生产重组目标蛋白的方法、过表达载体以及病毒悬液与流程

文档序号：22684355发布日期：2020-10-28 12:49阅读：114来源：国知局

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及生产重组目标蛋白的方法、过表达载体以及病毒悬液。

背景技术：

近年来，由于基因工程技术的不断完善和动物克隆技术的发展，动物乳腺生物反应器已成为研发非常活跃的领域。动物乳腺生物反应器通过将外源基因导入动物基因组中并定位将目标蛋白表达于动物乳腺，利用动物乳腺天然、高效合成并分泌目标蛋白的能力，在动物的乳汁中生产具有重要价值的生物产品。

与基因工程细胞反应器相比，通过动物乳腺生物反应器得到的生物产品活性高、无污染，且易分离提纯，有利于降低成本。例如公开号为cn1247899a的中国发明专利申请公开了一种在动物乳腺内表达干扰素的重组dna的构建方法，该方法向动物的乳腺导管直接注入包含重组dna的注射液，使重组dna进入乳腺分泌细胞，在分泌细胞分泌乳汁时，重组dna所编码的蛋白得以表达。公开号为cn1744814a、cn101245351a和cn1869217a的中国发明专利申请都公开了利用腺病毒载体在动物乳汁表达药用蛋白的方法。公开号为us6743966b2的美国发明专利公开了一种利用动物乳腺生物反应器表达生产膜蛋白的方法，包括在非人哺乳动物的基因组插入乳腺特异表达构建物，促使膜蛋白在乳腺上皮细胞表达并分泌到乳汁中。

然而，以上描述的利用动物乳腺生物反应器或腺病毒载体表达目标蛋白的周期通常较长，目标蛋白在每毫升乳汁中的表达水平通常无法达到毫克级，且现有技术中寻找乳腺导管入口需要在显微镜或放大镜下进行操作，一旦操作不当容易损坏乳腺导管。

因此有必要提供新型的生产重组目标蛋白的方法，以避免现有技术中存在的上述问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种生产重组目标蛋白的方法以及应用于所述生产重组目标蛋白的方法的过表达载体以及病毒悬液，以实现所述重组目标蛋白的快速高效生产和高水平表达。

为实现上述目的，本发明所述生产重组目标蛋白的方法包括：提供过表达载体，所述过表达载体包含目标蛋白的基因和腺相关病毒载体；对所述过表达载体进行病毒包装，以形成病毒悬液；将所述病毒悬液通过腺相关病毒介导的转导方式导入临产的非人哺乳动物的乳腺组织或乳腺管中以完成病毒导入，并使所述非人哺乳动物在泌乳过程中通过乳腺细胞表达和分泌所述重组目标蛋白；获取所述非人哺乳动物于泌乳期分泌的乳汁，从所述乳汁中获取所述重组目标蛋白。

本发明的生产重组目标蛋白的方法的有益效果在于：使用包含目标蛋白的基因和腺相关病毒载体的过表达载体并进行所述病毒包装，然后利用得到的病毒悬液通过腺相关病毒介导的转导方式导入临产的非人哺乳动物的乳腺组织或乳腺管中以完成病毒导入，无需借助昂贵的仪器设备，通过简单操作就能够实现所述重组目标蛋白的快速高效生产和高水平表达，取得了意想不到的技术效果。

优选的，所述过表达载体中的启动子序列为cmv、sv40、rsv、cag和ef、乳清酸性蛋白(wap)、αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳清蛋白中的任意一种的序列。

优选的，所述过表达载体中的增强子序列为cmv、sv40和rsv中的任意一种的序列。

优选的，所述过表达载体中提供的所表达重组目标蛋白分泌的信号肽编码序列选自乳清酸性蛋白(wap)，αs1-酪蛋白，αs2-酪蛋白，β-酪蛋白，κ-酪蛋白，β-乳球蛋白，α-乳清蛋白，人碱性磷酸酶，蜂毒素和免疫球蛋白轻链蛋白igk中的任意一种的序列。

进一步优选的，所述过表达载体中提供的所表达重组目标蛋白分泌的信号肽编码序列来自山羊β-酪蛋白的序列。

优选的，所述重组目标蛋白为胆碱酯酶、过氧化物酶、生长激素、抗病毒蛋白、免疫球蛋白、病毒结构蛋白、类病毒颗粒和膜蛋白中的任意一种或所述任意一种的片段或衍生物。

进一步优选的，所述重组目标蛋白为人乙酰胆碱脂酶和人丁酰胆碱酯酶中的任意一种。

进一步优选的，所述重组目标蛋白为过氧化物酶、氧化酶和脱氢酶中的任意一种。

进一步优选的，所述重组目标蛋白为膜蛋白，所述膜蛋白为gpcr蛋白，离子通道蛋白和转运蛋白中的任意一种。

进一步优选的，所述重组目标蛋白为人ace2和ace2-fc融合蛋白中的任意一种。

优选的，所述过表达载体的序列还包含土拨鼠肝炎病毒转录调控元件序列（wpre）和sv40聚腺苷酸化信号序列。

优选的，所述过表达载体的序列如seqidno.1-7中的任意一种所示。

进一步优选的，所述过表达载体的序列结构为paav-cag启动子-目标蛋白编码序列-wpre-sv40聚腺苷酸化信号序列，所述过表达载体的核苷酸序列如seqidno.1-4中的任意一种所示。

进一步优选的，所述过表达载体的序列结构为paav-山羊β-酪蛋白基因（bcn）启动子-目标蛋白编码序列-wpre-sv40聚腺苷酸化信号序列，所述过表达载体的核苷酸序列如seqidno.5-6中的任意一种所示。

进一步优选的，所述过表达载体的序列结构为paav-cmv启动子-目标蛋白编码序列-wpre-sv40聚腺苷酸化信号序列，所述过表达载体的核苷酸序列如seqidno.7所示。

优选的，所述腺相关病毒载体血清型包括aav1-aav4和aav7-aav9中的任意一种。

进一步优选的，所述腺相关病毒载体血清型为aav1和aav9中的任意一种。

优选的，使用所述过表达载体、第一辅助质粒和第二辅助质粒对293t细胞进行共转染，然后对得到的转染液进行纯化处理，以完成所述病毒包装。

进一步优选的，所述第一辅助质粒为paav-rc质粒，所述第二辅助质粒为phelper质粒。

优选的，所述病毒悬液的滴度不低于1×10¹²基因拷贝数/毫升。其有益效果在于：有助于所述重组目标蛋白的快速和高水平表达。

优选的，所述临产的非人哺乳动物为距离预产期2-10天的健康的非人哺乳动物，并在进行所述病毒导入前，先对所述临产的非人哺乳动物进行麻醉。其有益效果在于：保证有关病毒能够感染乳腺细胞，使得所述重组目标蛋白通过泌乳过程分泌到乳汁中进行表达。

进一步优选的，所述临产的非人哺乳动物为距离预产期2-4天的健康的非人哺乳动物。

进一步优选的，还包括电刺激，所述病毒导入完成后，利用刺激装置对所述临产的非人哺乳动物的乳腺部位进行1-2分钟的所述电刺激，以有利于快速转染。

优选的，所述非人哺乳动物为小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、猪和牛中的任意一种。

本发明提供的所述过表达载体包含所述目标蛋白的基因和所述腺相关病毒载体，所述过表达载体用于通过病毒包装形成病毒悬液；所述病毒悬液用于通过腺相关病毒介导的转导方式导入临产的非人哺乳动物的乳腺组织或乳腺管中以完成病毒导入，并使所述非人哺乳动物在泌乳过程中通过乳腺细胞表达和分泌所述重组目标蛋白，以及通过获取所述非人哺乳动物于泌乳期分泌的乳汁，从所述乳汁中获取所述重组目标蛋白。

本发明提供的所述病毒悬液由所述过表达载体经病毒包装形成。

本发明提供的所述过表达载体和所述病毒悬液的有益效果在于：所述过表达载体包含所述目标蛋白的基因和所述腺相关病毒载体，有利于后续进一步通过所述病毒包装形成病毒悬液后再通过腺相关病毒介导的转导方式导入临产的非人哺乳动物的乳腺组织或乳腺管中以完成病毒导入，无需借助昂贵的仪器设备，通过简单操作就能够实现所述重组目标蛋白的快速高效生产和高水平表达，取得了意想不到的技术效果。

附图说明

图1为本发明实施例的通过动物乳腺腺相关病毒介导的转导方式生产重组目标蛋白的方法流程图；

图2为本发明实施例1的过表达载体的质粒图谱；

图3为本发明一些实施例的简记为paav-bcn-bche的过表达载体的质粒图谱；

图4为本发明一些实施例的简记为paav-cmv-hrp的过表达载体的质粒图谱；

图5a为本发明实施例1的动物乳汁样品通过sds-page银染法显示的重组人cb1的表达情况照片；

图5b为图5a所示的mi6、mi7和mi8三个样品通过蛋白质印迹法显示的重组人cb1的表达情况照片；

图6a为本发明实施例2的乳汁样品通过sds-page银染法显示的重组人a2b的表达情况照片；

图6b为图6a所示的12个样品通过蛋白质印迹法显示的重组人a2b的表达情况照片；

图6c为图6a和图6b中显示重组人a2b表达阳性的编号为mi15的动物乳汁样品，经常规祛酪蛋白初纯后进行同位素标记配体结合实验的蛋白-配体结合亲和力示意图；

图7a为本发明实施例3的动物乳汁样品通过sds-page银染法显示的重组人ace2的表达情况照片；

图7b为实施例3的编号为mi25的样品经anti-his树脂进行蛋白纯化后形成的洗脱液通过sds-page银染法显示的蛋白条带的照片；

图7c为实施例3的编号为mi25的样品用anti-his树脂进行蛋白纯化后形成的洗脱液经蛋白质印迹法显示的蛋白条带的照片；

图8a为本发明实施例4的动物乳汁样品通过sds-page银染法显示的重组人cxcr4的表达情况照片；

图8b为图8a所示的编号为mi30的样品通过蛋白质印迹法显示的重组人cxcr4的表达情况照片；

图8c为实施例4的编号为mi30的样品经anti-flag树脂进行蛋白纯化后形成的洗脱液通过sds-page银染法显示的蛋白条带的照片；

图8d为实施例4的编号为mi30的样品用anti-flag树脂进行蛋白纯化后形成的洗脱液经蛋白质印迹法显示的蛋白条带的照片。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另外定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本文中使用的“包括”和“包含”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。

现有技术中，由腺病毒载体介导的动物乳腺表达生产转基因蛋白药物的一个主要限制是腺病毒载体已知只支持短暂的蛋白表达，这种表达仅能够持续大约一周，一般认为是由诱导动物机体对腺病毒的较强免疫反应所引起。这种免疫反应还可能阻止动物乳腺再次表达同样重组蛋白。

考虑到山羊和牛等大型动物的季节性哺乳期为10个月或更长，缺乏重组蛋白表达生产的持续性是腺病毒载体介导的动物乳腺表达生产转基因蛋白药物的一个主要缺点。

针对现有技术存在的问题，本发明的实施例提供了一种通过动物乳腺腺相关病毒介导的转导方式生产目标蛋白的方法，以实现所述目标蛋白的快速和高水平表达。

图1为本发明实施例的通过动物乳腺腺相关病毒介导的转导方式生产重组目标蛋白的方法流程图。参照图1，本发明实施例的所述通过动物乳腺腺相关病毒介导的转导方式生产重组目标蛋白的方法包括：

s1：提供过表达载体，所述过表达载体包含目标蛋白的基因和腺相关病毒载体，对所述过表达载体进行病毒包装，以形成病毒悬液；

s2：将所述病毒悬液通过腺相关病毒介导的转导方式导入临产的非人哺乳动物的乳腺组织或乳腺管中以完成病毒导入，并使所述非人哺乳动物在泌乳过程中通过乳腺细胞表达和分泌所述重组目标蛋白；

s3：获取所述非人哺乳动物于泌乳期分泌的乳汁，从所述乳汁中获取所述重组目标蛋白。

现有技术中，通过动物乳腺生物反应器或腺病毒载体进行蛋白表达的周期较长，本发明实施例中，所述过表达载体包含目标蛋白的基因和腺相关病毒载体，对所述过表达载体进行病毒包装，然后利用得到的病毒悬液通过腺相关病毒介导的转导方式导入临产的非人哺乳动物的乳腺组织或乳腺管中以完成病毒导入，申请人发现腺相关病毒载体介导的重组目标蛋白在动物乳汁中持续表达时间至少为10-30天，所述重组目标蛋白表达量为0.3-12g/l。并且，局部感染腺相关病毒的临产期母兔能很快康复，像其他健康临产母兔一样，正常产奶。可见腺相关病毒载体有助于实现所述重组目标蛋白的快速和高水平表达，并取得了意想不到的技术效果。

本发明一些实施例的所述步骤s1中，所述目标蛋白为胆碱酯酶、过氧化物酶、生长激素、抗病毒蛋白、病毒结构蛋白、类病毒颗粒和膜蛋白中的任意一种或所述任意一种的片段或衍生物。

本发明实施例1-4中，所述病毒载体为腺相关病毒载体，所述目标蛋白分别为人cb1受体、人腺苷a2b受体、人血管紧张素转化酶ii受体和人cxcr4受体。为方便叙述，分别简记为人cb1、人a2b、人ace2和人cxcr4。其中，人cb1、人a2b和人cxcr4均属于膜蛋白，人ace2既属于膜蛋白，又属于抗病毒蛋白。

具体的，将人cb1的cdna质粒、人a2b的cdna质粒、人ace2的cdna质粒和人cxcr4的cdna质粒分别克隆至所述腺相关病毒载体，形成的过表达载体分别记为paav-cag-cb1、paav-cag-a2b、paav-cag-ace2和paav-cag-cxcr4。paav-cag-cb1、paav-cag-a2b、paav-cag-ace2和paav-cag-cxcr4，且对应的序列分别如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4所示。

本发明实施例1-4的过表达载体的序列结构为paav-cag启动子-目标蛋白编码序列-wpre-sv40聚腺苷酸化信号序列。

图2为本发明实施例1的过表达载体的质粒图谱。

参照图2，序列结构为paav-cag-cb1的过表达载体具有的启动子为cag启动子。更具体的，腺相关病毒载体5’端和3’端的两个itr代表腺相关病毒反向末端重复序列，cmvenh代表cmv增强子序列，cagpro代表cag启动子序列，cb1代表目标蛋白cb1的编码序列，wpre代表土拨鼠肝炎病毒转录后调控序列，sv40pa代表sv40聚腺苷酸化信号序列。

作为本领域公知常识的是，cag启动子包含了cmv病毒启动子的增强子序列和鸡β-actin的启动子序列。由于本发明实施例选用的cag启动子保留了cmv病毒的增强子，因此转录能力与cmv启动子不相上下，鸡β-actin启动子则为它提供了更加广泛的表达谱，有利于驱动目标蛋白的基因在不同哺乳动物载体的高水平表达。

具体的，cag启动子序列为本领域技术人员的公知常识，在此不做赘述。

本发明实施例2-4的paav-cag-cb1、paav-cag-a2b、paav-cag-ace2和paav-cag-cxcr4所分别具有的cag启动子的序列结构与实施例1的paav-cag-cb1中的cag启动子的序列结构一致，在此不做赘述。

本发明一些实施例中，所述过表达载体的序列结构为paav-山羊β-酪蛋白基因（bcn）启动子-目标蛋白编码序列-wpre-sv40聚腺苷酸化信号序列。

本发明一些实施例中，所述病毒载体为腺相关病毒载体，所述目标蛋白为人丁酰胆碱酯酶，简记为人bche。人bche属于胆碱脂酶。

具体的，将人bche的cdna质粒的cdna质粒克隆至所述腺相关病毒载体，形成的过表达载体记为paav-bcn-bche，且序列如seqidno.5所示，对应的质粒图谱如图3所示。

参照图3，paav-bcn-bche具有的启动子序列为bcn启动子。具体的，腺相关病毒载体5’端和3’端的两个itr代表腺相关病毒反向末端重复序列，cmvenh代表cmv增强子序列，bcnpro代表山羊β-酪蛋白基因启动子序列，bche代表目标蛋白bche的编码序列，wpre代表土拨鼠肝炎病毒转录后调控序列，sv40pa代表sv40聚腺苷酸化信号序列。

paav-bcn-bche中的bcn启动子包含了cmv病毒启动子的增强子序列以及bce-1、tatabox、stat5、nfkb等复合元件和转录翻译调节因子的作用位点。其中bce-1是山羊β-酪蛋白基因启动子中最具特征的元素之一，负责基因表达的激素依赖性调节。

由于本发明实施例所选用的bcn启动子序列保留了cmv病毒的增强子，因此转录能力与cmv启动子不相上下，bcn启动子则提供了动物乳腺特异表达启动子序列，有利于驱动目标蛋白在不同哺乳动物乳腺的高水平表达和分泌。

更具体的，bcn启动子的序列对应着seqidno.5序列中的第2646位点至第4591位点的序列片段，其中bcn启动子的序列包括了seqidno.5序列中的第2646位点至2895位点的cmv增强子序列。

参照图3，位于两个itr之间的序列片段的碱基对长度不超过5kb。本发明一些实施例中，位于两个itr之间的序列片段对应着seqidno.5序列中的第2457位点至第7457位点的序列片段。

本发明一些实施例中，所述病毒载体为腺相关病毒载体，所述目标蛋白为辣根过氧化物酶，简记为hrp。hrp属于过氧化物酶。

具体的，将hrp的cdna质粒克隆至所述腺相关病毒载体，形成的过表达载体记为paav-bcn-hrp，且序列如seqidno.6所示。paav-bcn-hrp所含有的bcn启动子的序列结构与序列结构为paav-bcn-bche且序列如seqidno.5所示的过表达载体中所含有的bcn启动子的序列结构一致，在此不做赘述。本发明一些实施例中，所述过表达载体的序列结构为paav-cmv启动子-目标蛋白编码序列-wpre-sv40聚腺苷酸化信号序列。

本发明一些实施例中，所述病毒载体为腺相关病毒载体，所述目标蛋白为hrp。将hrp的cdna质粒克隆至所述腺相关病毒载体，形成的过表达载体记为paav-cmv-hrp，且序列如seqidno.7所示，质粒图谱如图4所示。

参照图4，paav-cmv-hrp所具有的启动子序列为cmv启动子。具体的，腺相关病毒载体5’端和3’端的两个itr代表腺相关病毒反向末端重复序列，cmvpro代表cmv启动子序列，hrp代表目标蛋白hrp的编码序列，wpre代表土拨鼠肝炎病毒转录后调控序列，sv40pa代表sv40聚腺苷酸化信号序列。

作为本领域公知常识的是，cmv启动子包含了cmv病毒启动子的增强子序列，是启动真核基因表达的强力启动子，有利于驱动基因在不同哺乳动物载体的高水平表达。

具体的，cmv启动子序列为本领域技术人员的公知常识，在此不做赘述。

更具体的，如seqidno.1-7所示的所述过表达载体序列中所表达重组目标蛋白分泌的信号肽编码序列选自山羊β-酪蛋白基因，能充分引导新合成的目标蛋白向动物乳汁分泌通路转移。

本发明实施例的人cb1受体的cdna质粒和人腺苷a2b受体的cdna质粒来源于上海药明康德新药开发有限公司；人ace2的cdna质粒来源于上海钦诚生物科技有限公司；人cxcr4受体的cdna质粒来源于南京金斯瑞生物科技有限公司；人bche和hrp的cdna质粒来源于上海桀蒙生物技术有限公司；腺相关病毒载体来源于和元生物技术(上海)股份有限公司。

具体的，将各类受体的cdna质粒克隆至所述腺相关病毒载体的过程为本领域技术人员的常规技术手段，具体操作过程请参见美国纽约的冷泉港实验室（coldspringharborlaboratory）于1989年出版的《分子克隆：实验室手册》第二版，在此不做赘述。

本发明一些实施例中，所述过表达载体含有cag启动子、bcn启动子或cmv启动子中的任意一种、山羊β-酪蛋白信号肽编码序列、wpre及sv40聚腺苷酸化信号。

本发明一些实施例中，使用所述过表达载体、第一辅助质粒和第二辅助质粒对293t细胞进行不少于48小时的共转染，然后对得到的转染液进行纯化处理，以完成所述病毒包装。

本发明实施例1-4中，所述第一辅助质粒为paav-rc质粒，所述第二辅助质粒为phelper质粒，所述共转染的时间不少于48小时。

具体的，所述共转染和所述纯化处理的具体方法为本领域技术人员的常规技术手段，具体操作由和元生物技术(上海)股份有限公司完成，在此不做赘述。

本发明一些实施例中，使用荧光定量pcr法检测所述病毒悬液的滴度，所述滴度不低于1×10¹²基因拷贝数/毫升，以有助于所述重组目标蛋白的快速和高水平表达。

本发明实施例1-4中，所述滴度均为1×10¹³基因拷贝数/毫升。

本发明一些实施例的所述步骤s2中，所述临产的非人哺乳动物为距离预产期2-10天的健康的非人哺乳动物，以保证腺相关病毒能够感染乳腺细胞，使得所述重组目标蛋白通过泌乳过程分泌到乳汁中进行表达。

本发明一些实施例中，所述重组目标蛋白在动物乳汁中持续表达时间为10-30天，所述重组目标蛋白表达量为0.3-12g/l。

本发明一些实施例中，所述重组目标蛋白在动物乳汁中持续表达时间为20-30天，所述重组目标蛋白表达量为1-10g/l。

本发明一些实施例中，所述非人哺乳动物为小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、猪和牛中的任意一种。

本发明实施例1-4使用的非人哺乳动物均为距离预产期2-4天的健康临产母兔。所述健康临产母兔来源于上海奉贤腾达兔业专业合作社。

具体的，将每只健康临产母兔的乳腺部位的体毛剔除干净后用酒精消毒乳头以及周围皮肤后，采用医用注射器将所述病毒悬液注射入临产的非人哺乳动物的乳腺组织或乳腺管中以完成病毒导入。每只健康临产母兔注射2-4个乳头，注射完毕后使用酒精对注射部位进行消毒。

本发明一些实施例中，所述病毒导入完成后，利用刺激装置对所述临产的非人哺乳动物的乳腺部位进行1-2分钟的电刺激，以有利于快速转染。

本发明一些具体的实施例中，所述刺激装置为常规电脉冲刺激仪。

本发明一些实施例中，所述病毒导入完成后，获取所述非人哺乳动物于泌乳期分泌的乳汁，并检测所述重组目标蛋白的表达情况。

本发明实施例1-4中，所述病毒导入完成后，待每只健康临产母兔完成了仔兔的生产，使用挤奶器收集每只健康临产母兔分泌的乳汁，通过蛋白质印迹法（westernblot）和sds-page银染法的至少一种检测动物乳汁中的重组人cb1、重组人a2b、重组人ace2、重组人cxcr4和重组人bche的表达情况。本发明实施例1-4中，所有动物乳汁样品收集后均经常规祛酪蛋白进行了初步纯化。

其中，本发明实施例2还包括：将获取的含重组人a2b的动物乳汁样品经常规祛酪蛋白初纯后进行同位素标记配体结合实验。常规祛酪蛋白初纯和同位素标记配体结合实验为本领域技术人员的常规技术手段，同位素标记配体结合实验委托上海药明康德新药开发有限公司进行，在此不做赘述。

本发明实施例4还包括：将获取的含重组人cxcr4的动物乳汁样品经过常规祛酪蛋白和sma初纯后用anti-flag树脂进行蛋白纯化。常规祛酪蛋白和sma初纯以及蛋白纯化为本领域技术人员的常规技术手段，蛋白纯化委托上海美迪西生物医药股份有限公司进行，在此不做赘述。

本发明实施例1中，通过sds-page银染法进行检测前，使用来源于生工生物工程(上海)有限公司的pbs缓冲液对所述动物乳汁进行1：1000的稀释。sds-page银染法为本领域技术人员所采用的常规技术手段，具体操作过程请参见美国纽约的冷泉港实验室（coldspringharborlaboratory）于1989年出版的《分子克隆：实验室手册》第二版，在此不做赘述。

图5a为本发明实施例1的动物乳汁样品通过sds-page银染法显示的重组人cb1的表达情况照片。

参照图5a，实施例1的健康临产母兔第一次分泌的动物乳汁样品编号为mi1，间隔4天采集一次乳汁并编号为mi2，然后每间隔4天采集一次乳汁并顺次编号为mi3、mi4和mi5。

对第一次采集的动物乳汁样品、第二次采集的乳汁样品和第三次采集的乳汁样品分别进行酪蛋白沉淀和wga试剂盒纯化，形成的乳汁样品的样品编号顺次为mi6、mi7和mi8。wga试剂盒来源于美国vectorlabs公司。

m1为实施例1的蛋白大小标记样品（来源于上海翊圣生物科技有限公司），n1和n2为阴性对照。具体的，阴性对照为rbche阳性的动物乳汁样本。

从图5a中的白色星号标记可见，mi3、mi4、mi5、mi7和mi8五个样品显示了约130k二聚体阳性模糊条带，而65k单体条带则可能隐藏在50-90k的强蛋白条带中。从图5a中的黑色星号标记可见，n1和n2均显示了约90krbche条带，表达量约10-12克/升。由于mi5为健康临产母兔自第一次分泌动物乳汁后的第20天收集的样本，可见实施例1的重组人cb1在动物乳汁中持续表达时间可高达20天。

本发明实施例1中，通过蛋白质印迹法进行检测前，使用来源于生工生物工程(上海)有限公司的pbs缓冲液对所述动物乳汁进行1：300的稀释。具体的，使用鼠抗cb1单抗作为一抗，使用山羊抗鼠-hrp作为二抗进行间接检测，所述间接检测的具体操作为本领域技术人员的常规技术手段，具体操作步骤请参见美国纽约的冷泉港实验室（coldspringharborlaboratory）于1989年出版的《分子克隆：实验室手册》第二版，在此不做赘述。

图5b为图5a所示的mi6、mi7和mi8三个样品通过蛋白质印迹法显示的重组人cb1的表达情况。从图5b所示的白色星号标记可见，mi7和mi8显示了约130k二聚体阳性模糊条带，而三个样品都显示了约65k的蛋白单体条带。

本发明实施例2中，通过sds-page银染法进行检测前，使用与实施例1相同的常规pbs缓冲液对所述动物乳汁进行1：1000的稀释。sds-page银染法的具体操作方法请参见实施例1。

图6a为本发明实施例2的动物乳汁样品通过sds-page银染法显示的重组人a2b的表达情况照片。

参照图6a，实施例2的一只健康临产母兔第一次分泌的动物乳汁样品编号为mi9，间隔4天采集一次乳汁编号为mi10，然后每间隔4天采集一次乳汁并顺次编号为mi11、mi12和mi13；同时对另一只健康临产母兔在对应的时间分别采集乳汁并顺次编号为mi14、mi15、mi16、mi17和mi18。

m2为实施例2的蛋白大小标记样品（来源于上海翊圣生物科技有限公司），n3为mi9至mi13以及mi14至mi18的10个样品的阴性对照。阴性对照为rbche阳性的动物乳汁样本。

从图6a的黑色星号标记可知，mi9、mi14和mi15显示了约40k阳性条带，从图6a的白色星号标记可知，n2显示了约90krbche条带，表达量约10-12克/升。

本发明实施例2中，通过蛋白质印迹法进行检测前，使用与实施例1相同的常规pbs缓冲液对所述动物乳汁进行1：500的稀释。具体的，使用兔抗a2b多抗作为一抗，使用山羊抗兔-hrp作为二抗进行间接检测。具体检测方法请参见实施例1。

图6b为图6a所示的12个样品通过蛋白质印迹法显示重组人a2b的表达情况照片。从图6b所示的黑色星号标记可见，mi9、mi14和mi15显示了约40k阳性条带。

实施例2中，图6c为图6a和图6b中显示重组人a2b表达阳性的编号为mi15的动物乳汁样品，经常规祛酪蛋白初纯后进行同位素标记配体结合实验的蛋白-配体结合亲和力（放射性元素放射性测定强度）示意图。阴性样品为采自同期健康生产后母兔的乳汁样品n4，阳性对照为上海药明康德新药开发有限公司提供的重组人a2b过表达细胞系膜结构，同位素标记的配体为³h-cgs15943。参照图6c，mi15的蛋白-同位素标记配体亲和力与阳性对照相当，具有良好的活性，证明来源于动物乳汁的重组人a2b受体膜结构可有效替代目前市场上售价昂贵的重组人a2b过表达细胞系膜结构。值得注意的是，这种实验结果为国内外首次显示。

本发明实施例3中，通过sds-page银染法进行检测前，使用与实施例1相同的常规pbs缓冲液对所述动物乳汁进行1：1000的稀释。sds-page银染法具体请参见实施例1。

图7a为本发明实施例3的动物乳汁样品通过sds-page银染法显示的重组人ace2的表达情况照片。

参照图7a，实施例3的一只健康临产母兔第一次分泌的动物乳汁样品编号为mi19，间隔4天采集一次乳汁编号为mi20，然后每间隔4天采集一次乳汁并顺次编号为mi21、mi22和mi23；同时对另一只健康临产母兔在第一次分泌的乳汁样品编号为mi24，间隔4天采集一次乳汁编号为mi25，然后每间隔4天采集一次乳汁并顺次编号为mi26、mi27和mi28。

m3为实施例3的蛋白大小标记样品（来源于上海翊圣生物科技有限公司），n5为mi19至mi23以及mi24至mi28的10个样品的阴性对照。阴性对照为rbche阳性的动物乳汁样本。

从图7a中的白色星号标记可见，mi19、mi20和mi24至mi28的7个样品显示了约95k阳性条带，从图7a中的黑色星号标记可见，n3显示了约90krbche条带，表达量约10-12克/升。以n3的rbche条带作为参考，证明mi19、mi20和mi24至mi28的7个样品中重组人ace2表达量为1-10克/升，蛋白表达时间持续20-30天。

图7b为图7a所示的编号为mi25的样品和阴性样品n5经anti-flag树脂进行蛋白纯化后形成的洗脱液通过sds-page银染法显示的蛋白条带的照片。mi25洗脱液显示了约95k阳性条带，而该条带并没有在n5洗脱液中出现。

图7c为实施例3的编号为mi25的样品和阴性样品n5经anti-flag树脂进行蛋白纯化后形成的洗脱液通过蛋白质印迹法显示重组人ace2的表达情况照片。mi25洗脱液显示了约95k阳性条带，而该条带并没有在n5洗脱液中出现。实验中，使用鼠抗ace2单抗作为一抗，使用山羊抗鼠-hrp作为二抗进行间接检测。具体检测方法请参见实施例1。

本发明实施例4中，通过sds-page银染法进行检测前，使用与实施例1相同的常规pbs缓冲液对所述动物乳汁进行稀释。sds-page银染法具体参见实施例1。

图8a为本发明实施例4的动物乳汁样品通过sds-page银染法显示的重组人cxcr4的表达情况照片。

参照图8a，实施例4的一只健康临产母兔第一次分泌动物乳汁经常规pbs缓冲液进行1：500稀释后形成的样品编号为mi29，进行1:1000稀释后形成的样品编号为mi30。n6和n7分别为mi29和mi30的阴性对照。阴性对照为rbche阳性的动物乳汁样本。

从图8a的黑色星号标记可知，mi29和mi30显示了约37k阳性条带，而此条带在n6和n7阴性对照样品中没有显示。

本发明实施例4中，通过蛋白质印迹法进行检测前，使用常规pbs缓冲液对所述动物乳汁进行1：1000的稀释。具体的，使用兔抗cxcr4多抗作为一抗，使用山羊抗兔-hrp作为二抗进行间接检测。具体检测方法请参见实施例1。

图8b为图8a所示的编号为mi30的样品通过蛋白质印迹法显示重组人cxcr4的表达情况照片。如图8b所示，mi30显示了约37k阳性条带，此条带在n7阴性对照样品中没有显示；而约60k蛋白条带为背景蛋白，表明蛋白质印迹法蛋白各样本上样量相同。

图8c为实施例4的编号为mi30的样品经anti-flag树脂进行蛋白纯化后形成的洗脱液通过sds-page银染法显示的蛋白条带的照片。从图8c的黑色星号标记可知，三个洗脱液的编号分别为mi30a、mi30b和mi30c，均显示了约37k阳性条带，而约80k条带则可能是重组人cxcr4二聚体。

图8d为图8c所示的编号为mi30的样品用anti-flag树脂进行蛋白纯化后形成的洗脱液经蛋白质印迹法显示的蛋白条带的照片。如图8d所示，三个洗脱液的编号分别对应图8c的mi30a，mi30b和mi30c，均显示了约37k阳性条带，而约80k条带可能是重组人cxcr4二聚体。实验中，使用兔抗cxcr4多抗作为一抗，使用山羊抗兔-hrp作为二抗进行间接检测。具体检测方法请参见实施例1。

虽然在上文中详细说明了本发明的实施方式，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，能够对这些实施方式进行各种修改和变化。但是，应理解，这种修改和变化都属于权利要求书中所述的本发明的范围和精神之内。而且，在此说明的本发明可有其它的实施方式，并且可通过多种方式实施或实现。

序列表

<110>上海桀蒙生物技术有限公司

<120>生产重组目标蛋白的方法、过表达载体以及病毒悬液

<130>2020.09.14

<150>hrcn20l31041-y

<151>2020-09-14

<160>7

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