聚乙二醇修饰的rhBNP及其用途的制作方法

本发明涉及生物医药领域，更具体地涉及一种聚乙二醇修饰的rhbnp及其用途。

背景技术：

b型利钠肽(bnp)为人体分泌的一种内源性多肽，主要由心室分泌合成，前体含有108个氨基酸，加工后释放出含有32个氨基酸的成熟bnp分子。bnp的主要作用是拮抗肾素-血管紧张素-醛固酮系统，可通过抑制肾素和醛固酮分泌、增加肾小球滤过率和抑制肾髓质集合管钠重吸收，从而达到排钠、利尿的作用；还可通过直接松弛血管平滑肌和拮抗血管紧张素ⅱ的作用而扩张血管，通过抑制平滑肌细胞增生而影响血管重塑。静脉给予bnp能迅速改善血流动力学状态，可用于急性失代偿性心力衰竭的治疗。但是，bnp的相对分子质量较小，易被肾小球滤过，其半衰期约为18min，必须持续给药方才能奏效，患者的用药依从性相对较低。因此，本领域需要开发半衰期长、生物利用度高的长效化bnp药物，从而减少病人的用药次数和用药时间。

目前已经有对rhbnp进行长效修饰的报道，其相对未修饰的rhbnp具有较长的半衰期，但是活性均不理想。如文献报道(丁月娣等，中国生物制品杂志，2009：226-229)通过重叠pcr方法将人bnp二联体基因与人血清白蛋白(humanserumalbumin，hsa)基因连接，其半衰期延长但活性较低，仅为rhbnp标准品的1％。专利cn2015102346757公开了一种长效重组人脑钠肽融合蛋白(rhbnp-fc)及其制备方法，但是未见体内生物学活性报道。

由于融合蛋白容易影响分子的体内活性，涉及技术含量高，工艺研究工作量大，而且容易产生免疫原性等副作用，使得现有技术中的经修饰的rhbnp还不能满足医疗需要。因此，本领域迫切需要开发一种毒副作用小、生物活性高、且半衰期长的修饰型rhbnp及其药用盐。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种聚乙二醇修饰的rhbnp及其用途。

在本发明的第一方面，提供了一种修饰型rhbnp，所述修饰型rhbnp的一个或多个氨基酸残基与聚乙二醇偶联(经聚乙二醇进行偶联修饰)。

在另一优选例中，所述的rhbnp的序列如seqidno:1所示(spkmvqgsgcfgrkmdrissssglgckvlrrh)。

在另一优选例中，所述聚乙二醇与rhbnp的n端的丝氨酸残基偶联。

在另一优选例中，所述的聚乙二醇(即peg)与氨基酸残基中氨基、巯基、羧基、羟基中的至少一种进行偶联。

在另一优选例中，所述的聚乙二醇与所述丝氨酸残基的氨基、羟基中的至少一种进行偶联。

在另一优选例中，所述的聚乙二醇为甲氧基聚乙二醇(即mpeg)及其衍生物。

在另一优选例中，所述聚乙二醇为烷基化聚乙二醇或醛基化聚乙二醇。

在另一优选例中，所述甲氧基聚乙二醇衍生物的通式如下：

mpeg-x,

其中，x为官能团。

在另一优选例中，所述的官能团为烷基化官能团或酰基化官能团。

在另一优选例中，所述官能团为烷基化官能团，且所述的聚乙二醇为mpeg-醛、mpeg-三氟乙磺酸。

在另一优选例中，所述聚乙二醇选自下组：甲氧基聚乙二醇甲醛、甲氧基聚乙二醇乙醛、甲氧基聚乙二醇丙醛、甲氧基聚乙二醇丁醛、甲氧基聚乙二醇戊醛、或其组合。

在另一优选例中，所述聚乙二醇为甲氧基聚乙二醇丙醛。

在另一优选例中，所述官能团为酰基化官能团，且所述的聚乙二醇为mpeg-对硝基苯碳酸酯。

在另一优选例中，所述聚乙二醇的分子量为5kd-80kd，较佳地为10-30kd，更佳地为15-25kd。

在另一优选例中，所述聚乙二醇的分子量选自下组：5kd、10kd、20kd、30kd、40kd、50kd、或其组合。

在另一优选例中，所述聚乙二醇的分子量为10kd、20kd或30kd，较佳地为10kd或20kd。

在另一优选例中，所述的聚乙二醇通过rhbnp的n端氨基修饰于所述的rhbnp上。

在另一优选例中，所述修饰型rhbnp的n端氨基与聚乙二醇偶联。

在另一优选例中，所述修饰型rhbnp的n端氨基与聚乙二醇醛衍生物进行偶联。

本发明第二方面，提供了一种制备修饰型rhbnp的方法，包括步骤：

将rhbnp与聚乙二醇进行偶联反应，从而获得所述的修饰型rhbnp。

在另一优选例中，在还原剂存在的条件下进行所述偶联反应。

在另一优选例中，所述的还原剂选自下组：氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、醋酸硼氢化钠、硼氢化钠、或其组合。

在另一优选例中，所述的还原剂为氰基硼氢化钠。

在另一优选例中，在ph3-7，较佳地在ph4-6的条件下，进行偶联反应。

在另一优选例中，利用缓冲溶液调节ph，较佳地，所述缓冲溶液为醋酸缓冲液或柠檬酸缓冲液。

在另一优选例中，所述偶联反应的反应时间为4-20小时，较佳地为8-18小时，更佳地为10-14小时。

在另一优选例中，所述的偶联反应的反应温度为0-28℃，较佳地为10-25℃；更优选地，为15-25℃。

在另一优选例中，所述聚乙二醇与所述rhbnp的摩尔比为1：(0.2-4)，较佳地为1：(0.5-3)，更佳地为1：(0.8-2)。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：

(a)将rhbnp和聚乙二醇混合，调节ph为4-6，从而获得反应混合液，其中所述聚乙二醇与所述rhbnp的摩尔比为1：(0.5-3)，

(b)在0-28℃的条件下，将步骤(a)反应混合液在搅拌条件下反应4-20小时；

(c)对步骤(b)所得的混合液进行分离，从而获得所述修饰型rhbnp。

在另一优选例中，步骤(a)中，所述的反应混合物中，所述rhbnp的浓度为0.5-8mg/ml，较佳地为1-6mg/ml。

在另一优选例中，步骤(a)中，所述的缓冲溶液为柠檬酸缓冲液或醋酸缓冲液。

在另一优选例中，步骤(b)中，所述的反应混合物在10-25℃下反应，较佳地，在15-25℃下反应。

在另一优选例中，步骤(b)中，在还原剂存在的条件下进行所述反应。

在另一优选例中，所述的还原剂选自下组：氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、醋酸硼氢化钠、硼氢化钠、或其组合。

在另一优选例中，所述还原剂与所述rhbnp的摩尔比为(3-10)：1，较佳地为(5-7)：1。

在另一优选例中，所述的修饰型rhbnp的聚乙二醇修饰率为60-99％。

本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括：

(a)本发明第一方面所提供的修饰型rhbnp，

以及任选的(b)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物组合物用于治疗心脏疾病，较佳地为心力衰竭。

在另一优选例中，所述的药物组合物为注射液、口服液、粉制剂，优选注射液。

本发明的第四方面，一种本发明第一方面所提供的修饰型rhbnp的用途，用于制备治疗心脏疾病的药物。

在另一优选例中，所述的心脏疾病包括心力衰竭。

在另一优选例中，所述的心脏疾病为人心脏疾病。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明实施例2中peg10kd-rhbnp的20％sds-page电泳图。其中，泳道1、泳道2、泳道3为e1、e2、e3(还原电泳),泳道4为marker,泳道5、泳道6、泳道7为e3、e1、e2(非还原电泳)，泳道8为rhbnp。

图2显示了修饰型rhbnp/bnp药-时曲线。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现一种聚乙二醇修饰的rhbnp及其药用盐和用途。具体地，本发明提供了一种n端氨基与聚乙二醇醛衍生物偶联的修饰型rhbnp。本发明还提供了所述修饰型rhbnp在制备治疗心脏疾病的药物中的应用。实验表明，本发明的修饰型rhbnp半衰期长、生物活性高、毒副作用小。在此基础上完成本发明。

rhbnp

rhbnp，即重组人脑利钠肽，是利用重组dna技术在原核细胞中表达的人脑利钠肽。人脑利钠肽与特异性的利钠肽受体(该受体与鸟苷酸环化酶相藕联)相结合，引起了细胞内环单磷酸鸟苷(cgmp)的浓度升高和平滑肌细胞的舒张。作为第二信使，cgmp能扩张动脉和静脉，迅速降低全身动脉压、右房压和肺毛细管楔压，从而降低心脏的前后负荷，并迅速减轻心衰患者的呼吸困难程度和全身症状。。

本发明涉及的rhbnp来源于含有rhbnp表达载体的原核细胞的发酵液，由上海景泽生物技术有限公司生物合成，氨基酸序列如seqidno:1所示。。

本发明提供了一种修饰型rhbnp，所述修饰型rhbnp的一个或多个氨基酸残基与聚乙二醇偶联(经聚乙二醇进行偶联修饰)。

制备方法

本发明提供了修饰型rhbnp的制备方法，所述方法包括下述步骤：

a.调节聚乙二醇与rhbnp的摩尔比为1：(0.2-4)；

b.将所述的rhbnp与所述的修饰用聚乙二醇溶于ph＝4-6的缓冲溶液中，获得反应混合物；

c.0～28℃下，所述的反应混合物在搅拌下反应4-20小时；

d.分离获得经修饰的rhbnp；

其中，所述的聚乙二醇为甲氧基聚乙二醇(即mpeg)及其衍生物，具体地，所述聚乙二醇选自下组：甲氧基聚乙二醇甲醛、甲氧基聚乙二醇乙醛、甲氧基聚乙二醇丙醛、甲氧基聚乙二醇丁醛、甲氧基聚乙二醇戊醛、mpeg-对硝基苯碳酸酯、或其组合。

药物组合物

本发明提供了一种药物组合物，其包括治疗有效量的本发明的修饰型rhbnp、赋形剂、稀释剂或载剂。

进一步地，本发明药物可用于单一治疗或联合治疗中。当用于联合治疗中时，本发明的药物组合物通常与其他心脏疾病治疗药物一起使用。

典型的配方是通过混合本发明的修饰型rhbnp和载剂、稀释剂或赋形剂而制备之。适宜的载剂、稀释剂或赋形剂是本领域技术人员所熟知的，包括诸如碳水化合物、蜡、水溶性及/或可膨胀性聚合物、亲水性或疏水性物质、明胶、油、溶剂、水等的物质。所用的特定载剂、稀释剂或赋形剂，将依施用本发明的化合物的方式与目的而定。一般以本领域技术人员认为可安全(gras)地投药至一哺乳类动物的溶剂为基础，而选择溶剂。一般而言，安全的溶剂是无毒性含水溶剂诸如水，以及其他可溶于水或与水混溶的无毒性溶剂。适宜的含水溶剂包括水、乙醇、丙二醇、聚乙二醇(如peg400、peg300)等及其混合物。该配方也可包括一种或多种缓冲剂、安定剂、表面活性剂、润湿剂、润滑剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、助流剂、加工助剂、着色剂、增甜剂、香料剂、调味剂及其他已知的添加剂，以提供该药物之一优美的呈现形式(亦即本发明的化合物或其药学组合物)，或协助该药学产物(亦即药物)之制造。

该配方可使用常规的溶解混合程序而制备。例如，在上述的一种或多种赋形剂的之存在下，将块状的药物物质(亦即本发明的化合物或该化合物的稳定化形式(如与一环糊精衍生物或其他已知的复合剂的络合物)溶于一适宜溶剂中。典型地将本发明的化合物配制成药学剂型，以提供该药物的容易控制的剂量，及提供患者一种雅致与容易处理的产物。

依据本发明的方法，本发明的一种化合物或本发明的一种化合物与至少一种其他药剂的组合(在此称作“组合”)，优选是以药学组合物的形式投药。因此，本发明的化合物或组合能以任一已知的口服、直肠、透皮、胃肠外(例如静脉内、肌内或皮下)脑池内、阴道内、腹膜内、膀胱内、局部(例如粉末、油膏或液滴)、颊或鼻剂型，而分开或一起投药至一病患。

适用于非经肠注射的组合物，一般包括药学上可接受的无菌含水或非水溶液、分散液、悬浮液或乳化液，及用于重组成为无菌的可注射性溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水或非水载剂或稀释剂(包括溶剂与载体)，包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)及其适宜的混合物；植物油(诸如橄榄油)；及可注射性有机酯诸如油酸乙酯。例如可通过使用一涂层诸如卵磷脂，在分散液的情况下，维持所需的颗粒尺寸，及通过使用表面活性剂，而维持适宜的流动性。

这些组成物亦可含有赋形剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂及分散剂。可通过各种的杀细菌剂与杀真菌剂，例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等，而避免微生物污染该组合物。包括等渗压剂诸如糖类、氯化钠等，可能亦为所欲的。可通过使用能延迟吸收的药剂，诸如单硬脂酸铝与明胶，而延长可注射式药学组合物之吸收。

对于本发明的药物组合物，可通过常规的方式施用于所需的对象(如人和非人哺乳动物)。代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、注射、雾化吸入等。优选的施用方式为注射。

使用药物组合物时，是将安全有效量的药物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明的修饰型rhbnp半衰期长，给药频次小。

(b)本发明的修饰型rhbnp所用的序列与人体异源性小，不易产生免疫反应。

(c)本发明的修饰型rhbnp不易被人体中的酶降解或从肾脏排出。

(d)本发明的修饰型rhbnp生物活性高于其它长效修饰方式。

(e)本发明的修饰型rhbnp无毒副作用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例中涉及rhbnp由上海景泽生物技术有限公司合成，所用mpeg丙醛和对硝基苯碳酸酯购自日本nofcorporation。

实施例15kdmpeg丙醛与rhbnp的反应

量取16ml生物合成的浓度为4mg/ml的rhbnp，称取92.38mg5kdmpeg丙醛(甲氧基聚乙二醇丙醛)溶于量取的rhbnp，用柠檬酸缓冲液调节ph5，25℃条件下混匀5分钟(rhbnp与5kdmpeg丙醛的摩尔比为1:1)。添加还原剂三乙酰氧基硼氢化钠(rhbnp与三乙酰氧基硼氢化钠的摩尔比为1:5)，反应10小时。

通过阳离子交换层析柱，使用酸性ph的nacl梯度，在spsepharosefastflow柱(ge)上将聚乙二醇化的化合物与游离peg及游离多肽分离，得到peg5kd-rhbnp。

实施例210kdmpeg丙醛与rhbnp的反应

量取16ml生物合成的浓度为4mg/ml的rhbnp，称取184.76mg10kdmpeg丙醛(甲氧基聚乙二醇丙醛)溶于量取的rhbnp，用柠檬酸缓冲液调节ph4.8，25℃条件下混匀5分钟(rhbnp与10kdmpeg丙醛的摩尔比为1:1)。添加还原剂氰基硼氢化钠(rhbnp与氰基硼氢化钠的摩尔比为1:7)，反应14小时。

通过阳离子交换层析柱，使用酸性ph的nacl梯度，在spsepharosefastflow柱(ge)上将聚乙二醇化的化合物与游离peg及游离多肽分离，得到peg10kd-rhbnp。

实施例310kdmpeg对硝基苯碳酸酯与rhbnp的反应

量取16ml生物合成的浓度为4mg/ml的rhbnp，称取184.76mg10kdmpeg对硝基苯碳酸酯溶于量取的rhbnp，用柠檬酸缓冲液调节ph5，25℃条件下混匀5分钟(rhbnp与10kdmpeg对硝基苯碳酸酯衍生物的摩尔比为1:1)，反应10小时。

通过阳离子交换层析柱，使用酸性ph的nacl梯度，在spsepharosefastflow柱(ge)上将聚乙二醇化的化合物与游离peg及游离多肽分离，得到peg10kd-rhbnp。

实施例420kdmpeg丙醛与rhbnp的反应

量取8ml生物合成的浓度为4mg/ml的rhbnp，称取184.76mg20kdmpeg丙醛(甲氧基聚乙二醇丙醛)溶于量取的rhbnp，用柠檬酸缓冲液调节ph5，25℃条件下混匀4分钟(rhbnp与20kdmpeg丙醛的摩尔比为1:1)。添加还原剂氰基硼氢化钠(rhbnp与三乙酰氧基硼氢化钠的摩尔比为1:5)，反应10小时。

通过阳离子交换层析柱，使用酸性ph的nacl梯度，在spsepharosefastflow柱(ge)上将聚乙二醇化的化合物与游离peg及游离多肽分离，得到peg20kd-rhbnp。

实施例520kdmpeg对硝基苯碳酸酯与rhbnp的反应

量取32ml生物合成的浓度为2mg/ml的rhbnp，称取369.52mg20kdmpeg对硝基苯碳酸酯溶于量取的rhbnp，用柠檬酸缓冲液调节ph5.5，25℃条件下混匀4分钟。rhbnp与20kdmpeg对硝基苯碳酸酯衍生物的摩尔比为1:1，反应8小时。

通过阳离子交换层析柱，使用酸性ph的nacl梯度，在spsepharosefastflow柱(ge)上将聚乙二醇化的化合物与游离peg及游离多肽分离，得到peg20kd-rhbnp。

实施例620kdmpeg丙醛与rhbnp的反应

量取16ml生物合成的浓度为4mg/ml的rhbnp，称取369.52mg20kdmpeg丙醛(甲氧基聚乙二醇丙醛)溶于量取的rhbnp，用柠檬酸缓冲液调节ph4.5，25℃条件下混匀5分钟(rhbnp与20kdmpeg丙醛的摩尔比为1:1)。添加还原剂氰基硼氢化钠(rhbnp与氰基硼氢化钠的摩尔比为1:6)，反应12小时。

通过阳离子交换层析柱，使用酸性ph的nacl梯度，在spsepharosefastflow柱(ge)上将聚乙二醇化的化合物与游离peg及游离多肽分离，得到peg20kd-rhbnp。

实施例730kdmpeg丙醛与rhbnp的反应

量取8ml生物合成的浓度为4mg/ml的rhbnp，称取277.14mg30kdmpeg丙醛(甲氧基聚乙二醇丙醛)溶于量取的rhbnp，用柠檬酸缓冲液调节ph5，25℃条件下混匀5分钟。(rhbnp与30kdmpeg丙醛的摩尔比为1:1)。添加还原剂氰基硼氢化钠，(rhbnp与氰基硼氢化钠的摩尔比为1:7)，反应12小时。

通过阳离子交换层析柱，使用酸性ph的nacl梯度，在spsepharosefastflow柱(ge)上将聚乙二醇化的化合物与游离peg及游离多肽分离，得到peg30kd-rhbnp。

实施例8rhbnp的peg修饰产物体外活性测定

根据bnpr信号转导通路，bnp与天然受体结合后，可激活其胞内区的鸟苷酸环化酶活性，催化gtp转化为cgmp,继而发挥生物学效应，通过竞争性的elisa试验方法检测bnp刺激后293gcac3细胞(gca高表达的人肾上皮细胞系)分泌到细胞上清中的cgmp含量变化，即可判断bnp活性能力。

接种293gcac3细胞至96孔板，细胞密度为1.0*10⁵个/ml。加入不同浓度的工作标准品和供试品适量,37℃培养箱中培养1.5h，取细胞上清液50ul至96孔酶标板中，酶标板预先加入合适浓度抗cgmp多抗溶液，600rpm震荡3小时，弃去上清，加100ul显色液，室温避光10-15min,加100ul终止液，显色反应结束后15min在酶标仪450nm处检测样品吸光值并计算酶活。

数据处理和统计分析如下：

ec50为引起50％最大效应时的浓度值，可以反映出配体对受体的激动活性，是研究配体和受体之间结合、激动的一个重要指标。利用cgmp的表达量对应药物刺激的浓度可以用softmax软件绘制出rhbnp(seqidno：1)、peg5kd-rhbnp(实施例1制备)、peg10kd-rhbnp(实施例2制备)和peg20kd-rhbnp(实施例4制备)的ec50曲线。

计算方法为：

以样品的稀释倍数为x轴，以其450nm吸光度为y轴，用softmax软件以四参数回归计算法进行处理，拟合方程为

abcd为四个曲线拟合参数，四个参数生物学意义为：

a:上平台od值

b：斜率

c：供试样品生物学活性，即半数有效稀释倍数

体外活性测定的实验结果如表1所示，

表1

注：各个样品的生物活性百分比是以未经修饰的rhbnp的生物活性为100％，经计算所得。

实施例9静脉推注给药对戊巴比妥钠致心衰新西兰兔的治疗作用

按照实施例4中方法用20kdmpeg丙醛修饰rhbnp,纯化后得到高纯度的peg20kd-rhbnp，用于后续动物实验。

约6-8月龄新西兰兔32只随机分为4组：

1)pbs对照组。

2)9μg/kgpeg20kd-rhbnp组；

3)18μg/kgpeg20kd-rhbnp组；

4)27μg/kgpeg20kd-rhbnp组；

戊巴比妥至心衰模型成模，立即以9ug/kg、18ug/kg、27ug/kg进行冲击剂量治疗，分别以0.045ug/kg/min、0.090ug/kg/min、0.135ug/kg/min给药。

开始给药后60分钟及给药结束后60分钟进行血流动力学检查。左心室收缩压见表2。

表2

*给药组与溶媒对照组比较*p<0.05**p<0.01溶媒对照组，因心衰时间较长未给予治疗最终导致死亡

根据新西兰兔体重(3.5kg±0.3kg)，单次耳缘静脉推注给药。给药2小时候后，左心室收缩压(lvsp)升高，表明本品对左心功能改善和恢复均有药效作用，且呈剂量相关性。

实施例10高剂量静脉推注对新西兰兔的毒性试验

按照实施例2和实施例4中方法用20kdmpeg丙醛修饰rhbnp，纯化后得到高纯度的peg20kd-rhbnp，用于后续动物实验。

约6-8月龄新西兰兔32只随机分为4组：

1)9μg/kgpeg20kd-rhbnp组；

2)36μg/kgpeg20kd-rhbnp组；

3)72μg/kgpeg20kd-rhbnp组；

4)pbs对照组

根据新西兰兔体重(3.5kg±0.3kg)，单次耳缘静脉推注给药。观察连续给药14天内新西兰兔死亡情况。直至观察期结束，本发明实施例组无一例新西兰兔死亡，均活动自如，而对比例组中则出现1只新西兰兔死亡。结果表明，对比例小组的生理毒性要大于本发明组。

实施例11peg10kd-rhbnp和peg20kd-rhbnp药代动力学测定

16只10kgbeagle犬，随机分成4组，每组雌雄各2只，分别股静脉注射实施例1、实施例2和实施例4制备的peg5kd-rhbnp、peg10kd-rhbnp、peg20kd-rhbnp，rhbnp(新活素，市售)作为阳性对照。rhbnp注射剂量为9ug/kg，peg5kd-rhbnp注射剂量为20ug/kg，peg10kd-rhbnp注射剂量为35ug/kg，peg20kd-rhbnp剂量均为45μg/kg，注射体积1ml/kg。注射后0、5min、15min、30min、1h、2h、3h、4h、12h、48h、72h股静脉取血，置于1％肝素抗凝处理过的1.0ml离心管中，4℃，3000rpm离心10min收集血浆，-20℃保存。采用elisa试剂盒(abcam公司，英国)，采用直接化学发光技术进行全自动双抗夹心免疫测定方法，采用一定量的双单克隆抗体，测定各时间点血浆中bnp含量。

结果显示，peg20kd-rhbnp有一个缓慢释放过程，其半衰期t/2为20h；rhbnp半衰期约为18min；药-时曲线及血药浓度如图2所示。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海景泽生物技术有限公司

江苏璟泽生物医药有限公司

成都泽研生物技术有限公司

<120>聚乙二醇修饰的rhbnp及其用途

<130>p2019-1945

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>32

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

serprolysmetvalglnglyserglycyspheglyarglysmetasp

151015

argileserserserserglyleuglycyslysvalleuargarghis

202530