鉴定全缘冬青种植物性别性状的分子标记引物组合及其应用的制作方法

本发明涉及一组鉴定全缘冬青种植物性别性状的分子标记引物组合及其应用，属于分子生物学领域。

背景技术：

冬青属植物作为世界园艺名品，在国际市场上的地位显的更为突出，近些年开始风靡国内市场。其中，全缘冬青种(ilexintegra)为岛屿特有植物，雌雄异株，主要分布于浙江舟山群岛，其抗逆性极强，四季常青，现已被列为浙江省珍稀濒危植物。此外，由于全缘冬青雌株临冬鲜红果实缀于枝头，娇艳欲滴，十分适合作为浙江沿海地区的行道树、庭院树、风景林与防护林，因此，目前生产上以选育优良全缘冬青雌株为主。我国虽为冬青属种质资源大国，然而目前对本土冬青属植物的利用仍处于起步阶段，研究和应用仅限于栽培与利用方面，对冬青属植物针对性的种质资源的收集保护、杂交育种及评价鉴定等研究开展较少，在其雌雄株性别遗传机制、杂交亲和性研究与花芽分化、果色调控、叶色变异等方面的功能基因挖掘方面都是空白。

雌雄性别是雌雄异株植物较为明显的性状，主要决定因素有性染色体、基因平衡、性别基因及核质互作。然而，由于全缘冬青的性生理成熟期长(定植后5年以上)，在其成年之前，尚无形态特征差异可以明示其性别。因此，若通过常规手段确定全缘冬青育种材料的性别是一件十分耗时的工作。现代生物技术的发展为全缘冬青育种材料性别鉴定提供一种有效的方法——dna分子标记，利用与性别相关的特异dna分子标记完全有可能在短时间内对全缘冬青育种材料的性别进行早期鉴定，从而可以大大加速育种的进程。

相关研究已成功开发了可以检测苦丁茶冬青性别的rapd-scar分子标记，但是苦丁茶冬青与全缘冬青并不属于同一种内植物，种间遗传背景差异较大，并且该分子标记经过本课题组前期在全缘冬青种材料中鉴定结果显示为无效。因此，建立一种有效的分子标记组合及其检测方法，并实现高通量分型检测辅助筛选，成为本领域研究人员急需解决的问题之一。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一组可用于鉴定全缘冬青种植物性别性状的分子标记引物组合及其应用。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种鉴定全缘冬青种植物性别性状的分子标记引物组合，包括一对引物jydq9881，所述引物的序列为：

jydq9881：f：5’-tagtgcccaagccacaattgctgca-3’，

r：5’-gaatatttatgccacaatatatcag-3’。

本发明还公开了上述的分子标记引物组合在鉴定全缘冬青种性别性状中的应用。

其步骤包括：

(1)引物设计合成：合成权利要求1所述的引物jydq9881；

(2)dna的提取：提取全缘冬青植物叶片的基因组dna；

(3)pcr扩增：基于上述全缘冬青植物基因组dna，使用步骤(1)合成的引物jydq9881进行pcr扩增；

(4)扩增产物检测与分析：使用abiq6flex实时荧光定量pcr系统进行基因型检测分析，进而确定全缘冬青种性别性状。

其详细步骤为：

(1)引物合成：委托生物技术公司合成引物jydq9881；

(2)dna的提取：

a、用液氮研磨0.2g左右的幼叶成粉末状置于2ml离心管中；

b、使用ezup柱式植物基因组dna抽提试剂盒(ez-10spincolumnplantgenomicdnapurificationkit，上海生工生物工程股份有限公司)提取上述样品基因组dna，具体操作步骤按照其说明书进行；

c、取1～2μl在1.0％的琼脂糖凝胶上检测，将dna原液稀释成浓度为10ng/μl的工作液备后续使用；

(3)pcr扩增反应体系为：样品基因组dna模板2.0μl(10ng/μl)，2×sgfastqpcrmastermix(lowrox，上海生工生物工程股份有限公司)5μl，正向引物(10μm)0.5μl，反向引物(10μm)0.5μl，ddh2o补足至10μl即可。

(4)pcr扩增产物检测与分析：pcr扩增为两步法程序，即95℃3min，(95℃3s，60℃30s)28个循环；待pcr反应结束后可直接由abiq6flex实时荧光定量pcr系统平台genotyping功能模块自动分析结果(allelicdiscriminationplot)便可知样本雌雄性别性状，无需其他流程；其中，若有pcr扩增产物出现(分别各加入2个已确定性别为全缘冬青雄株和雌株类型的样本dna作为内参)且与内参样本聚集为一组者即可视为同一性别类型；此外，若没有任何pcr扩增产物出现者视为雌株性别类型。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明中分子标记引物jydq9881扩增产物片段仅为123bp，尤其适用于荧光定量pcr仪等高通量分型检测平台，其应用过程中的pcr扩增耗时短，循环数仅为28；从pcr扩增到最终分型结果数据的获取为全程闭管操作，无需再进行后续凝胶电泳检测，实现零污染；同时，样品基因组dna模板量仅需20ng即可获得分型检测结果，具有快速、高通量和高灵敏度等特点。

本发明下面结合实施例和说明书附图，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

附图说明

图1为全缘冬青种质资源dna样本的jydq9881引物在荧光定量pcr仪平台上的分型效果。

具体实施方式

实施例1

一组鉴定全缘冬青种植物性别性状的分子标记引物组合及其应用，其详细步骤为：

(1)引物合成：按照表1中序列信息，委托生工生物工程(上海)股份有限公司分别合成引物jydq9881；

表1：jydq9881引物序列信息

(2)待测全缘冬青种质资源样品叶片dna的提取：

a、用液氮研磨0.2g左右的幼叶成粉末状置于2ml离心管中；

b、使用ezup柱式植物基因组dna抽提试剂盒(ez-10spincolumnplantgenomicdnapurificationkit，上海生工生物工程股份有限公司)提取上述样品基因组dna，具体操作步骤按照其说明书进行；

c、取1～2μl在1.0％的琼脂糖凝胶上检测，将dna原液稀释成浓度为10ng/μl的工作液备后续使用；

(3)pcr扩增反应体系为：样品基因组dna模板2.0μl(10ng/μl)，2×sgfastqpcrmastermix(lowrox，上海生工生物工程股份有限公司)5μl，正向引物(10μm)0.5μl，反向引物(10μm)0.5μl，ddh2o补足至10μl即可。

(4)pcr扩增产物检测与分析：pcr扩增为两步法程序，即95℃3min，(95℃3s，60℃30s)28个循环；待pcr反应结束后可直接由abiq6flex实时荧光定量pcr系统平台genotyping功能模块自动分析结果(allelicdiscriminationplot)便可知样本雌雄性别性状，无需其他流程；其中，若有pcr扩增产物出现(预先加入2个已确定性别为全缘冬青雄株样本dna作为内参)且与内参雄株样本聚集为一组者即可视为雄株类型；其他基因型或者若没有任何pcr扩增产物出现者均视为雌株性别类型。最后，使用表格记录所有全缘冬青样品性别鉴定结果(表2)，具体分型效果见图1。本实例中荧光定量平台96孔加热模块可根据需要进行更换为384孔以及流体芯片等，以满足更高通量分型检测需求。

表2本发明实例中所用到的84份全缘冬青种质资源性别鉴定结果信息

注：*分型结果图中与雄株内参样品聚为一类者用“+”，其余样品均用“-”表示。