细胞。这些细胞在rpmi 1640中，10％热灭活的胎牛血清(fcs)、2mm l-谷氨酰胺、1
×
青霉素/链霉 素、100μm非必需氨基酸、1mm丙酮酸钠、10mm hepes和55μm 2-巯基乙 醇在37℃、5％co2下，由cd3
×
28珠(human t-expandercd3/cd28,invitrogen)以1:3的比率活化。t细胞以1
×
106个t细胞在24孔 板、每孔0.5ml培养基中培养。24小时后，将t细胞母细胞化(blasting)， 并加入0.5ml病毒上清液。然后t细胞开始以对数生长模式分裂，通过测量每 ml的细胞计数来监测t细胞的分裂，并且每两天将t细胞在新鲜培养基中稀 释。由于t细胞在约10天后开始静止，对数生长减弱。减慢生长速率和t细 胞大小接近～300fl的组合确定了被冷冻保存用于以后分析的t细胞状态。
[1283]
在冷冻保存之前，使用蛋白l作为检测试剂，通过在bd lsrfortessa或 bd-facscanto上的流式细胞术分析来测定转导的细胞百分比(在细胞表面上 表达抗cd123 car)及它们的相对荧光强度。来自该facs的针对未染色细胞 上方的信号的相对荧光强度的门控直方图显示了转导的t细胞的百分比。转导 导致cart阳性细胞的范围为12-42％，如图2所示。
[1284]
评估cart-cd123重定向t细胞的溶细胞活性
[1285]
为了评估cart-cd123t细胞杀伤表达靶的细胞的功能性能力，将细胞解 冻并允许过夜恢复。
[1286]
t细胞杀伤针对稳定表达萤光素酶的表达cd123的molm13急性髓性白 血病细胞系。未转导的t细胞用于测定非特异性背景杀伤水平。cart-cd123 的溶细胞活性测量为效应细胞:靶细胞比率为4:1和2倍向下稀释t细胞的滴度， 其中效应细胞定义为表达抗cd123嵌合受体的t细胞。通过将合适数量的t 细胞与恒定数目的靶细胞混合来开始测定。20小时后，使用envision仪器上的 bright-glo
tm
萤光素酶测定法测量萤光素酶信号。随着表达cd123-cart的细 胞与未转导的t细胞比率的增加，cd123细胞的杀伤也类似地增加。本文提供 的数据表明，表达cd123的那些细胞仅被表达cd123-cart的细胞破坏，而 不被未转导的t细胞破坏。图3。
[1287]
细胞因子产生
[1288]
为了测量cd123 cart细胞的细胞因子产生，解冻表达cd123-2、cd123-3 或cd123-4的细胞，并使其过夜恢复。使用表达同种型对照(称为“同种型”) 的t细胞作为背景t细胞效应的非特异性对照。t细胞针对molm13、pl21 或u87细胞(称为靶细胞)。如所述，该测定法测试效应细胞：靶比率为1.25:1 或20:1，其中效应细胞定义为表达cd123 car的t细胞。细胞混合后，运行 该测定法24小时，移走培养基用于分析细胞因子il-2(图24a)、ifn-γ(图 24b)和tnf-α(图24c)时，使用用于人细胞因子检测的cba-flex试剂盒。 当表达cd123 car的t细胞与表达cd123的癌细胞培养时，所有 cd123-cart响应表达靶的细胞产生细胞因子。
[1289]
实施例3：aml中的cart123
[1290]
t细胞转导
[1291]
选择人抗人cd123克隆nvs2(表达car123-2)、nvs3(表达car123-3)、 nvs4(表达car123-4)用于进一步研究。这些克隆都对食蟹猴cd123具有交 叉反应性。将它们的活性与小鼠克隆1172和1176进行比较，所述的小鼠克隆 1172和1176包含轻链至重链方向的vh和vl结构域与cd8铰链结构域、cd8 跨膜结构域和41bb-共刺激结构域。1176也对食蟹猴cd123交叉反应。1172 不是。
[1292]
将质粒转化到感受态细胞中，在500cc肉汤中生长，通过大量制备分离， 并使用标准方法转导到293t细胞中。在24和48小时收集慢病毒上清液，使用 超速离心浓缩，并冷冻。
[1293]
在supt1细胞上滴定慢病毒，并在moi为3时确定适当量的病毒用于原 代t细胞转导。使用抗cd3/cd28珠(dynal，invitrogen)和白细胞介素-2 100u/ml刺激原代正常供体cd4+cd8细胞6天，然后脱珠，并冷冻一次。t 细胞的细胞体积减小至<300fl(约10-12天后)。
[1294]
所有克隆的t细胞转导效率几乎为100％(图5a和5b)。在nvs克隆中 cd4:cd8比率为约1:1，在1172和1176克隆中为3:2(图6)。
[1295]
脱颗粒
[1296]
为了评估脱颗粒，将cart细胞(nvs 2-4、1172和1176克隆)解冻，在 t细胞培养基中以2e6个细胞/ml的浓度静置过夜。然后计数细胞，并在第二天 以1e6个细胞/ml重悬。将肿瘤靶细胞(tcm、pma/iono、molm14或jurkat) 以5e6个细胞/ml重悬。将细胞以1e5t细胞:5e5肿瘤细胞的比率在48孔板中铺 板，并在抗cd107a pecy7、抗cd49d纯化的和抗cd28纯化的抗体存在下孵 育2小时。然后收获细胞，用抗cd3apc染色，并使用bd lsr fortessa获取 (图7)。
[1297]
在图7各图的右上象限中指示t细胞脱颗粒。本文呈现的结果显示cd123 +靶的类似t细胞识别，其通过在2小时体外测定期间的类似脱颗粒表现。c1176 具有65％的较差脱颗粒，相比之下在其他克隆中约为80％。
[1298]
细胞毒性
[1299]
为了评估细胞毒性，将cart细胞(nvs 2-4、1172和1176克隆)解冻， 并以2e6个细胞/ml在t细胞培养基中静置过夜。计数细胞并在第二天以1e6个 细胞/ml重悬。将肿瘤靶细胞(molm14)以1e6个细胞/ml重悬。将细胞以递 减的e:t比率铺板在黑色、平底96孔板中，如所示(图8)，一式两份。孵育 20小时后，加入萤光素并对板进行成像以测定光子通量作为残余活细胞的量度。 在20小时、在最大效应细胞：靶比率时，molm14细胞的杀伤在所有克隆之 间是相当的。
[1300]
体内小鼠模型
[1301]
nsg小鼠在d0静脉内注射表达萤光素酶的1e6个molm14细胞。在d6 对小鼠的肿瘤负荷成像(ivis spectrum)并随机分入治疗组。将具有最低肿瘤 负荷的小鼠分配到对照组(未转导的t细胞，utd)。在d7静脉内注射cart 细胞(nvs 2-4、1172和1176克隆)或对照t细胞(1e6)。来自d13进行的 成像数据显示在图9中。注射后6天，所有抗cd123构建体提供相等的抗肿瘤 效果，与体外数据一致。
[1302]
实施例4：人源化car构建体
[1303]
产生基于鼠1176的人源化抗cd123单链可变片段(scfv)，其与食蟹猴 cd123交叉
反应，并克隆到具有胞内cd3ζ链和4-1bb的胞内共刺激结构域的 慢病毒表达载体中，给出在表5中描述的名称(在“发明详述”中提供)。
[1304]
vl和vh结构域在scfv中出现的顺序是不同的(即，vl-vh或vh-vl 取向)，并且其中三个或四个拷贝的“g4s”(seq id no：25)亚单位，其 中每个亚单位包含序列ggggs(seq id no：25)(例如，(g4s)3(seq idno：28)或(g4s)4(seq id no：27))，连接可变结构域以产生整个scfv 结构域，如表6(在“发明详述”中提供)所示。
[1305]
人源化scfv片段(seq id no：184-215)car的序列在本文的表6中提 供。这些克隆均含有源自cd3ζ链的共刺激结构域的信号结构域中的q/k残基 变化。然后将car scfv片段克隆到慢病毒载体中，以在单个编码框架中产生 全长car构建体，并使用ef1α启动子用于表达(seq id no：11)。
[1306]
实施例5：霍奇金淋巴瘤中的cart123
[1307]
通过流式细胞术已知cd123在约50％的经典霍奇金淋巴瘤(hl)中表达。 已知对霍奇金淋巴瘤细胞系培养物外源施用il3促进生长，并且能够通过血清 剥夺部分地拯救细胞凋亡。已知sl-401对cd123(il-3ra)的抑制降低了cd123 ++hl细胞系(hdlm-2，l428)的存活力。
[1308]
通过免疫组织化学分析了8例hl患者的cd123表达。如表15所示，4/8 样品在reed-sternberg细胞和/或微环境的免疫细胞中显示阳性。
[1309]
表15：在8个hl标本中通过ihc的靶表达
[1310]
upncd30cd12311-978+-11-33317+-13-4203+-(组织细胞+)11-20838++11-4623+-11-17638d/e++(亚组)13-14768++
[1311]
流式细胞术显示了在众所周知的霍奇金淋巴瘤细胞系hdlm-2中cd30和 cd123的表达(图10)。b细胞标志物cd19和cd20缺失。
[1312]
下面的实验使用pelns抗cd123-41bb-cd3ζ(car123)质粒dna，其 具有轻链至重链或重链至轻链取向的小鼠抗人cd123 scfv。t细胞获自正常供 体(nd052，human immunology core)，使用cd3/cd28磁珠(invitrogen) 扩充，并在第2天用car123慢病毒转导。在第6天，通过检测dsred(通过 t2a共表达的cd123的替代标志物)检测cd123。通过流式细胞术检测dsred (图11a-b)。
[1313]
然后对4个霍奇金淋巴瘤细胞系(hdlm2、kmh2、l428、suphd1)、 cd123+molm14(阳性对照)和a375(阴性对照)中的cd123表达进行 q-pcr。cd123在所有霍奇金淋巴瘤细胞系中表达(图12)。gusb用作持家 基因。ct阈值为40。
[1314]
il-3在促进hl细胞生长中的作用
[1315]
由于cd123是il3受体α链和il-3在造血生长和分化中具有重要作用， 因此研究了il3信号传导在霍奇金淋巴瘤细胞系的生长中是否重要。用表达萤 光素酶的hdlm-2细胞系
移植到过表达人细胞因子(包括il-3)的nod-scid
-ꢀ
γ链ko小鼠(nsg-s小鼠)。静脉内注射后，肿瘤细胞逐渐形成弥散的软组 织块。中和性抗il3抗体的连续注射减缓了肿瘤的生长。本文提供的结果表明cd123可以是霍奇金淋巴瘤中特别相关的靶标。肿瘤负荷由bli显示(图13)。
[1316]
cd107a脱颗粒测定法
[1317]
在抗cd28、抗cd49d抗体和莫能菌素存在下，将未转导的t细胞(utd) 或cart123与hdlm-2(cd123+hl细胞系)以5个靶细胞对1个t细胞 的比率孵育4小时。抗cd30 car t细胞用作另外的对照。
[1318]
通过流式细胞术检测到cart123而不是utd显示增加cd107a脱颗粒(图 14和15)。此外，cart123显示胞内细胞因子产生(il-2、tnf)的显著增 加(图16)。
[1319]
cart123杀伤hdlm-2细胞
[1320]
进行基于萤光素酶的24小时杀伤测定。t细胞与萤光素酶+hdml-2细胞 以不同比率(0.3:1-10:1)共孵育。如生物发光发射中的减少所示，cart123 而不是utd显示剂量依赖性杀伤。有趣的是，cd30特异性car t细胞显示 最小活性(图17)。
[1321]
在hl细胞系的存在下的cart123增殖
[1322]
在5天t细胞增殖测定中，将t细胞与hl细胞系(cd123+)或对照(jurkatcd123-，molm-14 cd123+)或pma/离子霉素(阳性对照)或细胞培养基(阴 性对照)孵育。当与hl细胞系共培养时，cart123和cart30细胞而不是 utd显示出稳健的增殖(图18)。
[1323]
72小时后收集来自增殖测定的上清液，通过luminex测定分析30种细胞 因子的存在。cart123显示出多种细胞因子的稳健产生(ifng、il-2、tnfa 和mip1b luminex mfi分别显示在图19a-19d中)。
[1324]
cart123抗霍奇金淋巴瘤细胞系(hdlm-2)的体内功效
[1325]
为了证实本文提供的体外数据，开发了体内模型。在第0天将1百万个萤 光素酶+hdlm-2细胞静脉内注射。然后进行所示的连续生物发光成像(bli) 以观察肿瘤水平(图20)。在第7天观察到低水平的肿瘤，然后在约6周的期 间肿瘤负荷逐渐增加，再现惰性性质的人类疾病。在第43天，当肿瘤负荷高于 基线20倍时，用150万个cart123细胞或对照t细胞处理小鼠。
[1326]
cart123在14天内诱导完全和持久地根除播散的肿瘤，导致6个月时100％无复发和100％总生存(图21和22)。
[1327]
如在连续外周血采血中通过流式细胞术检测的那样，肿瘤消除与大量cart细胞扩充相关(图23)。扩充的t细胞为约50％cd8和50％cd4细胞。随 着肿瘤负荷减少，t细胞数随时间而回缩。
[1328]
实施例6：cd123-2 car的另外的特征
[1329]
进行另外的体外测定以评价慢病毒转导的表达car123-2构建体的原代t 细胞(本文也称为lv car123-2)。将表达car的t细胞(lv car123-2) 与表达针对巨细胞病毒(hcmv)糖蛋白h(gh)的scfv的t细胞(本文称 为抗gh)(作为阴性对照)进行比较。体外测定的关键包括细胞因子产生、 增殖和细胞杀伤测定。通过将t细胞(lv car123-2或抗gh)与表达cd123 的(抗原+)细胞系(例如表达人cd123的molm13或k562)、或cd123 阴性(抗原-)对照细胞系(例如k562)孵育进行增殖测定。使t细胞生长4 天。如图25所示，当在表达cd123的细
中所述)，其是car19的相同骨架构建体。如前所述进行表达car的t细胞 的产生(gill等人,blood 123,2343-2354(2014))。正常供体cd4和cd8t细胞或 pb单个核细胞(pbmc)获自宾夕法尼亚大学的人免疫中心。将t细胞以1
×ꢀ
106/ml铺板，其中cd4:cd8比率为1：1，在x-vivo 15培养基(lonza，04-418q) 中扩充，该培养基补充有人ab血清5％(gemini，100-512)、青霉素/链霉素 (gibco，15070063)和glutamax(gibco，35050061)，使用在培养的第1天 加入并且在第6天去除的抗cd3/cd28dynabeads(life technologies，11161d)。 在第2天用慢病毒转导t细胞。在培养中扩充t细胞持续8-15天，然后当中位 值细胞体积低于300fl时收获细胞。然后将t细胞冷冻保存在含有10％dmso 的fbs中用于将来的实验。在所有实验之前，将t细胞解冻并在37℃静置过夜
[1341]
多参数流式细胞术：如先前所述进行流式细胞术(kenderian，等人， leukemia，(2015))。抗人抗体购自biolegend，ebioscience或becton dickinson。 从体外培养物或从动物中分离细胞，在补充有2％胎牛血清的pbs中洗涤一次， 并在室温下染色15分钟。对于细胞数定量，根据制造商的说明书使用 countbright(invitrogen)珠。在所有分析中，基于正向对侧向散射特征对感 兴趣的群体进行门控，随后进行单重门控，使用live dead fixable aqua (invitrogen)门控活细胞。包括时间门控用于质量控制。如前所述，使用抗独 特型抗体检测car19的表面表达。使用山羊抗小鼠抗体(jackson laboratories) 或cd123-fc/his(sino biologicals)和抗his-apc(r&d)或pe(abcam) 进行car123的检测。在四激光fortessa-lsr ii细胞计数器(becton-dickinson) 上进行流式细胞术，并用flowjo x 10.0.7r2(tree star)分析。
[1342]
体外t细胞效应功能测定：如前所述进行脱颗粒、cfse增殖、细胞毒性 测定和细胞因子测量。(gill等人，blood 123,2343-2354(2014)和kalos等人， science translational medicine 3,95ra73(2011))。
[1343]
脱颗粒测定：简言之，将t细胞与靶细胞以1:5的比率在t细胞培养基中 孵育。向共培养物中加入抗cd107a-pecy7(biolegend)、抗cd28(bdbiosciences)、抗cd49d(bd biosciences)抗体和莫能菌素(bd biosciences)。 4小时后，收获细胞并对car表达染色，cd3、cd8和live dead aqua染色 (invitrogen)。将细胞固定并透化(invitrogen fix/perm缓冲液)，然后进 行细胞内染色以检测多种细胞因子(ifn、tnfα、il-2、gm-csf、mip1β)。
[1344]
增殖测定：洗涤t细胞并以1
×
107个/ml重悬于100μl pbs中，并在37℃ 用100μl cfse 2.5um(invitrogen)染色5分钟。然后用冷的培养基淬灭反应， 并将细胞洗涤三次。以100gy的剂量照射靶。t细胞与经照射的靶细胞以1:1 的比率孵育120小时，在24小时加入培养基。然后收获细胞，对cd3、car 和live dead aqua(invitrogen)染色，在流式细胞术分析之前加入countbright 珠(invitrogen)，用于绝对定量。
[1345]
细胞毒性测定：如前所述，将萤光素酶/egfp+细胞系用于细胞毒性测定。 简言之，将靶与效应t细胞以指定的比率孵育24小时。通过在xenogen ivis-200 光谱照相机上的生物发光成像计算杀伤。
[1346]
细胞因子测量：效应细胞和靶细胞以1：1的比率在t细胞培养基中共孵育 24。收获上清液，并根据制造商的方案(invitrogen)通过30-plex luminex阵 列(luminex corp，flexmap 3d)分析。
[1347]
动物实验：如前所述进行体内实验。(kenderian，等人，leukemia，(2015))。 使用
的异种移植模型的模式在相关图、结果中详细讨论。最初从jacksonlaboratories获得的nod-scid-γ链-/-(nsg)购自宾夕法尼亚大学的干细胞 和异种移植中心。所有实验根据遵循动物管理和使用委员会机构(iacuc)批 准的方案(#803230)进行，该委员会机构遵循nih对实验室动物管理和使用 的指南。将细胞(白血病细胞系或t细胞)以指定浓度在200μl pbs中注射到 小鼠的尾静脉中。使用xenogen ivis-200光谱照相机进行生物发光成像，并用 livingimage软件v.4.3.1(caliper lifesciences)分析。在实验结束时或当它们 根据iacuc方案满足预先指定的终点时，对动物实施安乐死。
[1348]
多光子显微镜：将小鼠麻醉并维持在37℃的核心温度。去除头皮并固定颅 骨后，对骨髓进行成像。使用配备有皮秒激光器(coherent)的leica sp5 2光 子显微镜系统(leica microsystems)进行成像。每次成像采集持续20分钟， 然后评估小鼠镇静状态。使用850nm的激光激发celltrace violet、gfp和 celltrace orange(或tritc)。使用20x水浸透镜获得图像。使用volocity 软件(perkinelmer)分析所得图像。
[1349]
统计分析：使用用于windows的版本6.04(la jolla，ca)的graphpadprism 6，如所指示的进行所有统计。使用学生t检验比较两组；在比较多个组 的分析中，进行用于多重比较的单因素方差分析(anova)，并带有holm-sida 校正。当在多个时间点/比率比较多个组时，对于每个时间点/比率使用学生t检 验或anova。使用对数秩检验比较存活曲线。在图中，星号用于表示p值(* ＝<0.05，**＝<0.01，***＝<0.001，****＝<0.0001)，并且“ns”表示“不显 著”(p>0.05)。对于每个实验，统计的更多细节在图例中列出。
[1350]
结果
[1351]
cd123在b-all中、在白血病干细胞中和在cd19阴性复发中表达
[1352]
为了评价cd123在b细胞急性淋巴细胞性白血病中的表达，分析了来自成 人和儿科all患者的42个样品，包括我们目前的ctl019临床试验中招募的 14个受试者。如图31a、31b和38a所示，cd123在大多数all母细胞的表 面上高度且均匀地表达，代表了靶向治疗的理想候选。此外，还发现cd123在 推定的鉴定为cd34+cd38-的白血病干细胞(lsc)中表达(图31c)。在一 些b-all患者中可以鉴定到cd19阴性母细胞的小亚组，并且如果这些细胞含 有具有恶性表型的细胞，则这些细胞可有助于抗原缺失复发。为了评价cd19 阴性亚组中疾病的存在，对来自费城染色体阳性b-all大群体的cd19-cd123+ 细胞进行分选(cd45暗淡，门控策略如图38b所示)。发现这些细胞对于 bcr-abl易位是克隆的，尽管以比cd19+母细胞更低的频率(图31d)。该 发现表明，单独靶向cd19，在一些情况下可导致源自cd19-cd123+细胞的亚 克隆复发。此外，这一发现表明，靶向cd123可以通过消除lsc和可能的cd19 阴性白血病克隆导致更深的反应。
[1353]
最后，在具有cd19缺失的ctl019后复发的b-all患者的样品中也评估 了cd123的表达。重要的是，与cd19的完全缺失相反，大多数患者在复发时 维持cd123表达(图31e和31f)。这些发现表明cd123代表靶向cart19 或博纳吐单抗之后出现的cd19阴性all母细胞的理想标志物。
[1354]
抗cd123嵌合抗原受体t细胞在体外和体内是活性抗人b-all的
[1355]
产生抗cd123嵌合抗原受体t细胞(cart123)(37)，其转导慢病毒 并用抗cd3/cd28磁珠扩充。如本文所述评价cart123抗b急性淋巴母细胞 性白血病的体外和体内活性。
[1356]
使用cd19++和cd123+的b-all细胞系nalm-6(图32a和39a)和原 代b-all样品。当t
细胞与nalm-6或原代all共培养时，cart123和 cart19之间的头对头体外比较显示相似的cd107a脱颗粒速率(图32b)。 cart123也能以剂量依赖性方式杀伤nalm-6细胞，具有与cart19相似的 效率(图32c)。在更长期的实验中，当与nalm-6或原代all共培养3-5 天时，cart123增殖(图32d和32e)并产生多种细胞因子(图32f)。这些 结果表明cart123表现出与cart-19等同的针对多种b-all靶的效力。
[1357]
为了在体内模型中证实这些数据，使用原发性all模型。在该模型中，从 b-all患者获得的原代母细胞在nod-scid-γ链敲除(nsg)小鼠中传代， 并用包含egfp和叩头甲虫萤光素酶(gfp/luc)的报告基因构建体转导。nsg 小鼠静脉内注射gfp/luc+原代all母细胞(jh331、cd19+、cd123+、添 加表型)，并且在移植后，将小鼠随机化以接受cart19、cart123或对照未 转导的t细胞(utd)。用对照t细胞处理的小鼠迅速死于疾病，而用cart19 或cart123处理的小鼠显示肿瘤消除和长期存活(图33a和33b)。与对照t 细胞相比，car123t细胞在小鼠的外周血(pb)中显著扩充，并表达高水平 的car123(图33c)。cart123的抗白血病活性是特异性的，并且基于对母 细胞表面上的cd123的识别，当我们用cd123-cd19+白血病(av576)移植 小鼠时，仅cart19显示抗白血病活性，而cart123与对照utd相比没有作 用(图39b和39c)。
[1358]
为了检测cart123剂量和抗肿瘤活性的可能相关性，开发了携带高白血 病负荷小鼠的体内模型(使用nalm-6细胞系)。在该模型中，cart123的 标准剂量(2百万car+细胞)不能清除肿瘤。这些小鼠注射不同剂量的 cart123(一百二十五万、2百万和5百万car+细胞)，观察到剂量相关的 抗白血病活性(图39d)。
[1359]
cart123而不是cart19在抗原缺失复发的新型临床前模型中是高度活性 的
[1360]
为了测试靶向cd19阴性复发的新策略，开发了抗原缺失复发的新体内模 型。当疾病是cd19++和cd123+时，以及当患者发展成cd19阴性疾病时在 ctl019之后的复发时(cd123仍表达，图40a)，收集基线处(在ctl019 治疗之前)获自我们ctl019临床试验之一中募集的患者(chp101)的b细 胞母细胞。然后在nsg小鼠中扩充母细胞，并对基线疾病(cd19+)转导叩 头甲虫绿色萤光素酶(cbg)或对复发(cd19-)转导叩头甲虫红色萤光素酶(cbr)(参见方法部分)。重要的是，在体内扩充期间，母细胞保留b细胞 识别标志物而不是cd19(数据未显示)。在第一个实验中，nsg小鼠移植基 线疾病cd19+(cbg，绿色)或cd19阴性(cbr，红色)白血病。将两组随 机化以接受cart19或对照t细胞(utd)(图34a)。如图34b所示，在两 组中，用utd处理的小鼠显示基线和复发疾病的快速进展，不依赖于cd19的 表达。相反，在用cart19处理的小鼠组中，仅移植基线疾病(cd19阳性) 的小鼠对cart19治疗有反应，而移植复发疾病(cd19阴性)的小鼠如预期 显示出不应性。这也在体外的cd107a脱颗粒测定中再现(图40b)。为了在 体内模拟表达cd19或缺乏cd19的不同克隆的存在，nsg小鼠移植1:1的基 线和复发疾病的混合物；在第8天，将小鼠随机化以接受cart19或对照t细 胞。用生物发光成像监测肿瘤负荷，该生物发光成像能够区分体内的cd19+ (cbg，绿色)/cd19-(cbr，红色)白血病相对生长。在接受utd的小鼠 中，在第6天存在的cd19+(绿色)和cd19-(红色)白血病在第11天类似 地增加，而在用cart19处理的小鼠中，基线疾病(绿色)完全清除，而复发 性疾病(红色)显示进展。
[1361]
使用这种独特的原代cd19阴性b-all和cart19衰竭的异种移植模型 来评价cart123在治疗抗原缺失复发中的作用。将原代cd19阴性母细胞 (cbr阳性)注射到nsg小鼠
中(图34d)，并将小鼠随机化以接受cart19、 cart123或对照t细胞。cart19和对照t细胞显示完全缺乏抗肿瘤活性， 而cart123导致在这些小鼠中完全根除疾病和长期存活(图34e和34f)。 事实上，在cart19难治的原发性b-all的临床前模型中，新的cart123 能够根除疾病并赋予长期存活。
[1362]
为了理解cart19和cart123在单细胞水平的体内模型中的差异行为， 通过将差异标记的cart19(celltrace violet，蓝色)和cart123(celltrackerorange或tritc)的混合物注射到携带cd19阳性原代母细胞(gfp)或cd19 阴性复发性母细胞(gfp)的小鼠进行一系列实验，在注射后大约24小时使用 颅骨骨髓的活体2光子显微镜追踪它们的行为(实验方案，图35a)。这些研 究表明cart19和cart123运送到含有白血病的骨髓空间，并且cart细胞 识别与运动性阻滞相关的同源抗原。具体地，在移植基线cd19+cd123+白血 病的小鼠中，发现62.9％+/-3.8的cart19和81.1％+/-1.2的cart123停滞 在与母细胞相邻的圆形形态，而在移植有复发cd19-cd123+白血病的小鼠中， 仅cart123细胞在肿瘤细胞旁被阻滞(cart123 80.9％+/-5.1对cart1912.4％+/-2.2)(图35b和35c)。这些发现表明，在cd19阴性复发all中， 仅cart123能够与白血病细胞(gfp)建立生产性突触并因此降低它们的运 动性，而cart19细胞继续取样并在环境中移动而不识别白血病母细胞。
[1363]
cart123和cart19的组合能够预防cd19阴性复发
[1364]
证明cart123有效治疗在cart19抗性的临床前模型中在cd19定向疗 法后发生的cd19阴性复发。然而，组合方法可以治疗活动性cd19阳性疾病， 同时防止抗原缺失复发。为了验证这个假设，通过将原发性cd19-和cd19+疾 病一起注射到nsg小鼠中来模拟具有cd19阴性逃避潜力的b-all出现的临 床问题。然后将小鼠随机化以接受相同总剂量t细胞的对照t细胞(utd)、 cart19或cart19和cart123的组合(图36a)。如图36b所示，用对照 t细胞治疗的小鼠具有两种白血病克隆的进展，cart19显示主要是cd19阴 性疾病(红色)的快速进展。相反，用cart123和cart19的组合处理的小 鼠显示出疾病的清除和改善的总体存活，如图36c所示。在实验结束时处死的 小鼠的分析显示在合并的car t细胞组中没有残余白血病的迹象。相反， cart19单一疗法后具有进行性疾病的小鼠保留了预期的cd19阴性表型。
[1365]
最后，用2种慢病毒转导t细胞，一种携带car19和另一种携带car123， 以开发能够被cd19和/或cd123激活的cart。如图37a所示，检测到四种 不同转导的t细胞亚组：car19和car123双阴性、car19单阳性、car123 单阳性和双阳性car19/car123t细胞。对这四个亚组进行分选并且针对 k562-wt、k562 cd19+或k562 cd123+测试其功能性和特异性。图37b显示 了cd107a脱颗粒测定的结果，其中单个阳性亚组响应于它们的特异性靶标， 而只有双阳性群体能够在表达cd19和cd123两者的k562存在下脱颗粒。此 外，与等量的单刺激cart细胞相比，双重刺激的cart细胞对双阳性靶标表 现出更强的细胞毒性，表明通过使用由两种不同抗原触发的car，潜在地增加 功效。
[1366]
讨论
[1367]
cd19定向免疫治疗正在改变复发和难治性急性淋巴母细胞性白血病治疗 的范例。之前具有不良结果的患者现在具有实现完全反应和长期疾病缓解的现 实潜能。然而，如在某些情况下对于用其它形式的有效靶向疗法处理的白血病 所示，白血病细胞能够产生导致抗性和复发的抗原缺失突变。在cart19的情 况下，观察到两种主要的复发模式。cart19早期缺失而不能持续的患者具有 原始克隆复发的风险；实际上，最小的残留疾病分
析表明可能需要1-6个月的 持续的cart活性以完全根除恶性肿瘤。相反，约50％的复发发生在尽管 cart19持续存在并且特征在于发生cd19阴性的白血病。后一种观察结果表 明cart19具有强的选择性压力。值得注意的是，cd19阴性复发也发生在博 纳吐单抗治疗后，虽然这些代表了少量的复发发生，这可以说是不太有效的治 疗。(5)有多种潜在的发展成cd19阴性疾病的机制。其中之一是以非常低的 频率存在于基线的cd19阴性克隆的选择和相对生存优势，并且这最初被认为 是导致cd19阴性复发的最可能的因素。最近，其他机制，如cd19剪接的失 调也被认为是重要的。在这里首次显示，b-all中罕见的cd19-ve母细胞可以 包含在更常见的cd19阳性白血病母细胞中发现的标志性细胞遗传学异常，证 实这是cd19阴性复发的潜在机制。我们通过证明cd123+cd19-ve母细胞可以 植入免疫缺陷小鼠中证实了这些发现，表明cd123可以是b-all中白血病干 细胞的标志物，如其在aml中。
[1368]
这项研究的目的是定义新的策略以治疗cd19定向疗法后具有抗原缺失的 患者复发。cd123在大多数b-all中高度表达，并且特别是cd123在cd19 阴性疾病复发的患者中保持表达。这证明了cd19-cd123+群体中存在克隆白血 病细胞，表明靶向cd123与cart19组合可以增加消除由于cart19压力下 的选择性优势而可以增殖的亚克隆的可能性。cd123先前已经被验证为aml 中白血病干细胞的标志物。在这里，显示cd123在all中的免疫表型定义的 白血病干细胞(lsc)中表达，提高了靶向lsc上的cd123的可能性，可以 促进all的根除。
[1369]
为了研究cart123在抗原缺失复发中的作用，从来自注册在宾夕法尼亚 大学/费城儿童医院的ctl019试验之一的b-all患者(chp101)的原代母细 胞开发了cd19阴性复发的新型异种移植模型。该患者在基线时具有经典的 cd19+cd123+表型，但随后在用cart19治疗后复发，患有cd19-cd123+ 疾病。使用该模型，证明cart123可以根除复发性疾病，并且与cart19组 合可以预防抗原缺失复发。这是在临床相关的源自患者的模型中首次证明双 cart组合。此外，通过使用活体成像，显示cart细胞在静脉内注射后不到 24小时内进入骨髓，寻找其靶标，并减慢以与同源的带有抗原的细胞相互作用。 此外，显示双信号传导cart123/19比单独的cart或两个car的合并更有 效，这与之前公布的结果一致。
[1370]
以前，显示抗cd123嵌合抗原受体用于治疗急性髓性白血病的临床前功效。 由于cart123识别造血干细胞和祖细胞上的cd123而引起造血毒性，这是临 床转换(translation)的主要潜在挑战，因为深刻的干细胞毒性可导致永久性骨 髓消融。据推测，为了使造血毒性最小化，仅在cd19和cd123同时共同结合 时才激活t细胞的新构建体可以消除这种造血毒性。在这里，发现接收来自 cd19识别的激活信号和来自cd123识别的刺激信号的cart细胞可以杀伤 b-all细胞以及避免我们先前描述的深刻的造血毒性。尽管这个概念以前是使 用cd19/psma识别的人工系统公开的，但是该临床相关构建体在该领域中代 表重大进步，其具有相对清楚的临床转换途径。值得注意的是，尽管这样的双 car设计可能与降低的毒性相关联，但是通过使car识别更多而不是较少的 限制性，可能留下未解决的抗原缺失复发的问题。然而，如果cd123的靶向成 功地根除all干细胞，这种方法可以是安全和有效的。
[1371]
总之，这里证实的是通过靶向cd123治疗b-all的新的和有效的策略。 该方法是特别有吸引力的，因为cd123在患有b-all的一些患者中在罕见的 cd19阴性恶性细胞中表达，并且保留在cd19定向免疫疗法后发生的抗原缺失 复发中。此外，cart19与cart123的组合可以预防cd19阴性复发的发生。
[1372]
实施例8：与检查点抑制剂组合增强cart功能和治疗指数
[1373]
嵌合抗原受体t细胞(cart)疗法在过去几年中已经发展成为血液恶性 肿瘤中强大的和潜在的治疗性疗法。cd19定向的cart细胞已在急性淋巴母 细胞性白血病中导致令人印象深刻的～90％的完全响应率，其对于大多数患者 是持久的。然而，其他恶性肿瘤如慢性淋巴细胞性白血病的总体响应率约为 50％。这可能部分与白血病细胞诱导的cart消耗和功能障碍有关。在该实施 例中，在血液恶性肿瘤中评价了抑制性受体/途径在诱导cart细胞功能障碍和 消耗中的作用。
[1374]
作为肿瘤模型，用cd33或cd123定向的cart细胞(包含41bb和cd3z 刺激结构域和慢病毒载体，1172构建体(seq id no：707))处理急性髓性 白血病(aml)细胞系(molm14)和原发性aml样品。
[1375]
原代aml样品或molm14细胞系与cd33或cd123定向的cart的孵 育导致在孵育24小时后肿瘤细胞上的pdl1显著上调(第0天为0％，第1天 为80％，p<0.001)，共培养后3-7天t细胞上的pd1和tim3上调(表达pd1 的t细胞在第0天为8％，在第3天为43％，p＝0.03；并且表达tim3的t细 胞在第0天为13％，在第3天为71％，p＝0.001，图41a、41b和41c)。进 一步的流式细胞术分析证明在cd8+t细胞(图42a、42b、42c和42d)和cd4+t 细胞中检查点抑制剂pd1、tim3和另外的检查点抑制剂lag3和ctla4上调。 重要的是，在暴露于靶细胞(原代aml或molm14细胞)后3-7天之间观察 到最大表达。
[1376]
对于体内实验，用molm14细胞系移植nsg(nod-scid-g-/-)小鼠。用 亚优化剂量的cd33或cd123 cart处理这些aml异种移植物导致初始抗肿 瘤反应，随后在40-60％的小鼠中发生疾病复发(图44)。
[1377]
从这些小鼠的骨髓中分离t细胞，并分析抑制性受体的差异表达。与从 cart细胞治疗后缓解的小鼠中分离的t细胞相比，从具有复发性疾病的小鼠 分离的t细胞上的pd1和tim-3受体的上调显著增加(图43和45)。
[1378]
接下来，研究了添加检查点抑制剂在cart细胞治疗后改善离体t细胞功 能的作用。将从cart细胞治疗后复发的小鼠骨髓中分离的t细胞在肿瘤存在 下与pd-1抑制剂(bioxcell，目录号为be0193，克隆#为j110)、tim3抑 制剂(biolegend，克隆f38-2e2，目录号345010)、ceacam抑制剂 (sigma-aldrich，目录号sab1403604-100ug)共同孵育，或与pd1和tim3 抑制剂的组合、或pd1和ceacam1抑制剂的组合共同孵育。施用10ug/ml 浓度的检验点抑制剂。如在检查点抑制剂存在下，通过细胞因子产生(例如ifn
-ꢀ
γ)和ki-67增殖标志物所测量的，cart细胞效应功能有所改善。当pd1和 tim3抑制剂组合时，cart细胞效应功能的改善更显著(图46a和46b)。
[1379]
最后，测试了组合检查点抑制剂与cart是否会改善抗肿瘤活性，例如增 强治疗指数和预防在aml异种移植中的复发。在该方法中，用次优剂量的cd33 或cd123定向cart或用对照未转导的t细胞(utd)、在具有或不具有检 验点抑制剂的不同组合时治疗molm14异种移植物。nsg小鼠移植molm14 aml细胞系。通过生物发光成像证实移植。然后用次优剂量(0.25-0.5
×
106总t细胞i.v)的cd33或cd123定向cart或用对照未转导的t细胞(utd) 处理aml异种移植物。小鼠在t细胞后第3、6、9和12天也接受pd-1阻断、 tim3阻断或两者的组合。然后对小鼠进行连续成像以评估疾病负荷。实验模式 总结在图47和49中。
[1380]
向未转导的t细胞添加检查点抑制剂不会导致抗白血病效果(图48)。然 而，加入
pd1或tim3阻断导致协同的抗肿瘤活性，如图50a、50b、50c和 50d所示。持久的完全响应率如下：对于单独用cart123治疗为45％(图50a、 50b和50c)，对于用cart123+pd1抑制治疗为80％(图50a)，对于用 cart123+tim3抑制治疗为100％(图50b)，和对于用cart123+pd1和 tim3抑制治疗为80％(图50c)。
[1381]
因此，使用cart123与检查点抑制剂组合的治疗导致比当施用cart123 时观察到的抗肿瘤效果更强的抗肿瘤活性，组合了当单独施用任何检查点抑制 剂时观察到的抗肿瘤效果。这些结果表明pd1和tim3途径参与aml中的 cart消耗和功能障碍。检查点抑制剂与cart细胞的组合可以导致aml和 其他血液恶性肿瘤中增强的功能。
[1382]
实施例9：低剂量rad001在细胞培养模型中刺激cart增殖
[1383]
通过在不同浓度的rad001存在下将表达cart的细胞与靶细胞共培养来 评价低剂量rad001对体外car t细胞增殖的作用。
[1384]
材料和方法
[1385]
car转导的t细胞的产生
[1386]
使用人源化的抗人cd19 car(hucart19)慢病毒转移载体来产生包装 到vsvg假型慢病毒颗粒中的基因组材料。人源化的抗人cd19 car (hucart19)的氨基酸和核苷酸序列是在2014年3月15日提交的pct公开 wo2014/153270中描述的car 1，id 104875，并且在其中称为seq id no.85 和31。
[1387]
将慢病毒转移载体dna与三种包装组分vsvg env、gag/pol和rev并组合 脂质转染胺试剂混合，以转染lenti-x 293t细胞。在24小时和30小时后更换 培养基，之后收集含病毒的培养基，过滤并在-80℃下保存。通过转导新鲜或冷 冻的原初t细胞产生cart，所述原初t细胞通过对健康供体血液或leukopak 的负磁选择而获得。通过与抗cd3/抗cd28珠孵育24小时来活化t细胞，之 后将病毒上清液或浓缩的病毒(分别为moi＝2或10)加入到培养物中。使修 饰的t细胞扩充约10天。在第7天和第9天之间通过流式细胞术分析来测定转 导的(在细胞表面上表达car的)细胞百分比和car表达水平(相对荧光强 度，geo mean)。减慢生长速率和t细胞大小接近～350fl的组合确定待冷冻 保存用于以后分析的t细胞状态。
[1388]
评估cart的增殖
[1389]
为了评价cart的功能，将t细胞冻融并计数，并通过cellometer评估存 活力。用未转导的t细胞(utd)归一化每种培养物中的car阳性细胞的数 量。在从50nm开始的rad001滴定中测试rad001对cart的影响。在所有 共培养实验中使用的靶细胞系是nalm-6，其是表达cd19并转导以表达萤光素 酶的人前b细胞急性淋巴细胞性白血病(all)细胞系。
[1390]
为了测量cart的增殖，将t细胞与靶细胞以1:1的比率培养。当针对cd3、 cd4、cd8和car表达进行细胞染色时，测定进行4天。通过使用计数珠作为 参考的流式细胞术评估t细胞的数量。
[1391]
结果
[1392]
在4天共培养测定中测试cart细胞的增殖能力。在用nalm-6培养car
-ꢀ
转导和未转导的t细胞后，评估car阳性cd3阳性t细胞(深色柱)和总 cd3阳性t细胞(浅色柱)的数量(图53)。当在少于0.016nm的rad001 存在下培养时，hucart19细胞扩充，在较高浓度的化合物下扩充程度较小。 重要的是，在0.0032和0.016nm rad001时，增殖高于在不添加rad001的情 况下观察到的增殖。未转导的t细胞(utd)没有显示可检测的扩充。
[1393]
实施例10：低剂量rad001在体内刺激cart扩充
[1394]
该实施例评价了用不同浓度的rad001在体内增殖hucar19细胞的能力。
[1395]
材料和方法：
[1396]
nalm6-luc细胞：从患有复发性all的患者的外周血开发出nalm6人 急性淋巴母细胞性白血病(all)细胞系。然后用萤火虫萤光素酶标记细胞。 这些悬浮细胞在补充有10％热灭活的胎牛血清的rpmi中生长。
[1397]
小鼠：从jackson laboratory(储存编号005557)接收6周龄的nsg (nod.cg-prkdc
scid
il2rg
tm1wj1
/szj)小鼠。
[1398]
肿瘤移植：使nalm6-luc细胞在补充有10％热灭活的胎牛血清的rpmi 中在体外生长和扩充。然后将细胞转移到15ml锥形管中，并用冷无菌pbs洗 涤两次。然后计数nalm6-luc细胞，并以10
×
106个细胞/毫升pbs的浓度重 悬。将细胞置于冰上并立即(在1小时内)植入小鼠中。通过尾静脉以100μl 体积静脉内注射nalm6-luc细胞，每只小鼠总共注射1
×
106个细胞。
[1399]
施用car t细胞：在肿瘤植入7天后给小鼠施用5
×
106car t细胞。将 细胞在摄氏37℃水浴中部分冻融，然后通过向含有细胞的管中加入1ml冷的无 菌pbs完全冻融。将冻融的细胞转移至15ml falcon管中，并用pbs调整至最 终体积为10ml。将细胞以1000rpm洗涤两次，每次10分钟，然后在血细胞计 数器上计数。然后将t细胞以50
×
106car t细胞/ml冷pbs的浓度重悬，并 保持在冰上直到施用给小鼠。通过尾静脉给小鼠静脉内注射100μl car t细胞， 每只小鼠剂量为5
×
106个car t细胞。每组8只小鼠用100μl pbs单独(pbs) 或人源化cd19 car t细胞处理。
[1400]
rad001给药：配制50mg的浓缩微乳液(等于1mg rad001)，然后在给 药时重悬于d5w(5％葡萄糖水溶液)中。小鼠每天口服给予(通过口服管饲) 200μl所需剂量的rad001。
[1401]
pk分析：在肿瘤植入后7天开始小鼠每天给药rad001。给药组如下： 0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg。在第0天和第14天在rad001的第 一次和最后一次剂量后对小鼠采血，在以下时间点用于pk分析：15分钟、30 分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时和24小时。
[1402]
结果：
[1403]
在具有nalm6-luc肿瘤的nsg小鼠中测试rad001的扩充和药代动力学。 每天单独口服给予rad001对nalm6-luc肿瘤的生长没有影响(图54)。 rad001的药代动力学分析显示其在荷瘤小鼠的血液中相当稳定(图55a和 55b)。在第0天和第14天的pk分析显示，在测试的最低剂量(0.3mg/kg) 给药后，即使在给药后24小时，血液中rad001的浓度也高于10nm。
[1404]
基于这些剂量，与和不与rad001一起给予hucar19car t细胞以测定 这些细胞的增殖能力。使用的最高剂量为3mg/kg，其基于给药后24小时的血 液中rad001的水平。由于rad001的最终剂量24小时后rad001的浓度高 于10nm，在使用car t细胞的体内研究中使用几种较低剂量的rad001。在 开始每日口服rad001给药的前一天，静脉内施用car t细胞。通过facs 监测小鼠的t细胞扩充。
[1405]
最低剂量的rad001显示car t细胞的增殖增强(图56)。对于cd4
+ cart细胞，这种增强的增殖比cd8
+ car t细胞更加明显和延长。然而，对于cd8
+ car t细胞，在car t细胞给药后的早期时间点可以看到增强的增殖。在实 施方案中，rna cart细胞也可以与检查点抑
制剂组合使用。
[1406]
实施例11：cart123终止策略的体外表征
[1407]
终止策略对于使cart123疗法的毒性最小化具有特别的意义。用于减少 cart123活性的一种策略涉及通过共表达car123与cd20并使用抗cd20抗 体利妥昔单抗以靶向cart123细胞进行破坏，来消除表达cd123 car的t 细胞。在该实施例中，产生共表达cd20的cart123细胞，并且通过各种体外 测定法，如脱颗粒和细胞因子生产能力来表征。
[1408]
构建用于表达cd123 car和cd20的表达载体。载体图谱显示于图57中。 nvs2 car123(本文也称为car123-2)包含针对cd123的人源化单链可变片 段、cd8铰链、cd8跨膜结构域、41bb和cd3刺激结构域。nvs2car123 在ef1α启动子下并且与具有p2a蛋白的完整cd20分子可操作地连接。仅表 达car123的细胞在本文中称为cart123细胞，且共表达car123和cd20 的细胞在本文中称为cart123p2acd20细胞。
[1409]
对于cd107脱颗粒测定，cart123和cart123p2a cd20细胞在cd28、 cd49d共刺激分子和莫能菌素存在下单独培养、与cd123阳性细胞系molm14 培养、与cd123阴性对照细胞系jurkat培养，和与pma/离子霉素作为阳性对 照培养。在孵育4小时后通过流式细胞术测量cd107a。cart123 p2a cd20 细胞响应于cd123阳性靶而经历强的特异性cd107a脱颗粒，类似于cart123 细胞(图58)，由此证明引入cd20分子不会不利地影响cart123细胞的脱 颗粒。
[1410]
还评估了cart123p2a cd20细胞的细胞因子产生。cart123和 cart123p2a cd20细胞在cd28、cd49d共刺激分子和莫能菌素存在下单独 培养、与cd123阳性细胞系molm14培养、与cd123阴性对照细胞系jurkat 培养，和与pma/离子霉素作为阳性对照培养。在4小时后收获细胞、固定并 透化、对细胞因子gm-csf、tnfα、ifnγ或il-2染色，并进行流式细胞术分 析。来自这些测定的结果证实，大多数cart123 p2a cd20细胞响应cd123 阳性靶标，产生gm-csf(图59a)、tnfα(图59b)、ifnγ(图59c)和 il-2(图59d)，类似于cart123细胞。
[1411]
在细胞毒性测定中，将cart123和cart123p2a cd20细胞与 molm14-luc以所示的不同e:t比率孵育24小时，然后进行生物发光成像作 为残余活细胞的测量。结果显示cart123 p2a cd20细胞导致对cd123阳性 靶标molm14的特异性杀伤，这与cart123细胞相当(图60)。
[1412]
接下来评估对于cart123 p2a cd20细胞的利妥昔单抗介导的细胞毒性。 cart123和cart123 p2a cd20与不同浓度，0μg/ml、1μg/ml、10μg/ml 和100μg/ml的利妥昔单抗孵育。在0、4、12和48小时收获细胞，并对cd3 染色。计算t细胞消耗的百分比。利妥昔单抗在100μg/ml的浓度下以及孵育 48小时后、在cart123p2a cd20细胞(图61b)而不是cart123细胞(图 61a)中，导致直接的细胞毒性。
[1413]
研究了介导cart123p2acd20细胞消耗的机制。cart123 p2a cd20细 胞与不同浓度0μg/ml、1μg/ml、10μg/ml和100μg/ml的利妥昔单抗在15％ 兔补体的存在下孵育。如图62所示，1ug/ml或10ug/ml利妥昔单抗在孵育12 小时后导致大多数cart123 p2a cd20细胞的消耗。100ug/ml利妥昔单抗在孵 育4小时后导致大多数cart123 p2a cd20细胞的消耗。由补体依赖性细胞毒 性介导了cart123 p2a cd20细胞消耗。
[1414]
实施例12：cd123 cart的有效终止策略
[1415]
许多患有急性髓性白血病(aml)复发或当前的治疗方式不能治愈的儿童 和成人，
突出了对替代疗法的需要。靶向cd123的嵌合抗原受体t细胞 (cart123)已经显示出在人aml的鼠异种移植模型中有效的抗白血病的活 性。然而，cart123治疗正常人造血细胞植入的小鼠导致深刻的骨髓消融，引 起对可能用这些疗法治疗的aml患者中严重血液毒性的关注。在这里，评估 了cart123诱导的aml根除后的t细胞缺失是否可以最小化这种旁观者毒 性，而不损害白血病控制，从而增加抗aml car t细胞免疫治疗的治疗窗口。
[1416]
方法
[1417]
检查了人aml异种移植模型中的三种终止策略：(1)用抗 cd123-41bb-cd3ζcart123慢病毒转导的1x10
5-1x106个t细胞处理后，用 抗cd52抗体阿仑单抗进行的t细胞消融，(2)用经工程化以共表达cd20的 1
×
10
5-1
×
106个cart123(cart123/cd20)处理后，用抗cd20抗体利妥昔 单抗进行的t细胞消融，和(3)用“可生物降解的”抗cd123mrna电穿孔 的car t细胞(rna-cart123)处理。用如上所述的cd123重定向的car t 细胞处理用表达萤光素酶的人aml细胞系(molm14、molm13、u937)或 原代aml标本(n＝3)移植的小鼠。用于该实验的cd123 car构建体是1172 构建体(seq id no：707)，并在第1周施用给小鼠。对于t细胞消耗的研究， 将阿仑单抗1或5mg/kg在第2周、第3周或第4周(例如，cart123后1、2 或3周)腹膜内注射(ip)，以确定t细胞消融的最佳剂量和时间。在随后的 研究中，在cart123/cd20 4周后ip注射利妥昔单抗10mg/kg，或在aml植 入后第5、9和16天静脉内注射1
×
107个rna-cart123。之后每周对小鼠进 行生物发光成像和/或血液、脾和/或骨髓的定量流式细胞术分析。
[1418]
结果
[1419]
cd123+aml异种移植物的cart123治疗在体内诱导明显的t细胞扩充 和白血病根除，导致长期的动物存活(p<0.0001，相对于未转导的t细胞处理 的对照)。观察到最小的异种移植物抗宿主作用。
[1420]
在异种移植物模型中通过阿仑单抗施用连续消融cart123的结果显示在 图72a中。也在相应的时间点进行cart123细胞的定量(图72b)，并且显 示单剂量的阿仑单抗快速消除cart123细胞。一个剂量的阿仑单抗在所有测 试的模型中快速消除t细胞，在第4周(例如，cart123后3周)最佳功效为 施用5mg/kg。总体存活的分析显示在图72c中，表明在第3周或第4周接受阿 仑单抗的小鼠与在第2周接受阿仑单抗的小鼠相比显示改善的存活。
[1421]
在cart123/cd20以与cart123相似的动力学根除aml，在 cart123/cd20输注后4周，1个剂量的利妥昔单抗快速消除t细胞，同时保 持白血病缓解。具有cart123-或cart123/cd20-诱导的aml缓解的小鼠在 施用阿仑单抗或利妥昔单抗时保持无白血病≥12周(图72a)，动物存活与 cd123重定向的car t细胞治疗的小鼠(其不经历t细胞消耗)没有差异(p ＝1.00)。相反，在早期阿仑单抗施用时具有残留aml的cart123处理的小 鼠经历了快速的aml进展，与有效的先前t细胞消除一致(图72a)。
[1422]
此外，先前用阿仑单抗或利妥昔单抗消融t细胞的动物的aml再攻击(“复 发”)导致快速aml增殖，而没有t细胞再出现，证实了t细胞消耗的完全 性。未消融的小鼠显示car t细胞再扩充，抵抗cd123+再攻击(p<0.0001) (图72a)。
[1423]
也在第二个体内模型中检查阿仑单抗治疗，该模型是来自儿科患者的异种 移植模型。在该模型中，向小鼠注射aml290细胞。在aml植入6周后，向 小鼠施用盐水、未转导的t细胞或cart123细胞(在第0周表示)。在第4 周时，将阿仑单抗以5mg/kg施用给接受cart123
细胞的小鼠亚组。阿仑单抗 治疗显示完全消除外周血中的cart123t细胞(图73b)。肿瘤进展的分析显 示接受cart123的小鼠在cart123治疗后直至8周显示出缓解。在第4周接 受阿仑单抗治疗和cart123细胞消融的小鼠保持缓解(图73a)。在cart123 施用后通过流式细胞术测定存在于异种移植物不同器官中的aml的分析。用 cart123细胞的治疗导致脾脏(图74a)和骨髓(图74b)中aml细胞的消 融。在cart123施用4周后用阿仑单抗的治疗保持缓解，如通过在脾脏(图 74a)和骨髓(图74b)中持续的aml细胞消融所证明的。
[1424]
rna-cart123最快速地消除aml并促进长期动物存活，尽管 rna-cart123预期在体内比cart123或cart123/cd20更短的持久性。单 独的阿仑单抗或利妥昔单抗相对于仅aml的对照不在非cart123处理的异种 移植模型中抑制aml增殖(p＝1.00)。
[1425]
图75中示出了在该示例中描述的三种终止方法的比较。
[1426]
结论：
[1427]
阿仑单抗和利妥昔单抗在人aml异种移植模型中完全消除cd123重定向 的car t细胞。持续白血病缓解需要cart123或cart123/cd20持续4周， 之后分别通过cart123后或cart123/cd20后的阿仑单抗5mg/kg或利妥昔 单抗10mg/kg终止t细胞。正在进行的研究调查了在其他原发性aml异种移 植模型和其他抗aml car t细胞免疫疗法中的t细胞消除的功效。这些t细 胞终止策略可以增加car t细胞疗法在aml患者中的功效，特别是在潜在的 造血干细胞移植之前。
[1428]
实施例13：car19和car123组合
[1429]
大多数b急性淋巴母细胞性白血病(b-all)母细胞共表达cd19和cd123。 同时靶向两种抗原可以导致增加的抗肿瘤活性和降低复发率。如实施例8所述， car19和car123的组合具有增加的治疗功效。在该实施例中，研究了用于施 用car19和car123组合的不同构建体。
[1430]
施用car19和car123组合的一种策略是通过双cart，其中t细胞表 达car19和car123构建体。构建携带car19和car123序列的单一慢病毒 载体(而不是2个分别的载体)以促进临床使用的双cart生产(图63a)。 该慢病毒构建体包括ef1启动子下通过p2a结构域连接的car19和car123。 t细胞用慢病毒构建体转导，培养6天，然后用cd19scfv特异性抗体和 cd123-his肽和抗his-pe抗体染色，用于流式细胞术分析。结果显示检测到表 达car19和car123的t细胞(图63b)。
[1431]
在另一策略中，使用分拆的car策略来表达car19和car123。在该策 略中，构建载体，其中包含共刺激结构域4-1bb的car123通过p2a结构域连 接到包含初级信号结构域cd3ζ的car19(图64a)。具体地，car123包含 cd123 scfv、cd8铰链和cd8跨膜结构域和4-1bb结构域。car19包含 cd19scfv、cd8铰链和cd8跨膜结构域和cd3ζ结构域。在该策略中，仅通 过car的各个scfv部分识别cd19和cd123将导致分拆的cart细胞的活 化。t细胞用慢病毒构建体转导，培养6天，然后用cd19scfv特异性抗体和 cd123-his肽和抗his-pe抗体染色，用于流式细胞术分析。结果显示检测到表 达car19和car123的t细胞(图64b)。
[1432]
实施例14：cd123 cart治疗组织细胞疾病
[1433]
cd123 cart治疗可用于组织细胞疾病，如bpdcn或肥大细胞疾病。在 该实施例中，进行实验以评价在母细胞性浆细胞样树状细胞肿瘤(bpdcn)和 肥大细胞疾病(如系统性肥大细胞增多症和肥大细胞白血病)背景下的 cart123功能。
[1434]
bpdcn是从pdc的前体产生的罕见和侵袭性血液肿瘤，归类为组织细胞/ 树突细胞肿瘤。所有bpdcn表达cd123。cd123似乎对于bpdcn存活是关 键的，因为bpdcn母细胞需要il-3以成功的离体繁殖。尽管最初对化疗的反 应率很高，但长期生存通常非常差，中位生存期为9-13个月，与初始呈递无关。
[1435]
通过流式细胞术在造血干细胞(hsc)、急性髓性白血病细胞系(aml) 或两种不同的bpdcn上测定cd123表达。指示了中位值荧光强度。cd123在 aml、正常骨髓cd34+细胞和两种情况下的bpdcn上的表达显示在图65中。 这些数据表明，与正常骨髓相比，cd123在bpdcn上表达高10-20倍。
[1436]
使用备选的抗cd123克隆(32716(本文也称为1172构建体)和26292(本 文也称为1176构建体)产生额外的cart123构建体，在pct/us2014/017328 中描述和表征了这两种构建体。类似于实施例2或3中所述进行细胞杀伤测定。 克隆26292导致与阳性对照aml或bpdcn相比降低的正常cd34细胞的杀伤， 表明其适宜产生具有减弱活性的cart-123，这可能产生增强的治疗窗口(图 66b)。相反地，克隆32716显示类似的cd34细胞和bpdcn的杀伤(图66a)。
[1437]
类似于实施例2或3中所述进行t细胞功能的敏感性分析，如脱颗粒和细 胞因子产生。将克隆26292cart123与cd34+hsc(图67，顶行)或bpdcn (图67，底行)孵育4小时。评估cd107脱颗粒。来自脱颗粒测定的结果显示， 克隆26292的效应功能仍然可以由cd34+hsc触发(图67，顶行)。
[1438]
肥大细胞疾病，包括系统性肥大细胞增多症和肥大细胞白血病，是与不良 预后相关的罕见的组织细胞恶性肿瘤。肥大细胞高水平表达cd123，因此可用 cart123治疗肥大细胞疾病。
[1439]
进行了对肥大细胞疾病的cd123表达的分析。用活/死aqua(live/deadaqua)(ldaq，图68a和68b中的x轴)和同种型(图68a)或cd123pe (图68b)染色来自患有肥大细胞白血病/系统性肥大细胞增多症患者的血液的 单个核细胞。大多数sm细胞表达cd123。
[1440]
在肥大细胞白血病细胞存在下进行cd107脱颗粒测定以评估cart123活 性。在抗cd107a抗体存在下，cart123细胞单独培养、与pma和离子霉素 (图69a)或与来自患有肥大细胞白血病/系统性肥大细胞增多症的患者的血液 中的单个核细胞(图69b)培养2小时。使用抗cd3门控t细胞。使用单独的 cart123管对cd107a阳性进行门控。cart123对sm细胞的响应等同于用 阳性对照pma+离子霉素产生的响应。
[1441]
实施例15：cart123对肿瘤微环境的影响
[1442]
在该实施例中，进行测定以测试表达cd123 car的细胞对肿瘤微环境的 影响。这些测定可用于评价cart123对霍奇金淋巴瘤的肿瘤微环境的影响。
[1443]
进行第一测定以确定恶性细胞(例如霍奇金淋巴瘤细胞(hl细胞))是否 导致肿瘤微环境中的细胞(例如单核细胞)中的免疫抑制表型。单核细胞和hl 细胞在包含上室和下室的transwell板中生长。单核细胞和恶性细胞以以下构造 培养：(1)单核细胞在一个室例如下室中生长，hl细胞在另一个室例如上室 中生长，(2)单核细胞和hl细胞一起在transwell板的同一侧生长，或(3) 单核细胞单独生长(对照)。将细胞培养所需的时间，然后收获细胞用于流式 细胞术分析或实时定量pcr，以通过评估标志物如cd14和hladr的水平来 检测单核细胞表型，例如免疫抑制表型。
[1444]
进行第二测定以确定免疫抑制性肿瘤微环境细胞(例如单核细胞)是否可 抑制由cart细胞介导的抗肿瘤t细胞免疫。可以两种不同的方式进行该测定， 如果怀疑抗肿瘤t细胞免疫的抑制是通过可溶性因子，则使用transwell板， 或者如果怀疑抗肿瘤t细胞免疫的抑制是接触介导的，则使用标准细胞培养容 器。对于其中抗肿瘤t细胞免疫的抑制可以通过可溶性因子的测定，细胞在包 含上室和下室的transwell板中生长。细胞以以下构造培养：(1)hl细胞在 一个室中(例如上室)和cart19细胞和表达cd19的肿瘤细胞(例如b细胞 肿瘤)在另一个室中，例如，下室；(2)单核细胞在一个室中，例如上室，且 cart19细胞和表达cd19的肿瘤细胞(例如b细胞肿瘤)在另一个室中；和 (3)hl细胞和单核细胞在一个室中，例如上室，和cart19细胞和表达cd19 的肿瘤细胞(例如b细胞肿瘤)在另一个室中。对于其中抗肿瘤t细胞免疫的 抑制可以是接触介导的测定，细胞以以下构造培养：(1)hl细胞、cart19 细胞和表达cd19的肿瘤细胞；(2)单核细胞、cart19细胞和表达cd19的 肿瘤细胞；和(3)hl细胞、单核细胞、cart19细胞和表达cd19的肿瘤细 胞。将细胞培养所需的时间段，然后评估cart19功能。评估cart19功能的 测定包括增殖和杀伤测定，例如，如实施例2和3中所述。
[1445]
进行第三个测定以确定cart123靶向肿瘤微环境中的免疫抑制细胞。可 以两种不同的方式进行该测定:如果怀疑抗肿瘤t细胞免疫的抑制是通过可溶性 因子，则使用transwell板，或者如果怀疑抗肿瘤t细胞免疫的抑制是接触介 导的，则使用标准细胞培养容器。对于其中抗肿瘤t细胞免疫的抑制可以通过 可溶性因子的测定，细胞在包含上室和下室的transwell板中生长。细胞培养在 针对上述第二个测定的三种transwell板构造中，且另外，培养在包括cart123 细胞的以下构造中：(4)hl细胞和cart123细胞在一个室中，例如上室，cart19细胞和cd19+cd123-肿瘤细胞(例如b细胞肿瘤)在另一个室中， 例如下室；(5)单核细胞和cart123细胞在一个室中，例如上室，cart19 细胞和cd19+cd123-肿瘤细胞(例如b细胞肿瘤)在另一个室中；和(6)hl 细胞、单核细胞和cart123细胞在一个室中，例如上室，且cart19细胞和 cd19+cd123-肿瘤细胞(例如b细胞肿瘤)在另一个室中。对于其中抗肿瘤t 细胞免疫的抑制可以是接触介导的测定，将细胞培养在针对上述第二个测定的 三种标准细胞培养容器中，且此外，培养在包括cart123细胞的以下构造中： (4)hl细胞、cart19细胞、cart123细胞和cd19+cd123-肿瘤细胞；(5) 单核细胞、cart19细胞、cart123细胞和cd19+cd123-肿瘤细胞；和(6) hl细胞、单核细胞、cart19细胞、cart123细胞和cd19+cd123-肿瘤细 胞。将细胞培养所需的时间段，然后评估cart19功能。评估cart19功能的 测定包括增殖和杀伤测定，例如，如实施例2和3所述。
[1446]
实施例16：rna cart123在难治性或复发性aml中的临床研究
[1447]
该研究解决了在急性髓性白血病(aml)受试者中静脉内施用rna电穿 孔表达抗cd123嵌合抗原受体的自体t细胞(表达串联tcrζ和4-1bb(tcr ζ/4-1bb)共刺激结构域)(称为“rna cart123”)的可行性、安全性和功 效。本研究评估15名受试者。可评估的受试者是接受至少一个剂量的rnacart123细胞的受试者。活性方案干预的持续时间是从筛选受访起约2个月。 在第一次输注后跟踪受试者6个月。
[1448]
本研究的主要目的是通过记录不良事件的频率和严重程度来评估aml受 试者中rna cart123的安全性，包括但不限于估计crs(细胞因子释放综合 征)和mas(巨噬细胞活化综合征)的频率。本研究的次要目的包括：(1) 确定rna cart123细胞的持续性和运输；
(2)通过测量外周血和骨髓中母细 胞计数的减少来估计至少1个剂量的rna cart123细胞在aml受试者中的 功效；(3)通过测量在28+/-5天的总响应率(orr)估计至少1个剂量的rnacart123细胞在aml受试者中的功效，其使用(i)标准形态完全反应标准(恶 性母细胞<5％，有计数恢复)，(ii)恶性母细胞<5％，无计数恢复，和(iii) 最小残留疾病评估；(4)确定所有受试者的总体存活(os)和无进展生存(pfs) 和死亡原因，直到rna cart123细胞输注后6个月；(5)确定响应受试者的 响应持续时间(dor)，直到rna cart123细胞输注后6个月；和(6)确 定进行同种异体hct(或第二同种异体hct)的受试者的百分比。
[1449]
合格的受试者是18岁以上的患有aml或脊髓发育不良综合征的男性或女 性，使用当前可用的治疗没有可用的治愈性治疗选择。具有继发或之后的复发、 任何对挽救难治性的复发或在至少两条线的治疗后具有持续性疾病的受试者。 受试者必须在筛选前2周内在骨髓抽吸物或活组织检查中具有>5％母细胞的可 评估疾病或髓外疾病(禁止cns参与)。
[1450]
在2周内用iv施用rna抗cd123 car t细胞治疗受试者总共多达6个 剂量。根据受试者体重采用受试者内剂量递增给药。受试者被分成两组。组1 包括接受rna cart123细胞的前3个受试者，和接受3个递增剂量的rnacart123细胞，在输注之前没有淋巴细胞消耗化疗(图70)。组2包括研究 中剩余的12个受试者，并以递增的剂量接受多达六个iv剂量的rna cart123 细胞(图71)。在第一次cart123细胞输注前(如果alc>500/ul)，可以 对组2进行淋巴细胞消耗化疗4天(+/-1天)。可以在第四剂量的rna cart123 细胞之前(如果alc>500/ul)重复淋巴细胞消耗化疗。淋巴细胞消耗化疗包 括单剂量的环磷酰胺(1mg/m2)。rna cart123治疗方案中的淋巴细胞消耗 化疗剂量设计为通过增强内稳态空间来增加随后t细胞剂量的移植。
[1451]
以重量计的cart细胞的剂量在下表中提供：
[1452]
受试者重量剂量1剂量2剂量3-6总car+细胞<100kg1x106/kg2x106/kg4x106/kg1.9x107/kg≥100kg1x1082x1084x1081.9x109[1453]
用于给药的重量可以是在单采程序之前获得的重量。细胞数目基于通过流 式细胞术测定的具有car表达的car+细胞。对于受试者体重变化，不改变剂 量。所示剂量为+/-20％以解释制造变异性。
[1454]
下面提供了样品rna cart123施用方案：
[1455][1456]
将根据aml的护理临床实践标准进行基线和随后的肿瘤评估。如果受试 者的最后一次骨髓在第一次环磷酰胺剂量之前超过2周进行，则可以进行基线 aml骨髓评估。受试者将在第16+/-2天(或在接受最后一次rna cart123 输注的7天内)、第28+/-5天和在第3和6个月时对于白血病响应进行骨髓评 估(对于未进行到allohct的受试者)。在tcsl研究实验室通过适当的测试 来确定cart细胞水平和细胞因子。疾病响应定义可以作为aml的标准。
[1457]
具有脊髓发育不良的所有受试者在d28+/-5(或最后一次t细胞输注后14 天，以先发生者为准)将经历同种异体造血细胞移植(allohct)作为挽救策略。 因此，所有受试者应具有之前鉴定的干细胞供体。脊髓发育不良定义为与该年 龄正常的相比细胞构成上降低>75％，结合anc<0.5k/ul或血小板<50k/ul。
[1458]
治疗限制性毒性(tlt)定义为可以、可能或明确与t细胞输注相关的任 何意外事件，包括非血液3级或更高级不良事件和任何3级或更高级超敏反应 和自身免疫反应，如在第5.5节中定义的。以下事件不包括tlt：发热和感染、 任何级别的血细胞减少、肿瘤溶解综合征、细胞因子释放综合征或在七天内定 为2级或更低级别的任何代谢或实验室异常。
[1459]
在开始第一剂量的rna cart123细胞时开始不良事件报告，并且将持续 到第4个月或直到针对hct或另一替代疗法的调理启动，以先发生者为准。受 试者可以连续重新评估急性和累积毒性的证据。
[1460]
等同物
[1461]
本文引用的每份和每项专利、专利申请和出版物的公开内容因此通过引用 的方式完整并入本文。尽管本发明已经参考具体方面公开，但显而易见本发明 的其他方面和变型可以由本领域其他技术人员构思，而不脱离本发明的真实精 神和范围。所附权利要求意在解释成包括全部此类方面和等同变型。