一种用于从江香猪肠段组织总RNA的提取方法与流程

本发明涉及生命科学技术和自然科学技术领域，尤其是一种用于从江香猪肠段组织总rna的提取方法。

背景技术：

核酸提取是分子生物学试验的基础，高质量的核酸是进行分子标记、基因克隆及基因表达研究等下游技术的必要前提。随着现代分子生物学技术的飞速发展，对于rna的研究已成为目前的研究热点之一。为了获得高质量的总rna，目前，虽然市场上有众多的总rna提取试剂(试剂盒)，但是在实际操作过程中，由于受到实验操作环境、实验室条件和实验操作手法等诸多因素的影响，往往很难获得稳定性好、纯度高的总rna，因此，寻找一种高效、经济、简便、稳定性好、纯度高的总rna提取方法显得尤为必要。

申请号cn200710093163.9，动物关节软骨组织总rna提取方法，其特征在于该方法有以下步骤：(1)取动物关节软骨组织，研磨，加入变性液，β-巯基乙醇，匀浆；(2)冰水浴下，加酸性水饱和酚，摇匀，加醋酸钠，氯仿、异戊醇混合液，冰水浴上15min；(3)4℃下，离心，取上清液，加氯仿、异戊醇混合液，离心取上清，加异丙醇，-20℃下沉淀，离心，得到凝胶状rna和蛋白多糖混合沉淀，加无rna酶水，溶解得胶状溶液；(4)取胶状溶液用plantrnaout试剂盒的rna提取步骤得到总rna沉淀，取沉淀，乙醇洗涤后用无rna酶水溶解沉淀，即得关节软骨组织总rna溶液。

申请号cn200710093163.9，操作步骤复杂，plantrnaout试剂盒提取的总rna稳定性不好，纯度低，成本高。

申请号cn201711496653.3，一种用于动物组织总rna提取的方法，其特征在于提供一种用于动物(畜禽)组织总rna提取的方法，其特征在于样品的处理步骤包括：样品加入已装有1mltrizol试剂的离心管中，在2000-2800r/min振荡混匀，冰上放置5-10min；加入0.22ml氯仿，漩涡振荡15s或上下颠倒摇晃1min，冰上放置3min，在4℃离心机12000×g离心15min；离心完成的溶液分为三层，上层为水相层，中间为白色杂质层，下层为粉红色有机层；悬空吸取上层水相层转移至干净的离心管中，分别加入600μl异丙醇、600μl氯化钠和柠檬酸钠混合液，轻柔上下颠倒混匀，冰上放置10min或-20℃放置20min；12000×g4℃离心10min，弃上清；加入1.2ml质量百分比为75％乙醇洗涤沉淀，轻柔上下颠倒，使白色沉淀悬浮；12000×g4℃离心3min，弃上清；重复采用1.2ml质量百分比为75％乙醇洗涤沉淀，轻柔上下颠倒，使白色沉淀悬浮，置于冰上静置5min，7500×g4℃离心5min，弃上清；7500×g4℃离心30s，用移液枪头吸掉多余液体，室温干燥3-5min。

申请号cn201711496653.3，操作步骤复杂，提取中加入的异丙醇、氯化钠和柠檬酸钠混合液性质不稳定，混合液各成分量难以控制，容易造成提取过程中高盐的形成和醇沉不完全现象，影响提取动物组织总rna产品纯度、稳定性及收率。

为了有效解决目前动物组织总rna提取法复杂，提取总rna产品纯度低、稳定性不好、收率低等问题，发明人通过对从江香猪肠段组织总rna的提取方法进行了大量的实验，摸索出从江香猪肠段组织总rna的提取方法，样品加入1mltrizolrna裂解液，通过震荡器剧烈震荡，冰上静置，再用高速离心机离心，取上清液，加入氯仿，振摇混匀，待溶液呈浑浊状后置于冰上静置，再离心，直接去离心管中除白色沉淀以外的液体；再加入75％乙醇溶液洗涤白色沉淀，使沉淀在管中悬浮，再将离心管放入高速冷冻离心机中，弃去离心管内的乙醇即得总rna。经该方法简便易行，成本低，收率高，提取的总rna产品纯度高、稳定性好。为指导分子生物学研究应用及其他动物组织总rna提取提供较高的研究价值。

技术实现要素：

本发明的目的提供一种用于从江香猪肠段组织总rna的提取方法。

本发明所述的一种用于从江香猪肠段组织总rna的提取方法具体步骤为：

(1)实验准备：将剪刀、镊子、药匙、研钵、研棒用锡箔纸包好灭菌，灭菌后烘干,再与无酶枪头、20-200μl移液器、100-1000μl移液器、1.5ml离心管、离心管架、酒精灯、酒精棉球置于超净工作台中紫外杀菌处理；

(2)样品准备：从-80℃冰箱内或-196℃液氮中取出从江香猪直肠或盲肠或结肠组织传入超净工作台中，放在冰上解冻3-8min，用镊子夹出组织样并用剪刀剪成大小适中的块状放入研钵中，用研棒研成粉末状，备用；

(3)总rna的提取：①取研好的粉末80-120mg于装有1mltrizolrna裂解液的离心管中，震荡20-40s后置于冰上静置20-35min，再用高速离心机14000rpm离心10-20min；②取上清液500μl至灭菌好的离心管中，加入200μl氯仿，振摇20-40s混匀，待溶液呈浑浊状后置于冰上静置5-20min，再以14000rpm离心8-12min，弃去离心管中除白色沉淀以外的液体；③再向离心管中加入0.5-1.5ml75％乙醇溶液洗涤白色沉淀，使沉淀在管中悬浮，再将离心管放入高速冷冻离心机中，4℃、7500rpm离心4-6min，弃去离心管内的乙醇；④将含有白色沉淀的离心管倒扣在面巾纸上25-35min，晾干乙醇溶液，即得总rna；

(4)rna的筛选及保存：向总rna的离心管中加入20-60μlrnase/dnase-freewater并静置2-12min，待白色沉淀完全溶解，取1μl在超微量分光光度计中测定其浓度与纯度值，将浓度在1000ng/μl，od260/280值在1.80-2.10之间的rna统一定量后置于冰箱保存。

优选的

本发明所述的一种用于从江香猪肠段组织总rna的提取方法具体步骤为：

(1)实验准备：将剪刀、镊子、药匙、研钵、研棒用锡箔纸包好灭菌，灭菌后烘干,再与无酶枪头、20-200μl移液器、100-1000μl移液器、1.5ml离心管、离心管架、酒精灯、酒精棉球置于超净工作台中紫外杀菌处理；

(2)样品准备：从-80℃冰箱内或-196℃液氮中取出从江香猪直肠或盲肠或结肠组织传入超净工作台中，放在冰上解冻4-7min，用镊子夹出组织样并用剪刀剪成大小适中的块状放入研钵中，用研棒研成粉末状，备用；

(3)总rna的提取：①取研好的粉末90-110mg于装有1mltrizolrna裂解液的离心管中，震荡28-32s后置于冰上静置22-32min，再用高速离心机14000rpm离心12-18min；②取上清液500μl至灭菌好的离心管中，加入200μl氯仿，振摇25-35s混匀，待溶液呈浑浊状后置于冰上静置8-18min，再以14000rpm离心9-11min，弃去离心管中除白色沉淀以外的液体；③再向离心管中加入0.8-1.2ml75％乙醇溶液洗涤白色沉淀，使沉淀在管中悬浮，再将离心管放入高速冷冻离心机中，4℃、7500rpm离心4-6min，弃去离心管内的乙醇；④将含有白色沉淀的离心管倒扣在面巾纸上28-32min，晾干乙醇溶液，即得总rna；

(4)rna的筛选及保存：向总rna的离心管中加入25-55μlrnase/dnase-freewater并静置3-11min，待白色沉淀完全溶解，取1μl在超微量分光光度计中测定其浓度与纯度值，将浓度在1000ng/μl，od260/280值在1.80-2.10之间的rna统一定量后置于冰箱保存。

进一步优选的

本发明所述的一种用于从江香猪肠段组织总rna的提取方法具体步骤为：

(1)实验准备：将剪刀、镊子、药匙、研钵、研棒用锡箔纸包好灭菌，灭菌后烘干,再与无酶枪头、20-200μl移液器、100-1000μl移液器、1.5ml离心管、离心管架、酒精灯、酒精棉球置于超净工作台中紫外杀菌处理；

(2)样品准备：从-80℃冰箱内或-196℃液氮中取出从江香猪直肠或盲肠或结肠组织传入超净工作台中，放在冰上解冻5min，用镊子夹出组织样并用剪刀剪成大小适中的块状放入研钵中，用研棒研成粉末状，备用；

(3)总rna的提取：①取研好的粉末100mg于装有1mltrizolrna裂解液的离心管中，震荡30s后置于冰上静置25-30min，再用高速离心机14000rpm离心15min；②取上清液500μl至灭菌好的离心管中，加入200μl氯仿，振摇30s混匀，待溶液呈浑浊状后置于冰上静置10-15min，再以14000rpm离心10min，弃去离心管中除白色沉淀以外的液体；③再向离心管中加入1ml75％乙醇溶液洗涤白色沉淀，使沉淀在管中悬浮，再将离心管放入高速冷冻离心机中，4℃、7500rpm离心5min，弃去离心管内的乙醇；④将含有白色沉淀的离心管倒扣在面巾纸上30min，晾干乙醇溶液，即得总rna；

(4)rna的筛选及保存：向总rna的离心管中加入30-50μlrnase/dnase-freewater并静置5-10min，待白色沉淀完全溶解，取1μl在超微量分光光度计中测定其浓度与纯度值，将浓度在1000ng/μl，od260/280值在1.80-2.10之间的rna统一定量后置于冰箱保存。

本发明步骤(1)所述灭菌指121℃高温灭菌30min。

本发明步骤(1)所述烘干指置于60-70℃烘箱内烘干多余水分。

本发明步骤(1)所述紫外杀菌处理为紫外杀菌30min并吹风10min。

本发明步骤(2)所述研钵、研棒使用前需液氮预冷。

本发明步骤(3)中①所述震荡为震荡器剧烈震荡。

本发明步骤(3)中③所述的75％乙醇溶液由无水乙醇与depc水或rnase/dnase-freewater配制。

本发明步骤(4)所述置于冰箱保存，冰箱温度为-80℃。

本发明的有益效果

(1)本发明样品加入trizolrna裂解液溶解时，通过剧烈震荡后冰上静置，再经过高速离心，保证了组织样品溶解完全，为后序的提取收率提供保障。

(2)本发明取上清液500μl至灭菌好的离心管中，加入200μl氯仿，振摇20-40s混匀，待溶液呈浑浊状后置于冰上静置5-20min，再以14000rpm离心8-12min，分层好，可以直接弃去离心管中除白色沉淀以外的液体，不需用异丙醇、氯化钠和柠檬酸钠混合液进行处理，节约成本，提高效率。

(3)本发明经过筛选出浓度在1000ng/μl，od260/280值在1.80-2.10之间的rna置于-80℃冰箱保存，保证了rna产品的纯度和稳定性。

(4)该方法简便易行，成本低，收率高，无需纯化也能获得纯度高、稳定性好的总rna产品，为指导分子生物学研究应用及其他动物组织总rna提取提供较高的研究价值。

说明书附图

图1从江香猪肠段组织rna条带图

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：

(1)实验准备：将剪刀、镊子、药匙、研钵、研棒用锡箔纸包好121℃高温灭菌30min，灭菌后置于65℃烘箱内烘干多余水分,再与无酶枪头、20-200μl移液器、100-1000μl移液器、1.5ml离心管、离心管架、酒精灯、酒精棉球置于超净工作台中紫外杀菌30min并吹风10min后开始使用；

(2)样品准备：从-80℃冰箱内取出从江香猪直肠或盲肠或结肠组织传入超净工作台中，放在冰上解冻5min，用镊子夹出组织样并用剪刀剪成大小适中的块状放入液氮预冷过的研钵中，用液氮预冷过的研棒研成粉末状，备用；

(3)总rna的提取：①取研好的粉末100mg于装有1mltrizolrna裂解液的离心管中，利用震荡器剧烈震荡30s后置于冰上静置28min，再用高速离心机14000rpm离心15min；②取上清液500μl至灭菌好的离心管中，加入200μl氯仿，振摇30s混匀，待溶液呈浑浊状后置于冰上静置12min，再以14000rpm离心10min，弃去离心管中除白色沉淀以外的液体；③再向离心管中加入1ml75％乙醇溶液(由无水乙醇与depc水配制)洗涤白色沉淀，使沉淀在管中悬浮，再将离心管放入高速冷冻离心机中，4℃、7500rpm离心5min，弃去离心管内的乙醇；④将含有白色沉淀的离心管倒扣在面巾纸上30min，晾干乙醇溶液，即得总rna；

(4)rna的筛选及保存：向总rna的离心管中加入40μlrnase/dnase-freewater并静置8min，待白色沉淀完全溶解，取1μl在超微量分光光度计中测定其浓度与纯度值，将浓度在1000ng/μl，od260/280值在1.80-2.10之间的rna统一定量后置于-80℃冰箱保存。

实施例2：

(1)实验准备：将剪刀、镊子、药匙、研钵、研棒用锡箔纸包好121°c高温灭菌30min，灭菌后置于60℃烘箱内烘干多余水分,再与无酶枪头、20-200μl移液器、100-1000μl移液器、1.5ml离心管、离心管架、酒精灯、酒精棉球置于超净工作台中紫外杀菌30min并吹风10min后开始使用；

(2)样品准备：从-80℃冰箱内取出从江香猪直肠或盲肠或结肠组织传入超净工作台中，放在冰上解冻3min，用镊子夹出组织样并用剪刀剪成大小适中的块状放入液氮预冷过的研钵中，用液氮预冷过的研棒研成粉末状，备用；

(3)总rna的提取：①取研好的粉末80mg于装有1mltrizolrna裂解液的离心管中，利用震荡器剧烈震荡20s后置于冰上静置20min，再用高速离心机14000rpm离心10min；②取上清液500μl至灭菌好的离心管中，加入200μl氯仿，振摇20s混匀，待溶液呈浑浊状后置于冰上静置5min，再以14000rpm离心8min，弃去离心管中除白色沉淀以外的液体；③再向离心管中加入0.5ml75％乙醇溶液(由无水乙醇与depc水配制)洗涤白色沉淀，使沉淀在管中悬浮，再将离心管放入高速冷冻离心机中，4℃、7500rpm离心4min，弃去离心管内的乙醇；④将含有白色沉淀的离心管倒扣在面巾纸上25min，晾干乙醇溶液，即得总rna；

(4)rna的筛选及保存：向总rna的离心管中加入20μlrnase/dnase-freewater并静置2min，待白色沉淀完全溶解，取1μl在超微量分光光度计中测定其浓度与纯度值，将浓度在1000ng/μl，od260/280值在1.80-2.10之间的rna统一定量后置于-80℃冰箱保存。

实施例3：

(1)实验准备：将剪刀、镊子、药匙、研钵、研棒用锡箔纸包好121℃高温灭菌30min，灭菌后置于63℃烘箱内烘干多余水分,再与无酶枪头、20-200μl移液器、100-1000μl移液器、1.5ml离心管、离心管架、酒精灯、酒精棉球置于超净工作台中紫外杀菌30min并吹风10min后开始使用；

(2)样品准备：从-80℃冰箱内取出从江香猪直肠或盲肠或结肠组织传入超净工作台中，放在冰上解冻4min，用镊子夹出组织样并用剪刀剪成大小适中的块状放入液氮预冷过的研钵中，用液氮预冷过的研棒研成粉末状，备用；

(3)总rna的提取：①取研好的粉末85mg于装有1mltrizolrna裂解液的离心管中，利用震荡器剧烈震荡22s后置于冰上静置22min，再用高速离心机14000rpm离心12min；②取上清液500μl至灭菌好的离心管中，加入200μl氯仿，振摇22s混匀，待溶液呈浑浊状后置于冰上静置7min，再以14000rpm离心9min，弃去离心管中除白色沉淀以外的液体；③再向离心管中加入0.8ml75％乙醇溶液(由无水乙醇与depc水配制)洗涤白色沉淀，使沉淀在管中悬浮，再将离心管放入高速冷冻离心机中，4℃、7500rpm离心5min，弃去离心管内的乙醇；④将含有白色沉淀的离心管倒扣在面巾纸上28min，晾干乙醇溶液，即得总rna；

(4)rna的筛选及保存：向总rna的离心管中加入30μlrnase/dnase-freewater并静置5min，待白色沉淀完全溶解，取1μl在超微量分光光度计中测定其浓度与纯度值，将浓度在1000ng/μl，od260/280值在1.80-2.10之间的rna统一定量后置于-80℃冰箱保存。

实施例4：

(1)实验准备：将剪刀、镊子、药匙、研钵、研棒用锡箔纸包好121℃高温灭菌30min，灭菌后置于66℃烘箱内烘干多余水分,再与无酶枪头、20-200μl移液器、100-1000μl移液器、1.5ml离心管、离心管架、酒精灯、酒精棉球置于超净工作台中紫外杀菌30min并吹风10min后开始使用；

(2)样品准备：从-80℃冰箱内取出从江香猪直肠或盲肠或结肠组织传入超净工作台中，放在冰上解冻6min，用镊子夹出组织样并用剪刀剪成大小适中的块状放入液氮预冷过的研钵中，用液氮预冷过的研棒研成粉末状，备用；

(3)总rna的提取：①取研好的粉末90mg于装有1mltrizolrna裂解液的离心管中，利用震荡器剧烈震荡25s后置于冰上静置25min，再用高速离心机14000rpm离心14min；②取上清液500μl至灭菌好的离心管中，加入200μl氯仿，振摇25s混匀，待溶液呈浑浊状后置于冰上静置10min，再以14000rpm离心10min，弃去离心管中除白色沉淀以外的液体；③再向离心管中加入1ml75％乙醇溶液(由无水乙醇与depc水配制)洗涤白色沉淀，使沉淀在管中悬浮，再将离心管放入高速冷冻离心机中，4℃、7500rpm离心6min，弃去离心管内的乙醇；④将含有白色沉淀的离心管倒扣在面巾纸上30min，晾干乙醇溶液，即得总rna；

(4)rna的筛选及保存：向总rna的离心管中加入40μlrnase/dnase-freewater并静置6min，待白色沉淀完全溶解，取1μl在超微量分光光度计中测定其浓度与纯度值，将浓度在1000ng/μl，od260/280值在1.80-2.10之间的rna统一定量后置于-80℃冰箱保存。

实施例5：

(1)实验准备：将剪刀、镊子、药匙、研钵、研棒用锡箔纸包好121℃高温灭菌30min，灭菌后置于67℃烘箱内烘干多余水分,再与无酶枪头、20-200μl移液器、100-1000μl移液器、1.5ml离心管、离心管架、酒精灯、酒精棉球置于超净工作台中紫外杀菌30min并吹风10min后开始使用；

(2)样品准备：从-80℃冰箱内取出从江香猪直肠或盲肠或结肠组织传入超净工作台中，放在冰上解冻7min，用镊子夹出组织样并用剪刀剪成大小适中的块状放入液氮预冷过的研钵中，用液氮预冷过的研棒研成粉末状，备用；

(3)总rna的提取：①取研好的粉末95mg于装有1mltrizolrna裂解液的离心管中，利用震荡器剧烈震荡28s后置于冰上静置28min，再用高速离心机14000rpm离心16min；②取上清液500μl至灭菌好的离心管中，加入200μl氯仿，振摇28s混匀，待溶液呈浑浊状后置于冰上静置12min，再以14000rpm离心11min，弃去离心管中除白色沉淀以外的液体；③再向离心管中加入1.2ml75％乙醇溶液(由无水乙醇与rnase/dnase-freewater配制)洗涤白色沉淀，使沉淀在管中悬浮，再将离心管放入高速冷冻离心机中，4℃、7500rpm离心5min，弃去离心管内的乙醇；④将含有白色沉淀的离心管倒扣在面巾纸上32min，晾干乙醇溶液，即得总rna；

(4)rna的筛选及保存：向总rna的离心管中加入45μlrnase/dnase-freewater并静置8min，待白色沉淀完全溶解，取1μl在超微量分光光度计中测定其浓度与纯度值，将浓度在1000ng/μl，od260/280值在1.80-2.10之间的rna统一定量后置于-80℃冰箱保存。

实施例6：

(1)实验准备：将剪刀、镊子、药匙、研钵、研棒用锡箔纸包好121℃高温灭菌30min，灭菌后置于68℃烘箱内烘干多余水分,再与无酶枪头、20-200μl移液器、100-1000μl移液器、1.5ml离心管、离心管架、酒精灯、酒精棉球置于超净工作台中紫外杀菌30min并吹风10min后开始使用；

(2)样品准备：从-80℃冰箱内取出从江香猪直肠或盲肠或结肠组织传入超净工作台中，放在冰上解冻8min，用镊子夹出组织样并用剪刀剪成大小适中的块状放入液氮预冷过的研钵中，用液氮预冷过的研棒研成粉末状，备用；

(3)总rna的提取：①取研好的粉末105mg于装有1mltrizolrna裂解液的离心管中，利用震荡器剧烈震荡32s后置于冰上静置32min，再用高速离心机14000rpm离心18min；②取上清液500μl至灭菌好的离心管中，加入200μl氯仿，振摇32s混匀，待溶液呈浑浊状后置于冰上静置15min，再以14000rpm离心12min，弃去离心管中除白色沉淀以外的液体；③再向离心管中加入1.4ml75％乙醇溶液(由无水乙醇与rnase/dnase-freewater配制)洗涤白色沉淀，使沉淀在管中悬浮，再将离心管放入高速冷冻离心机中，4℃、7500rpm离心4min，弃去离心管内的乙醇；④将含有白色沉淀的离心管倒扣在面巾纸上34min，晾干乙醇溶液，即得总rna；

(4)rna的筛选及保存：向总rna的离心管中加入50μlrnase/dnase-freewater并静置10min，待白色沉淀完全溶解，取1μl在超微量分光光度计中测定其浓度与纯度值，将浓度在1000ng/μl，od260/280值在1.80-2.10之间的rna统一定量后置于-80℃冰箱保存。

实施例7：

(1)实验准备：将剪刀、镊子、药匙、研钵、研棒用锡箔纸包好121℃高温灭菌30min，灭菌后置于69℃烘箱内烘干多余水分,再与无酶枪头、20-200μl移液器、100-1000μl移液器、1.5ml离心管、离心管架、酒精灯、酒精棉球置于超净工作台中紫外杀菌30min并吹风10min后开始使用；

(2)样品准备：从-80℃冰箱内取出从江香猪直肠或盲肠或结肠组织传入超净工作台中，放在冰上解冻5min，用镊子夹出组织样并用剪刀剪成大小适中的块状放入液氮预冷过的研钵中，用液氮预冷过的研棒研成粉末状，备用；

(3)总rna的提取：①取研好的粉末110mg于装有1mltrizolrna裂解液的离心管中，利用震荡器剧烈震荡35s后置于冰上静置35min，再用高速离心机14000rpm离心20min；②取上清液500μl至灭菌好的离心管中，加入200μl氯仿，振摇35s混匀，待溶液呈浑浊状后置于冰上静置18min，再以14000rpm离心10min，弃去离心管中除白色沉淀以外的液体；③再向离心管中加入1.5ml75％乙醇溶液(由无水乙醇与rnase/dnase-freewater配制)洗涤白色沉淀，使沉淀在管中悬浮，再将离心管放入高速冷冻离心机中，4℃、7500rpm离心5min，弃去离心管内的乙醇；④将含有白色沉淀的离心管倒扣在面巾纸上35min，晾干乙醇溶液，即得总rna；

(4)rna的筛选及保存：向总rna的离心管中加入55μlrnase/dnase-freewater并静置11min，待白色沉淀完全溶解，取1μl在超微量分光光度计中测定其浓度与纯度值，将浓度在1000ng/μl，od260/280值在1.80-2.10之间的rna统一定量后置于-80℃冰箱保存。

实施例8：

(1)实验准备：将剪刀、镊子、药匙、研钵、研棒用锡箔纸包好121℃高温灭菌30min，灭菌后置于70℃烘箱内烘干多余水分,再与无酶枪头、20-200μl移液器、100-1000μl移液器、1.5ml离心管、离心管架、酒精灯、酒精棉球置于超净工作台中紫外杀菌30min并吹风10min后开始使用；

(2)样品准备：从-80℃冰箱内取出从江香猪直肠或盲肠或结肠组织传入超净工作台中，放在冰上解冻4min，用镊子夹出组织样并用剪刀剪成大小适中的块状放入液氮预冷过的研钵中，用液氮预冷过的研棒研成粉末状，备用；

(3)总rna的提取：①取研好的粉末115mg于装有1mltrizolrna裂解液的离心管中，利用震荡器剧烈震荡40s后置于冰上静置28min，再用高速离心机14000rpm离心15min；②取上清液500μl至灭菌好的离心管中，加入200μl氯仿，振摇40s混匀，待溶液呈浑浊状后置于冰上静置20min，再以14000rpm离心12min，弃去离心管中除白色沉淀以外的液体；③再向离心管中加入1ml75％乙醇溶液(由无水乙醇与rnase/dnase-freewater配制)洗涤白色沉淀，使沉淀在管中悬浮，再将离心管放入高速冷冻离心机中，4℃、7500rpm离心6min，弃去离心管内的乙醇；④将含有白色沉淀的离心管倒扣在面巾纸上30min，晾干乙醇溶液，即得总rna；

(4)rna的筛选及保存：向总rna的离心管中加入60μlrnase/dnase-freewater并静置12min，待白色沉淀完全溶解，取1μl在超微量分光光度计中测定其浓度与纯度值，将浓度在1000ng/μl，od260/280值在1.80-2.10之间的rna统一定量后置于-80℃冰箱保存。

实施例9：

(1)实验准备：同实施例1。

(2)样品准备：从-196℃液氮中内取出从江香猪直肠或盲肠或结肠组织传入超净工作台中，放在冰上解冻5min，用镊子夹出组织样并用剪刀剪成大小适中的块状放入液氮预冷过的研钵中，用液氮预冷过的研棒研成粉末状，备用；

(3)总rna的提取：同实施例1。

(4)rna的筛选及保存：同实施例1。

实施例10：

(1)实验准备：同实施例2。

(2)样品准备：从-196℃液氮中内取出从江香猪直肠或盲肠或结肠组织传入超净工作台中，放在冰上解冻3min，用镊子夹出组织样并用剪刀剪成大小适中的块状放入液氮预冷过的研钵中，用液氮预冷过的研棒研成粉末状，备用；

(3)总rna的提取：同实施例2。

(4)rna的筛选及保存：同实施例2。

实施例11：

(1)实验准备：同实施例3。

(2)样品准备：从-196℃液氮中内取出从江香猪直肠或盲肠或结肠组织传入超净工作台中，放在冰上解冻4min，用镊子夹出组织样并用剪刀剪成大小适中的块状放入液氮预冷过的研钵中，用液氮预冷过的研棒研成粉末状，备用；

(3)总rna的提取：同实施例3。

(4)rna的筛选及保存：同实施例3。

实施例12：

(1)实验准备：同实施例4。

(2)样品准备：从-196℃液氮中内取出从江香猪直肠或盲肠或结肠组织传入超净工作台中，放在冰上解冻6min，用镊子夹出组织样并用剪刀剪成大小适中的块状放入液氮预冷过的研钵中，用液氮预冷过的研棒研成粉末状，备用；

(3)总rna的提取：同实施例4。

(4)rna的筛选及保存：同实施例4。

实施例13：

(1)实验准备：同实施例5。

(2)样品准备：从-196℃液氮中内取出从江香猪直肠或盲肠或结肠组织传入超净工作台中，放在冰上解冻7min，用镊子夹出组织样并用剪刀剪成大小适中的块状放入液氮预冷过的研钵中，用液氮预冷过的研棒研成粉末状，备用；

(3)总rna的提取：同实施例5。

(4)rna的筛选及保存：同实施例5。

实施例14：

(1)实验准备：同实施例6。

(2)样品准备：从-196℃液氮中内取出从江香猪直肠或盲肠或结肠组织传入超净工作台中，放在冰上解冻8min，用镊子夹出组织样并用剪刀剪成大小适中的块状放入液氮预冷过的研钵中，用液氮预冷过的研棒研成粉末状，备用；

(3)总rna的提取：同实施例6。

(4)rna的筛选及保存：同实施例6。

实施例15：

(1)实验准备：同实施例7。

(2)样品准备：从-196℃液氮中内取出从江香猪直肠或盲肠或结肠组织传入超净工作台中，放在冰上解冻5min，用镊子夹出组织样并用剪刀剪成大小适中的块状放入液氮预冷过的研钵中，用液氮预冷过的研棒研成粉末状，备用；

(3)总rna的提取：同实施例7。

(4)rna的筛选及保存：同实施例7。

实施例16：

(1)实验准备：同实施例8。

(2)样品准备：从-196℃液氮中内取出从江香猪直肠或盲肠或结肠组织传入超净工作台中，放在冰上解冻4min，用镊子夹出组织样并用剪刀剪成大小适中的块状放入液氮预冷过的研钵中，用液氮预冷过的研棒研成粉末状，备用；

(3)总rna的提取：同实施例8。

(4)rna的筛选及保存：同实施例8。

实验例：为进一步说明本发明的科学性与合理性，进行了以下方法学实验研究：

一、仪器与试剂

1、仪器：

2、试剂：

二、样品的制备

1、实验准备：将剪刀、镊子、药匙、研钵、研棒用锡箔纸包好灭菌，灭菌后烘干,再与无酶枪头、20-200μl移液器、100-1000μl移液器、1.5ml离心管、离心管架、酒精灯、酒精棉球置于超净工作台中紫外杀菌处理；

2、样品准备：从-80℃冰箱内或-196℃液氮中取出从江香猪直肠或盲肠或结肠组织传入超净工作台中，放在冰上解冻5min，用镊子夹出组织样并用剪刀剪成大小适中的块状放入研钵中，用研棒研成粉末状，备用；

3、总rna的提取：①取研好的粉末100mg于装有1mltrizolrna裂解液的离心管中，震荡30s后置于冰上静置25-30min，再用高速离心机14000rpm离心15min；②取上清液500μl至灭菌好的离心管中，加入200μl氯仿，振摇30s混匀，待溶液呈浑浊状后置于冰上静置10-15min，再以14000rpm离心10min，弃去离心管中除白色沉淀以外的液体；③再向离心管中加入1ml75％乙醇溶液洗涤白色沉淀，使沉淀在管中悬浮，再将离心管放入高速冷冻离心机中，4℃、7500rpm离心5min，弃去离心管内的乙醇；④将含有白色沉淀的离心管倒扣在面巾纸上30min，晾干乙醇溶液，即得总rna；

4、rna的筛选及保存：向总rna的离心管中加入30-50μlrnase/dnase-freewater并静置5-10min，待白色沉淀完全溶解，取1μl在超微量分光光度计中测定其浓度与纯度值，将浓度在1000ng/μl，od260/280值在1.80-2.10之间的rna统一定量后置于冰箱保存。

三、从江香猪肠段组织rna条带的检测

分别取制备好的盲肠，直肠，结肠，十二指肠，小肠的rna提取液各1份，各取2μl至0.2mlpcr无酶管中，分别加入4.5μlrnaloadingbuffer，轻微震荡混匀后，用无酶枪头将混合液加入到1％琼脂糖凝胶中，110v，100ma电泳约30min，电泳结束后，使用凝胶成像系统对电泳产物进行拍照，所得28s，18s，5s三条带即为从江香猪肠段组织rna条带，见图1。

结果：通过条带图，可以看出盲肠，直肠，结肠，十二指肠，小肠的rna提取液均在28s和18s条带明亮、清晰、条带边缘清晰，说明从江香猪肠段组织总rna的提取方法的完整性，且该方法提取rna的质量好，无降解，稳定性好、纯度高。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。