一个基因在增大番茄果实中的应用的制作方法

本发明涉及一个促进番茄果实增大的基因及其应用，属于作物分子遗传领域。

背景技术：

番茄(solanumlycopersicum)作为重要的园艺植物与经济作物，在全球广泛种植，成为世界性的蔬菜与水果，因其美观、美味、营养价值高等特点颇受消费者喜爱。番茄果实大小和重量是影响番茄外观和产量的一个重要农艺性状，增加果实的直径和重量不仅能提高番茄产量，还能增强视觉美感、增加果实中的营养含量，带来更高的市场和经济价值。因此，通过挖掘新的功能基因，利用基因编辑技术，选育大果型番茄新品种，是一种比较快捷的方式。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是如何有效增加番茄果实的大小，从而提高其果实产量。

为了解决上述技术问题，本发明提供一个番茄的基因ifw1(increasefruitsizeandweight1)，其编码的核苷酸序列如seqidno：1所示。

本发明还同时提供了上述基因的用途：在番茄中敲除ifw1基因可有效增加(显著性增加)其果实的大小，从而提高产量。

作为本发明的ifw1基因在增大番茄果实中的应用的改进：ifw1基因2个敲除株系为ifw1-1与ifw1-2；ifw1-1与ifw1-2植株中的ifw1基因突变序列均为seqidno:2。

本发明还同时提供了番茄中敲除ifw1基因的方法，包括以下步骤：

1)利用crispr/cas9技术设计基因编辑的靶点sgrna序列：5'-gatagaggcagaggcagagg-3’；

2)利用步骤1)所得的序列合成引物，并构建到crispr/cas9载体中；

3)将步骤2)所得的载体遗传转化野生型番茄品种microtom，从而获得相应的转基因植株；从所述转基因番茄植株中鉴定出敲除ifw1基因的植株。

本发明的技术方案具体如下：

采用crispr/cas9基因编辑技术，根据ifw1基因的核苷酸序列(seqidno:1)，合成特异性靶向ifw1基因的grna序列，构建相应的crispr/cas9载体，并遗传转化到野生型番茄品种microtom中，使其对基因组中的ifw1基因进行定向编辑，获得转基因植株，对转基因植株中ifw1基因进行pcr扩增与测序，鉴定获得了ifw1基因的不同敲除株系ifw1-1与ifw1-2(图1)。ifw1-1与ifw1-2植株中的ifw1基因突变序列均为seqidno:2。通过比较果型，ifw1基因敲除植株成熟果实的大小(图2，图3)、重量都显著性高于野生型对照品种(图4)，表明在番茄中敲除ifw1基因能有效促进增加果实中生物量的合成，具有重要的育种应用价值。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为番茄ifw1基因敲除株系的crispr/cas9靶位点位置及测序结果。

图2为番茄ifw1基因敲除株系与野生型对照microtom的果型对比图。

图3为番茄ifw1基因敲除株系与野生型对照microtom的果实大小测定。

图4为番茄ifw1基因敲除株系与野生型对照microtom的单个果实重量测定。

图1～图4中，wt所示为野生型对照品种microtom；ifw1-1和ifw1-2所示为ifw1基因的2个不同敲除株系。图3和图4中的数值为平均值±标准差，**表示番茄ifw1基因敲除株系ifw1-1(或ifw1-2)与野生型(wt)对照microtom的t检验存在极显著性(p<0.01)差异。

具体实施方式

步骤1.番茄ifw1基因敲除的crispr/cas9载体构建

利用在线专业软件(http://crispr.mit.edu/)，在ifw1基因的编码序列(seqidno:1)中设计crispr/cas9编辑的靶点sgrna序列：5'-gatagaggcagaggcagagg-3’；并在生物技术公司合成相应的引物序列：5'-tgattgatagaggcagaggcagagg-3’与5'-aaaccctctgcctctgcctctatca-3’。通过crispr/cas9试剂盒(biogle，china)构建了相应的crispr/cas9载体，构建方法按照产品说明进行操作。

步骤2.crispr/cas9载体构建的番茄遗传转化

将步骤1构建的crispr/cas9载体遗传转化到番茄品种microtom，转基因方法根据采用kimura等方法(kimurasetal,chsprotoc,2008)，获得相应的转基因番茄植株。

步骤3.转基因番茄中ifw1基因的测序分析

取转基因番茄植株叶片0.1g，用液氮研磨后，加600μl提取液(15.76gtris-cl，29.22gnacl，15.0gsds粉末加超纯水定容至1l，调节ph＝8.0)，65℃温育60min；加200μl5mkac，混匀后，冰浴10min；再加500μl氯仿，混匀，10000rpm离心5min；取上清，加入500μl异丙醇，混匀，12000rpm离心3min，弃去上清；用75％乙醇500μl洗涤沉淀，12000rpm离心3min，弃去上清；倒置干燥dna15min后，加30μl纯水溶解dna。

合成ifw1基因pcr扩增的上游引物5’-aacgttcaacggacaatc-3’和下游引物5’-caataaagtacaccacat-3’，以转基因番茄植株及其对照品种microtom的基因组dna为模板，用2×taqpcrmastermix(tiangen公司)对ifw1基因进行pcr扩增，pcr扩增体系为20μl，含有2×taqpcrmastermix10μl，上、下游引物(10μm)各1μl，模板dna1μl(<1μg)，无菌水7μl；pcr扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环；72℃延伸10min。

pcr产物测序分析后，鉴定了两个成功敲除ifw1基因的株系ifw1-1和ifw1-2，这两个株系的植株中ifw1基因编码区都缺失2个碱基(图1)，使ifw1基因发生移码突变，导致该基因功能缺失。ifw1-1和ifw1-2株系植株中ifw1基因的核苷酸序列如seqidno:2所述。

步骤4.番茄果实的大小的测定

将以上鉴定出的ifw1基因敲除株系ifw1-1和ifw1-2以及野生型对照品种microtom种植在温室，25℃，16h光照，8h黑暗。待番茄果实成熟，每个品种随机选取3株，每株取3个成熟果实，去蒂。使用游标卡尺测量每个番茄果实最长直径(cm)，计算各品种果实直径平均值，测定结果采用t检验分析ifw1-1(或ifw1-2)敲除株系与野生型对照之间的显著性差异。所得结果为ifw1基因敲除株系ifw1-1和ifw1-2果实的直径都显著性高于野生型对照(图2，3)，分别比对照品种增长了23.2％和25.9％。

步骤5.番茄果实的重量的测定

取步骤4培养番茄果实，用电子天平称取每个番茄果实重量(g)，计算各品种果实重量平均值，测定结果采用t检验分析ifw1-1(或ifw1-2)敲除株系与野生型对照之间的显著性差异。所得结果为ifw1基因敲除株系ifw1-1和ifw1-2果实的重量都显著性高于野生型对照(图4)，分别比对照品种增长了51.7％和57.4％。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110>浙江师范大学

<120>一个基因在增大番茄果实中的应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>300

<212>dna

<213>番茄(solanumlycopersicum)

<400>1

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<213>番茄(solanumlycopersicum)

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