一种与缺血性卒中辅助诊断相关的血清miRNA标志物及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程及心脑血管
技术领域：
，具体领域为一种与缺血性卒中辅助诊断相关的血清mirna标志物及其应用。
背景技术：
：卒中也叫中风，是世界范围内死亡的主要原因之一，也是长期残疾的主要原因，其中大部分卒中为缺血性卒中。由于脑卒中损伤的病理过程较多，缺血后损伤过程的发展迅速，治疗时间窗短，脑损伤中信号通路之间相互作用复杂，导致了临床上有效诊断治疗的发展受到严重限制，临床常用卒中诊断标准为d-二聚体(d-d)，缺乏一定的灵敏性和特异性。目前认为确定有效的生物靶点将有利于卒中的诊断和治疗。随着基因组学、蛋白组学以及代谢组学等生物技术的发展，越来越多的生物标志物已被发现或研究。因此，发现新的能够早期诊断缺血性卒中的标记物可以对其进行早期干预，延长病人的生存期。微小rna(mirnas)是一类长度在22个左右的核苷酸的小非编码rna分子，其通过转录后调控广泛参与了各种生命活动过程，包括神经细胞凋亡、肿瘤的发生、侵袭及转移等。研究发现，mirna在脑缺血损伤中的异常表达，为其能够作为一种新兴的卒中标志物奠定了基础。2008年，mitchell在外周血中检测到游离的mirna，发现其能够稳定存在于外周血中，并且可以作为诊断疾病的标志物。国内外研究表明mirna通过bax/bcl-2-caspase3通路抑制细胞凋亡，提示脑缺血再灌注损伤治疗过程中mirna可能会成为治疗的潜在靶点。还有研究表明，mirna通过靶向mcl-1影响脑缺血再灌注损伤期间的神经细胞凋亡。另有课题组研究发现mirna-1247-3p靶向caspase-2介导脑神经元的凋亡,对缺血性卒中引起的神经损伤起保护作用。但由于研究方法和纳入人群的差异，导致研究结果不完全一致，因此基于qrt-pcr的绝对定量法，通过对大样本的卒中血清的研究，并对这些mirna在缺血性卒中外周血清中的表达进行验证，以进一步明确其与缺血性卒中的关系。若根据这类mirna设计针对缺血性卒中的诊断试剂盒，将会推动我国缺血性卒中的诊治水平，也为将来对缺血性卒中的进一步研究提供思路。技术实现要素：一方面，本发明的目的在于提供一种与缺血性卒中辅助诊断相关的血清mirna标志物及其应用；另一方面，本发明的目的在于提供上述血清mirna标志物及其引物在制备缺血性卒中辅助诊断试剂盒以及在制备治疗缺血性卒中的药物中的应用；再一方面，本发明的目的在于提供用于缺血性卒中辅助诊断和治疗的试剂盒及药物。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种与缺血性卒中辅助诊断相关的血清mirna标志物，该标志物为mir-1247-3p,该标志物的特定碱基序列(ccccgggaacgucgagacuggagc)。一种与缺血性卒中辅助诊断相关的血清mirna标志物的应用，标志物mir-1247-3p在辅助诊断缺血性卒中应用。优选的，标志物mir-1247-3p在制备缺血性卒中辅助诊断试剂盒或制备治疗缺血性卒中药物中应用。一种与缺血性卒中辅助诊断相关的血清mirna标志物的引物，该引物为mir-1247-3p的引物。优选的，上述的引物在辅助诊断缺血性卒中或制备缺血性卒中辅助诊断试剂盒中的应用。一种缺血性卒中辅助诊断试剂盒，该试剂盒中含有血清mir-1247-3p的引物。优选的，该试剂盒中还包括pcr技术常用的试剂，如逆转录酶，缓冲液，dntps，mgcl2，depc水和taq酶等；还可以含有标准品和/或对照品。本发明所涉及的与缺血性卒中诊断相关的血清mirna标志物mir-1247-3p的序列均已公开，但是将其作为缺血性卒中辅助诊断标志物需要本领域技术人员付出创造性劳动。mirna标志物的扩增引物均可通过市场购买获得，本发明实施例中使用的血清mirna标志物的引物为购自广州锐博公司所合成生产的特异性mirna茎环rt-pcr引物。本发明解决问题的技术方案包括：(1)以标准操作程序(sop)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。(2)血清mirna差异表达谱分析：分析缺血性卒中和正常对照人群血清中差异表达的血清mirna，并对差异表达mirna进行验证。(3)通过验证，明确mir-1247-3p诊断缺血性卒中的能力。(4)血清mirna诊断试剂盒的研制：根据缺血性卒中患者与正常人群血清中的差异表达mirna开发mirnas诊断试剂盒，实现对缺血性卒中患者的无创辅助诊断。(5)分析mir-1247-3p在缺血性卒中血清中表达情况，揭示其与缺血性卒中的关系，为将来研制可能与mir-1247-3p相关的治疗缺血性卒中的药物提供依据。本发明人以标准操作程序(sop)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料，并采用qrt-pcr方法。具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：研究样本选择：初治、未行手术以及其它药物干预且经病理确认为缺血性卒中的患者。正常对照为在医院进行体检的正常人群。利用trizol-ls试剂对血清混合样本进行rna提取，通过逆转录反应得到cdna样品，加入pcr引物和sybrgreen荧光染料进行pcr反应。通过比对标准品的ct值，得出样本中的mirna含量。统计分析：运用曼-惠特尼u检验比较mirna表达水平在不同研究组中的差异。通过计算roc曲线分析证实血清mirna的诊断价值。本发明，研究组目前通过对缺血性卒中病人的血清中的mirna进行系统的表达分析，现已发现了具有临床诊断潜能的缺血性卒中血清mirna标记物mir-1247-3p。本发明的有益效果是：一种与缺血性卒中辅助诊断相关的血清mirna标志物及其应用，血清mirna作为新型的生物标志物，具有稳定性好、微创、易获取、灵敏性和特异性高的特点。这类分子标志物的开发利用将为包括心脑血管在内的各种疾病的诊断以及进一步治疗提供新的方向，本发明更有针对性的得出具有临床诊断潜能的缺血性卒中mirna标记物。本发明证实了mirna作为诊断缺血性卒中的无创标记物的可靠性以及可重复性。下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。附图说明图1：mir-1247-3p在不同研究组中的差异表达；图2：mir-1247-3p对缺血性卒中诊断的roc曲线。具体实施方式实施例：发明人于2018年至2019年从华润武钢总医院收集了大量的缺血性卒中患者和正常体检人群的静脉血清样品，并系统采集了这些样本的人口学资料、临床资料。通过对样品资料的整理，从中选择了25例缺血性卒中样本和25例正常对照的样本作为一系列qrt-pcr验证的实验样品。1.血清抽提取出300μl血清样品，样品化冻后7500xg离心5min去除一些碎片及一些不溶成分。转移上清至新的1.5ml无酶ep管中，加入900μltrizol-ls后，剧烈震荡15s。2.两相分离匀浆后样品于室温静置10分钟。每900zl的trizol-ls试剂匀浆的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，室温静置10分钟。后4℃下13,000g离心15分钟。3.rna沉淀将上层水相转移到新离心管中。水相与异丙醇混合以沉淀其中的rna，加入异丙醇的量为：每0.9mltrizol-ls试剂匀浆的样本中加入0.55ml的异丙醇。室温静置半小时，让rna尽可能的析出。于4℃13,000g离心15分钟。4.rna清洗移去上清液，每0.9mltrizol-ls试剂匀浆的样品中加入至少1ml的75％(v/v)乙醇，清洗rna沉淀。静置10分钟，然后4℃下7500g离心10分钟。5.重新溶解rna沉淀去除乙醇溶液，空气中干燥rna沉淀5-10分钟，加入无rna酶的水，用枪反复吹打几次，然后55到60℃孵育10分钟。6.测量浓度：通常能得到～2.5μg/1ml血清。7.cdna合成采用20μl反应体系进行逆转录实验以上反应体系混匀离心后，于pcr仪上用以下程序进行反应：42℃反应60min，70℃反应10min，4℃终止反应。8.qpcr反应采用10μl反应体系，按以下比例进行试验反应物10μlqpcr反应体系无rna酶水3.6μlpcr前引物工作液(5μm)0.2μlpcr后引物工作液(5μm)0.2μlsybrgreenmix荧光染料5μlcdna1μl总计10μl反应体系混匀，瞬时离心后，放置于实时定量pcr仪中，以下列程序进行反应：数据分析：采用δδct方法使用pcr仪器附带的软件进行初步数据分析，获得原始的cq值(cp或ct，依仪器不同名称可能不同)a.计算每个处理组中的每个通路相关基因的δct。δct(group1)＝averagect–averageofhkgenes’ctforgroup1arrayδct(group2)＝averagect–averageofhkgenes’ctforgroup2arrayb.计算2个pcrarray(或两组)中每个基因的δδct。δδct＝δct(组2)-δct(组1)备注：通常组1是对照，组2是实验组。c.通过2-δδct计算组2与组1对应基因的表达差异。数据分析：利用spss26.0软件进行统计分析，发现mir-1247-3p在缺血性卒中患者血清中的表达要显著低于正常人群(p<0.0001，图1)。并且通过roc曲线的结果，可发现mir-1247-3p可以较好的作为缺血性卒中发生的预测手段(图2)。试剂盒包括一批血清mirnaqrt-pcr引物，还可以有相应pcr技术所需的常用试剂，如：逆转录酶，缓冲液，dntps，mgcl2，depc水，荧光探针，rna酶抑制剂，taq酶等，可根据具体采用的实验方法选用，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如定量标化的正常人样本等)。此试剂盒的价值在于只需要血清而不需要其它组织样品，通过最精简的荧光法检测血清样本中mirna的表达含量，来辅助诊断该样本来源患者的发生缺血性卒中的可能性。血清mirna检测方便，且定量精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断以及进一步的个体化治疗。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。当前第1页12