一种苯丙酮尿症PAH基因致病基因型早筛试剂盒的制作方法

本发明涉及苯丙酮尿症早筛
技术领域：
，特别是涉及一种苯丙酮尿症pah基因致病基因型早筛试剂盒。
背景技术：
：苯丙酮尿症为中国最常见的常染色体隐性遗传疾病，发病率为五千到万分之一，同时也是产前诊断需求最多的遗传疾病之一。针对夫妻双方隐性遗传携带情况，预防再次生育患儿的有效方法，是羊水进行产前基因诊断。但传统羊水穿刺诊断，往往需要在孕中期或孕后期，20周以后才能进行，等待时间长，如发现怀疑胎儿基因异常，进行引产，往往对孕妇身心造成较大伤害，同时羊水穿刺有导致流产风险。如能在孕早期，6-12周，对孕妇孕育胎儿基因型进行早期诊断，对于及早干预，减少怀孕家庭身心负担，具有重要意义。技术实现要素：本发明主要解决的技术问题是提供一种苯丙酮尿症pah基因致病基因型早筛试剂盒，能针对怀孕夫妻已育pah基因导致苯丙酮尿症患儿，在再次怀孕过程中，实现孕早期筛查胎儿pah基因型。为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种苯丙酮尿症pah基因致病基因型早筛试剂盒，所述试剂盒选择pah基因侧翼各1m区域，调取东亚人群携带率>10％位点，基于需要捕获的多态性位点区域信息，针对选择区域得到rna捕获试剂盒。在本发明一个较佳实施例中，所述调取东亚人群携带率>10％位点是在snp数据库内调取的。在本发明一个较佳实施例中，所述位点基于gnomad数据库东亚人信息，符合的标准位点为3849个。在本发明一个较佳实施例中，所述试剂盒是采用dna文库构建的，能满足ngs测序需求。在本发明一个较佳实施例中，参照试剂盒说明，建立自动化变异calling生信流程，试剂盒在测序原始数据生成标准变异vcf文件的过程中，采用开源软件工具。在本发明一个较佳实施例中，所述开源软件工具为picard、bwa、samtools或varidict。在本发明一个较佳实施例中，所述变异calling生信流程的运行过程为：(1)基于提交的vcf文件，生成合并vcf文件，剔除低质量变异位点和indel变异位点；(2)结合先证者之父、之母以及胎儿dnavcf计算母血dna中胎儿dna比例；(3)父、母、先证者基因型将有效变异分类，统计胎儿dna突变比值的均值以及母亲基因型均值，得到早筛结果。在本发明一个较佳实施例中，所述胎儿dna比例为：胎儿游离dna突变比例＝2*父亲位点深度/(父亲位点深度+母亲位点深度)，取所有相关位点比值的均值做为胎儿游离dna值。本发明的有益效果是：本发明的苯丙酮尿症pah基因致病基因型早筛试剂盒，可将胎儿基因型确诊时间提前至怀孕6-8周，比传统检测提前12周以上，试剂盒检测样本为孕妇静脉血，取样简单，且无其他风险。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：图1是本发明苯丙酮尿症pah基因致病基因型早筛试剂盒应用的流程图；图2是本发明样本文库构建的流程图；图3是本发明胎儿基因型变异calling算法的流程图。具体实施方式下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。本发明提供一种苯丙酮尿症pah基因致病基因型早筛试剂盒及试剂盒的使用方法，具体参阅图1。实施例一：pah基因捕获试剂盒的设计选择pah基因侧翼各1m区域(2号染色体)，调取snp数据库内东亚人群携带率>10％位点(10-90％突变频率)，基于gnomad数据库东亚人信息，符合此标准位点为3849个，设计的位点信息见说明书末尾。选择基因组版本为人类hg19或grch37版本。基于需要捕获的多态性位点区域信息，针对选择区域设计和合成rna捕获试剂盒，捕获试剂盒委托专业公司完成批量生产。所述捕获试剂盒一次合成，可满足100-10000人次检测需要。捕获试剂盒质量qc结果显示见下，99％以上位点可以被有效分析和检测。sample平均测序深度有效检测位点测序数量(g)捕获效率130538911.145％245138911.347％实施例二：dualindexumiadapters样本文库构建文库构建流程如图2所示。采用推荐的dna文库构建试剂盒，满足ngs测序需求即可，适配对应测序仪即可。文库构建过程中采用美国idt公司商品化双特异性分子标签，货号1003411。相关试剂如下：试剂/耗材名称试剂/耗材编号供应商kappa建库试剂盒k8504kappaadapter(文库接头)-idt-umi实施例三：测序数据生物信息分析参考umi_adaptor厂商提供的分析指南，建立自动化变异calling生信流程。在测序原始数据至标准变异vcf文件，采用开源软件工具，包括picard、bwa、samtools、varidict等主流生物软件工具。参照试剂盒说明，搭建标准生信流程。试剂盒配套软件工具，已实现此步骤分析的自动化。导入测序原始文件，即可生成对应标准vcf文件。基于本试剂盒建议测序数据量，每个样本分析时间在30min左右。样本变异数量115053214987316325实施例四：分析数据整合和致病基因型判断图3是胎儿基因型变异calling算法流程，具体步骤为：(a)基于提交的vcf文件，生成合并vcf文件，剔除低质量变异位点和indel变异位点(测序深度<20)。(b)胎儿dna比例计结合先证者之父、之母以及胎儿dnavcf计算母血dna中，胎儿dna比例。算法实现：筛选父母双方均为hom位点，但两者的基因型不一致(例如tt-gg)。胎儿游离dna突变比例＝2*父亲位点深度/(父亲位点深度+母亲位点深度)，取所有相关位点比值的均值做为胎儿游离dna值。(c)父、母、先证者基因型将有效变异分为8类。统计8种类型胎儿dna突变比值的均值以及母亲基因型均值。1、单类型值运算(s1)e＝0.06，me＝0.48，fe＝0.46s1_value＝(fe-me)/(fe-(me-e/2))s1_value＝(0.46-0.48)/(0.46-0.45)＝22、母源或父源基因型值测算m_value(母源基因型值)＝s1_value*s2_value*s3_value*s4_valuef_value(父源基因型值)＝s5_value*s6_value*s7_value*s8_value以m_value、f_value值范围，判定母源、父源基因型致病可行性。母源/父源值值范围结论f_value>10致病单倍体型f_value<0.1良性单倍体型f_value0.1-10不明m_value>10致病单倍体型m_value<0.1良性单倍体型m_value0.1-10不明3、输出结论。具体过程为：将qc合格包括先证者、父亲、母亲、母源游离dna数据vcf文件，按照固定项目号编辑完成。样本名称vcf名称先证者hy19082001父亲hy19082002母亲hy19082003母源游离dnahy19082003输出文件结果如下：不同类型分型说明：单一类型位点数大于10个，即可满足分析要求。基因型结论：母源单倍体型预测结果致病性母源score1538.24父源单倍体型预测结果致病性父源score326250实施例六：实际临床样本检测结果数据采集实际产前诊断过程中，孕妇无创dna检测母源胎儿dna及先证者、父亲、母亲基因组dna采用上述试剂盒进行筛查性检测。对照孕妇羊水穿刺dna，pcr+sanger测序检测结果，判定不同样本、不同孕周的检测结果准确性。不同孕周检测结果如下：以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的
技术领域：
，均同理包括在本发明的专利保护范围内。设计位点信息102232116、102232484、102232849、102233373、102233423、102233579、102234742、102235256、102235258、102235310、102235311、102240583、102240964、102242065、102242177、102245002、102245185、102245473、102246230、102250550、102251473、102251895、102252463、102252559、102254956、102255105、102255246、102255264、102255318、102255762、102256049、102256050、102256888、102256965、102257263、102257264、102257345、102260814、102261274、102262054、102262324、102263956、102265060、102265162、102265602、102265606、102267232、102267241、102267281、102267479、102267736、102267970、102268111、102268677、102269314、102269318、102269821、102269980、102270020、102270026、102270336、102270485、102270833、102270844、102270985、102271008、102271434、102271962、102272115、102272227、102272489、102272659、102273030、102274122、102274217、102274519、102274612、102274615、102275160、102275230、102275477、102276050、102276435、102276493、102277049、102277335、102277722、102277837、102278725、102279115、102279558、102280063、102282427、102282669、102282755、102283296、102283298、102283718、102284182、102284553、102284571、102284590、102284749、102285331、102285980、102285995、102286185、102286193、102286194、102286790、102287005、102287183、102287264、102287370、102287702、102287703、102287753、102287777、102287834、102287929、102288036、102288185、102288241、102288250、102288370、102288423、102288481、102288527、102288613、102288867、102288952、102289058、102289215、102289473、102289539、102289687、102289703、102289957、102290154、102290237、102290651、102290788、102291027、102291238、102291377、102291943、102291955、102292777、102293286、102293288、102293484、102293739、102293862、102294494、102294501、102294618、102295219、102295834、102295903、102296166、102296455、102296821、102298205、102298250、102298621、102298761、102299565、102300494、102301532、102301892、102302980、102303086、102303287、102303733、102303950、102304006、102304106、102304665、102304685、102304736、102304839、102304919、102304990、102305219、102305368、102305688、102305837、102305935、102305959、102306039、102306310、102306315、102306436、102306578、102306785、102307270、102307342、102307435、102307559、102307711、102307859、102308095、102308190、102308452、102308560、102308725、102308732、102308993、102309425、102309768、102310116、102310780、102311135、102311265、102311702、102311812、102312230、102312523、102312526、102312529、102312658、102312855、102312857、102313104、102313365、102313506、102313507、102314631、102315241、102315359、102315526、102315592、102315746、102317141、102319002、102319517、102319718、102319781、102321312、102321518、102321583、102321792、102321935、102322376、102322689、102322900、102322903、102322942、102322989、102323025、102323267、102323469、102323913、102324003、102324102、102324151、102324872、102325297、102325817、102325941、102326461、102326532、102327169、102327309、102327751、102328806、102330591、102330709、102330758、102330869、102331172、102331317、102331318、102331664、102331923、102331947、102332404、102333283、102333665、102333709、102333722、102334690、102334769、102334907、102335060、102335130、102335627、102335984、102336220、102336245、102336310、102337262、102337444、102337901、102338012、102338235、102338313、102338647、102338853、102339156、102339295、102339665、102340008、102340877、102341484、102341617、102341649、102341901、102342103、102342119、102342218、102342417、102342474、102342482、102342582、102342584、102343035、102343164、102343246、102343482、102343853、102344116、102346075、102346239、102346355、102346530、102346684、102347167、102347172、102347306、102347889、102349876、102349948、102350785、102351575、102351729、102352028、102352202、102352707、102353252、102353420、102354570、102355832、102356979、102357310、102357893、102358821、102358952、102359256、102361086、102361333、102361491、102361700、102361984、102362293、102362297、102362619、102362830、102362849、102363106、102363966、102365420、102365612、102366056、102366156、102366430、102366788、102367147、102367168、102367381、102367384、102368065、102368097、102368390、102368409、102371303、102372925、102373301、102373305、102373308、102373309、102373534、102373788、102374414、102374906、102375057、102376027、102376732、102377666、102379149、102379673、102381565、102382052、102382727、102383028、102383612、102384339、102384737、102386727、102387187、102388916、102388920、102389008、102391353、102391500、102392022、102394872、102397730、102398232、102399354、102399379、102401012、102401065、102404119、102404468、102405062、102405082、102407432、102407746、102407879、102408043、102408130、102408147、102408856、102409089、102409283、102409546、102412499、102412637、102414568、102415211、102415256、102416368、102417475、102417638、102418604、102420264、102420265、102420892、102421290、102421344、102421888、102422359、102424383、102428444、102429501、102430140、102430430、102431659、102431759、102432065、102434900、102435928、102436543、102436549、102437117、102438686、102440246、102440836、102441002、102441525、102442201、102442428、102442598、102442631、102442944、102444064、102444999、102446675、102447060、102447422、102449255、102452264、102455729、102456819、102457301、102460991、102461089、102462468、102463140、102463242、102463456、102463961、102465188、102466028、102466079、102466992、102468660、102470174、102470434、102471860、102472105、102472760、102474849、102474852、102476087、102476128、10247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