猫泛白细胞减少症病毒抗体、含有猫泛白细胞减少症病毒抗体的试剂盒及应用的制作方法

1.本发明涉及猫泛白细胞减少症病毒抗体，以及含抗体制备的试剂盒和应用，属于免疫测定法领域。


背景技术：

2.猫泛白细胞减少症病毒(又称猫细小病毒或猫瘟病毒，feline panleukopenia virus，fpv)，属于细小病毒属，是三种极为相似的自主复制型病毒(参见于明科等.水貂肠炎病毒、猫泛白细胞减少症病毒以及犬细小病毒2型间的关系比较.中国兽医杂志,1992(6):45-47)，属于致病性最强、感染范围最宽的一种；四季均可引发感染，能引起犬、猫、水貂的高度接触性、急性传染病，引发的临床症状为高热、呕吐、严重脱水、白细胞减少，体温升高，食欲废绝，精神沉郁，感染率、死亡率均较高，特别地幼龄动物死亡率高达90％，带来巨大损失(参见饶家辉等.猫细小病毒、犬细小病毒、貂细小病毒的特征比较.中国畜牧兽医,2009,36(7):166-168)。
3.在世界范围内，猫作为实验动物在医学、生物学等实验和动物疾病模型研究中的应用越来越广泛，在某些试验中，如药理学、血压相关试验、疾病诊断、营养学相关研究、肿瘤学、解剖学等研究中功不可没。猫作为实验动物，虽然应用越来越广泛，但由于检测试剂缺乏，用作试验的猫多数为未经严格检测的宠物猫、捕获的野猫或中华田园猫，国内目前尚未见有开展实验用猫的检测报告，安全隐患突显。
4.目前，检测猫泛白细胞减少症病毒的方法包括pcr、血凝试验等方法，但这些方法各有缺点，以pcr(参见刘维全等.肉食兽细小病毒通用pcr诊断技术的建立.中国兽医学报.2001,21(3):249-251)为主的分子生物学方法对技术和设备要求均较高、操作繁琐、耗时较长；血凝试验不仅需要红细胞且要求红细胞必须现配现用，操作时间较长，临床实际检测时发现还易受分泌物或排泄物中的杂质干扰。上述这些检测方法均难以在兽医临床现场应用。此外，目前商品化的试纸条产品检测的靶标仅为粪便、肛拭子，当用于检测其他类型的样本时，准确度不能保证。
5.因此，为了保证试验时实验猫的质量水平、提高实验的准确度，为了保障养猫人的人身健康和安全，急需研制一种快速简便、准确地检测猫泛白细胞减少症病毒的产品以用于临床诊断。


技术实现要素：

6.为解决现有技术的不足，本发明提供了一对猫泛白细胞减少症病毒单克隆抗体，以及含单克隆抗体的试剂盒及其应用。
7.本发明涉及一种抗体，其由ig单体的基本单位构成，所述ig单体分子含有四条异源性多肽链，其中，分子量较大的两条链为重链，分子量较小的两条链为轻链，同一所述ig分子中的所述两条重链之间的氨基酸组成完全相同，同一所述ig分子中的所述两条轻链之
间的氨基酸组成完全相同，其中，每一条所述重链的n端上具有重链可变区，所述重链可变区如seq id no.1所示，每一条所述轻链的n端上具有轻链可变区，所述轻链可变区如seq id no.2所示。
8.本发明抗体的重链可变区seq id no.1、轻链可变区seq id no.2能与猫泛白细胞减少症病毒具有良好的结合能力，hi效价为1∶5120、ifa效价为1∶6400。
9.作为本发明的一种实施方式，所述抗体为iga、igd、ige、igg或igm。
10.本发明还涉及一种特异性结合猫泛白细胞减少症病毒的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段的重链可变区如seq id no.1所示或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体，以及所述抗体或其片段轻链可变区如seq id no.2所示或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
11.作为本发明的一种实施方式，所述抗体或其片段为单克隆抗体、基因工程抗体，其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体或所述单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体的片段，所述抗体或其片段仍保持特异性结合猫泛白细胞减少症病毒的能力。
12.作为本发明的一种优选实施方式，所述抗体或其片段为单克隆抗体3c3，所述单克隆抗体3c3重链可变区如seq id no.1所示，轻链可变区如seq id no.2所示。
13.所述单克隆抗体3c3识别的抗原表位位于猫泛白细胞减少症病毒vp2蛋白。所述单克隆抗体3c3重链可变区如seq id no.1所示，轻链可变区如seq id no.2所示；所述单克隆抗体3c3对猫泛白细胞减少症病毒的hi效价为1︰5120、ifa效价为1︰6400，表明其与猫泛白细胞减少症病毒具有良好的反应特性。
14.本发明还涉及一种杂交瘤细胞3c3株，所述杂交瘤细胞3c3株分泌所述单克隆抗体3c3。
15.本发明还涉及一种抗体，其由ig单体的基本单位构成，所述ig单体分子含有四条异源性多肽链，其中，分子量较大的两条链为重链，分子量较小的两条链为轻链，同一所述ig分子中的所述两条重链之间的氨基酸组成完全相同，同一所述ig分子中的所述两条轻链之间的氨基酸组成完全相同，其中，每一条所述重链的n端上具有重链可变区，所述重链可变区如seq id no.3所示，每一条所述轻链的n端上具有轻链可变区，所述轻链可变区如seq id no.4所示。
16.本发明抗体的重链可变区seq id no.3、轻链可变区seq id no.4能与猫泛白细胞减少症病毒具有良好的结合能力，hi效价为1∶10240、ifa效价为1∶12800。
17.作为本发明的一种实施方式，所述抗体为iga、igd、ige、igg或igm。
18.本发明还涉及一种特异性结合猫泛白细胞减少症病毒的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段的重链可变区如seq id no.3所示或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体，以及所述抗体或其片段轻链可变区如seq id no.4所示或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
19.作为本发明的一种实施方式，所述抗体或其片段为单克隆抗体、基因工程抗体，其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体或所述单链抗体、
嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体的片段，所述抗体或其片段仍保持特异性结合猫泛白细胞减少症病毒的能力。
20.作为本发明的一种优选实施方式，所述抗体或其片段为单克隆抗体4a1，所述单克隆抗体4a1重链可变区如seq id no.3所示，轻链可变区如seq id no.4所示。
21.所述单克隆抗体4a1识别的抗原表位位于猫泛白细胞减少症病毒vp2蛋白。所述单克隆抗体4a1重链可变区如seq id no.3所示，轻链可变区如seq id no.4所示；所述单克隆抗体4a1对猫泛白细胞减少症病毒的hi效价为1︰10240、ifa效价为1︰12800，表明其与猫泛白细胞减少症病毒具有良好的反应特性。
22.本发明还涉及一种杂交瘤细胞4a1株，所述杂交瘤细胞4a1株分泌所述单克隆抗体4a1。
23.本发明还涉及一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括猫泛白细胞减少症病毒胶体金检测试纸条、样品处理液，所述试纸条包括有效量的所述单克隆抗体3c3、有效量的金标记的所述单克隆抗体4a1，或所述试纸条包括有效量的所述单克隆抗体4a1、有效量的金标记的所述单克隆抗体3c3，以及对猫泛白细胞减少症病毒抗原抗体反应进行检测的检测试剂。
24.本发明的试剂盒根据双抗体夹心检测抗原的原理构建，可通过包括但不限于elisa、酶免试纸条、胶体金检测试纸条、荧光试纸条等方法实现抗原检测。
25.作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒中所述试纸条包括：底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜与金标垫接触或与样品垫、金标垫接触使得猫泛白细胞减少症病毒抗原与所述金标记的单克隆抗体4a1的结合体能在其上向底板第二端迁移；所述金标垫上含有胶体金标记的所述单克隆抗体4a1，所述硝酸纤维素膜上包括检测线和质控线，所述检测线上固定化有所述单克隆抗体3c3，所述质控线上固定化有羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗；其中，所述有效量的所述单克隆抗体3c3为0.5～2.5mg/ml，所述有效量的所述单克隆抗体4a1胶体金标记时为4～64μg/ml，所述羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗为1.0～3.0mg/ml；其中，所述样品处理液为含ph 7.4的0.01m pbs、0.5％v/v triton x-114、0.2％～1.0％w/v pluronic f-68、0.05％proclin300的溶液。
26.所述试剂盒中所述试纸条中所述单克隆抗体3c3的含量可以为0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1.0mg/ml、1.1mg/ml、1.2mg/ml、1.3mg/ml、1.4mg/ml、1.5mg/ml、1.6mg/ml、1.7mg/ml、1.8mg/ml、1.9mg/ml、2.0mg/ml、2.1mg/ml、2.2mg/ml、2.3mg/ml、2.4mg/ml、2.5mg/ml。
27.所述试剂盒中所述试纸条中所述单克隆抗体4a1胶体金标记时的含量可以为4μg/ml、5μg/ml、6μg/ml、7μg/ml、8μg/ml、9μg/ml、10μg/ml、11μg/ml、12μg/ml、13μg/ml、14μg/ml、15μg/ml、16μg/ml、17μg/ml、18μg/ml、19μg/ml、20μg/ml、21μg/ml、22μg/ml、23μg/ml、24μg/ml、25μg/ml、26μg/ml、27μg/ml、28μg/ml、29μg/ml、30μg/ml、31μg/ml、32μg/ml、33μg/ml、34μg/ml、35μg/ml、36μg/ml、37μg/ml、38μg/ml、39μg/ml、40μg/ml、41μg/ml、42μg/ml、43μg/ml、44μg/ml、45μg/ml、46μg/ml、47μg/ml、48μg/ml、49μg/ml、50μg/ml、51μg/ml、52μg/ml、53μg/ml、54μg/ml、55μg/ml、56μg/ml、57μg/ml、58μg/ml、59μg/ml、60μg/ml、61μg/ml、62μg/ml、63μg/ml、64μg/ml。
28.所述试剂盒中所述样品处理液中所述pluronic f-68的含量可以为0.2％w/v、
0.3％w/v、0.4％w/v、0.5％w/v、0.6％w/v、0.7％w/v、0.8％w/v、0.9％w/v、1.0％w/v。
29.作为本发明的一种实施方式，所述试纸条中所述有效量的所述单克隆抗体3c3为0.8～2.5mg/ml，所述有效量的所述单克隆抗体4a1胶体金标记时为8～50μg/ml。
30.作为本发明的一种实施方式，所述试纸条中所述有效量的所述单克隆抗体3c3为0.8～1.5mg/ml，所述有效量的所述单克隆抗体4a1胶体金标记时为12～50μg/ml。
31.作为本发明的一种优选实施方式，所述试纸条中所述有效量的所述单克隆抗体3c3为1.0mg/ml、所述有效量的所述单克隆抗体4a1胶体金标记时为18μg/ml，或所述有效量的所述单克隆抗体3c3为1.5mg/ml、所述有效量的所述单克隆抗体4a1胶体金标记时为12μg/ml，或所述有效量的所述单克隆抗体3c3为1.0mg/ml、所述有效量的所述单克隆抗体4a1胶体金标记时为12μg/ml。
32.作为本发明的一种实施方式，所述试纸条中沿所述第一端向第二端的方向上依次排列的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫相邻的部件之间相互接触，而不相邻的部件之间不接触。
33.作为本发明的一种实施方式，所述检测线与所述质控线之间的距离≥4mm。
34.本发明还涉及所述胶体金检测试剂盒的制备方法，包括：
35.步骤1)用胶体金将所述单克隆抗体4a1标记为金标抗体，制成金标垫；
36.步骤2)固定所述单克隆抗体3c3、羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗分别吸附于硝酸纤维素膜的一端作为检测线、质控线；
37.步骤3)将样品垫、所述步骤1)所制备的金标垫、所述步骤2)所制备的硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在所述底板上，裁剪；
38.以及步骤4)配制样品处理液并分装；连同所述步骤3)制备的样品处理液组装成试剂盒。
39.作为本发明的一种实施方式，所述步骤1)中所述单克隆抗体4a1标记时含量为8～50μg/ml。
40.作为本发明的一种实施方式，所述步骤2)中所述检测线上固定的所述单克隆抗体3c3的量为0.8～2.5mg/ml，所述质控线上固定的所述羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗为1～3mg/ml。
41.作为本发明的一种实施方式，所述步骤3)中所述样品处理液为含ph 7.4的0.01m pbs、0.5％v/v triton x-114、0.2％～1.0％w/v pluronic f-68、0.05％proclin300的溶液。
42.作为本发明的一种实施方式，所述步骤3)中所述样品处理液为含ph 7.4的0.01m pbs、0.5％v/v triton x-114、0.5％w/v pluronic f-68、0.05％proclin300的溶液。
43.本发明还涉及所述试剂盒在用于非免疫诊断方面的应用，其中，所述非免疫诊断方面的应用包括流行病学分析、对离体组织进行检测、表位鉴定研究、猫泛白细胞减少症病毒抗原反应性。
44.本发明还提供了一种单链抗体，其中，所述单链抗体的重链可变区如seq id no.1或seq id no.3所示，所述单链抗体的轻链可变区如seq id no.2或seq id no.4所示。
45.本发明的单链抗体具有单克隆抗体3c3、4a1的重链可变区、轻链可变区，其与猫泛白细胞减少症病毒毒株具有良好结合能力。
46.本发明还涉及所述抗体或其片段用于猫泛白细胞减少症病毒抗原表位鉴定研究；所述抗体或其片段为单克隆抗体3c3或单克隆抗体4a1。
47.本发明的含有所述单克隆抗体对的试剂盒不仅能高灵敏度地检测fpv，还可检测猫源的多种靶标，而且符合率较高、准确度较高，弥补了现有商品化产品fpv的缺陷，且具有快速、简便、准确的优势，更有利于临床的应用。
具体实施方式
48.以下，对本发明的实施方式进行说明。
49.术语“猫泛白细胞减少症病毒”又称猫细小病毒(feline panleukopenia virus，fpv)、猫瘟热病毒、猫瘟病毒、猫传染性肠炎病毒，属于细小病毒科细小病毒属，仅1个血清型，可感染猫科、浣熊科、鼬科等多种动物，以猫科动物及鼬科中水貂最为易感，主要引发猫科动物的猫泛白细胞减少症(一种急性高度接触性的传染病，又称猫瘟热、猫传染性肠炎、猫细小病毒性肠炎、猫共济失调症等)，感染后的临床症状主要包括白细胞减少、出血性肠炎、腹泻、突发性发热及呕吐等。
50.术语“vp2蛋白”为猫泛白细胞减少症病毒的主要结构蛋白，是构成核衣壳的2种蛋白之一，形成环状结构，其分子量约为65kd。
51.术语“抗体”是机体免疫细胞被抗原激活后，b细胞分化成熟为浆细胞后所合成、分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。
52.术语“ig”，免疫球蛋白(immunologlobulin)，指具有抗体(ab)活性或化学结构，与抗体分子相似的球蛋白。免疫球蛋白是由两条相同的轻链和两条相同的重链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。
53.术语“iga”，免疫球蛋白a(immunoglobulin a，缩写：iga)，在血清中的含量仅次于igg，占血清免疫球蛋白的10～20％，存在于黏膜组织，例如消化道、呼吸道以及泌尿生殖系统。黏膜组织具有黏膜层淋巴组织，会制造出iga以避免遭到病原的入侵，也存在于唾液、泪液以及乳汁当中，尤其是初乳，其iga的含量相当高。在人体中，iga的结构主要以单体和双体的形态存在。依照iga在身体体内的分布，又可以分成血清型和分泌型。血清型iga为单体，免疫作用比较弱。分泌型iga有双体和三体，是机体黏膜防御系统的主要成分，广泛分布于乳汁、唾液以及胃肠道、呼吸道、泌尿生殖道黏膜分泌液中。
54.术语“igd”，免疫球蛋白d(igd)在血清中含量很低，约占总ig的1％，且含量个体差异较大，可作为膜受体存在于b细胞表面。
55.术语“ige”，ige是介导ⅰ型变态反应的抗体，因此检测血清总ige和特异性ige对ⅰ型变态反应的诊断和过敏原的确定很有价值。
56.术语“igg”，免疫球蛋白g(igg)是在脾脏和淋巴结中合成，在人体血清中的含量最高(占ig量的75％)，主要分布在血清和组织液中，是抗细菌、抗毒素和抗病毒抗体的主要组成部分，也是机体抗感染免疫的过程中的重要物质基础
57.术语“igm”，免疫球蛋白m(igm)是分子量最大的免疫球蛋白，主要由脾脏和淋巴结中浆细胞分泌合成，分为igml和igm2两个亚型。主要分布于血清中，以五聚体的形式存在，占血清总ig的5％～10％。igm具有强大的杀菌、激活补体、免疫调理和凝集作用，也参与某些自身免疫病及超敏反应的病理过程。
58.术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即组成该群体的抗体个体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。因此，修饰语“单克隆”是指该抗体的性质不是离散抗体的混合物。优选地，所述单克隆抗体包括单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、犬、猫、水貂源化抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。抗体为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子，因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、犬源化抗体以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如igg，ige，igm，igd和iga)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如fab、scfv、fv、dab、fd；和双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在ep.a.0120694和ep.a.0125023中描述。抗体可以通过许多方式修饰，可用dna重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(cdrs)的dna引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区，参见ep.a.184187、gb2188638a或ep.a.239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。用于本发明的“单克隆抗体”也可用杂交瘤方法制得，因为编码本发明鼠源化抗体的dna序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成核苷酸序列或用pcr法扩增得到，因而也可用重组dna方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。最后，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。抗体包含通过二硫桥连接在一起的多肽链几何体，称为轻链和重链的两条多肽主链构成抗体的所有主要结构类别(同型物)。重链和轻链都进一步可分为称作可变区和恒定区的一些亚区。重链包括单个的可变区和三个不同的恒定区，轻链则包括单个可变区(不同于重链的可变区)和单个恒定区(不同于重链的恒定区)。重链和轻链的可变区负责抗体的结合特异性。
59.术语“重链可变区”是指一种多肽，其长度为110至125个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从重链n末端氨基酸开始的重链氨基酸顺序。同样，术语“轻链可变区”是指一种多肽，其长度为95至115个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从轻链n末端氨基酸开始的轻链氨基酸顺序。本领域普通技术人员显然知晓，在本发明所具体公开的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列基础上，可以通过常规基因工程和蛋白质工程方法进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得保守性变异体，而仍能够保持与猫泛白细胞减少症病毒特异性结合。本发明中的单克隆抗体还包括其活性片段或保守性变异体。
60.术语“保守性变异体”是指基本上保留了其母本的特性，如基本的免疫学生物特性、结构特性、调节特性或生化特性的变异体。一般地，多肽的保守性变异体的氨基酸序列不同于母本多肽，但是差异是有限的，以使与母本多肽之序列与保守性变异体总体上非常相似，并且在许多区域是相同的。保守性变异体和母本多肽氨基酸序列上的差异可以是例如：一个或多个氨基酸残基及其任意组合的替换、添加和删除。替换或插入的氨基酸残基可由遗传密码编码，也可不由遗传密码编码。多肽的保守性变异体可以自然产生，或者它可以是非自然产生的变异体。多肽的非自然产生的保守性变异体可通过诱变技术或直接合成而
产生。
61.术语“有效量”当理解为“检测有效量”时，是指能够以高灵敏度检测出阳性样本，并可区分出阴性样本的量。
62.术语“质控线”、“对照线”可互换使用，是指用于检测抗原抗体反应的条件是否适宜，同时用于监测反应背景能否干扰影响检测结果。
63.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
64.本发明实例中所用的磷酸盐缓冲液为pbs缓冲液(ph7.4)，其1l体积配方为：nacl 8.0g、kcl 0.2g、na2hpo4·
12h2o 2.9g、kh2po
4 0.24g，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
65.本发明中所用的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。
66.为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
67.实施例1猫泛白细胞减少症病毒的分离及鉴定
68.分别收集来自河南多家宠物医院疑似猫泛白细胞减少症病毒感染致死猫的肠内容物样品，经pcr检测为猫泛白细胞减少症病毒感染致死猫50份。将收集到的肠内容物样品用pbs稀释10倍后，10000转/分钟离心10分钟，取上清用0.22μm滤器过滤后接种于f81细胞，逐日观察细胞病变，待出现细胞病变将培养物置-20℃反复冻融后接种于f81细胞，按同样的方法盲传，直到产生细胞病变后收毒。结果显示，47份样品接种后产生的细胞病变不明显或病变在传代过程中丢失，仅有3份样品接种后可产生明显的细胞病变，设计引物并用分子生物学方法扩增收获的3个分离株病毒液vp2基因并测序，并与genbank已公布的猫泛白细胞减少症病毒毒株序列进行比对，确定均为猫泛白细胞减少症病毒，将3株病毒编号为1#、2#、3#。
69.实施例2猫泛白细胞减少症病毒单克隆抗体的制备、纯化及鉴定
70.2.1猫泛白细胞减少症病毒单克隆抗体的制备和纯化
71.将实施例1分离的3株fpv作为免疫原，与弗氏佐剂乳化，按200μl/只免疫小鼠，4只/组，二免、三免后采血测定小鼠血清的hi效价。其中，hi效价测定：用猪红细胞按《中国兽药典》进行红细胞凝集试验即ha试验，根据结果制备8单位抗原(抗原用毒株为2#，fpv 1009株)，再对待检样品进行红细胞凝集抑制试验即hi效价测定，按《中国兽药典》进行。结果(见表1)：fpv 1#二免、三免后hi效价上升较慢且较低，放弃细胞融合；2#二免、三免后hi效价上升较快且三免后hi效价较高，挑取最高hi效价的小鼠进行细胞融合，获得阳性杂交瘤细胞并根据hi效价、细胞状态优选出5株阳性杂交瘤细胞(编号为a、b、c、d、e)；3#二免、三免后hi效价上升略高，挑取最高hi效价的小鼠进行细胞融合，获得阳性杂交瘤细胞并根据hi效价、细胞状态优选出2株阳性杂交瘤细胞(编号为f、g)。将2#毒株命名为猫泛白细胞减少症病毒1009株。
72.表1 fpv抗原免疫后小鼠血清的hi效价及细胞融合情况汇总
[0073][0074]
取筛选出的7株杂交瘤细胞的上清进行hi效价、ifa效价测定。其中，ifa效价测定方法：将f81细胞用含8％胎牛血清的1640培养基稀释至2
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105个细胞/ml，按100μl/孔接种至96孔细胞板；再将猫泛白细胞减少症病毒1009株按2％比例、100μl/孔接种至96孔细胞板，置于37℃、5％co2培养箱培养68～72小时。弃培养液，用pb缓冲液(0.01mol/l，ph值7.4)洗2次，250μl/孔，3分钟/次。弃pb缓冲液(0.01mol/l，ph值7.4)，用80％冷丙酮固定，50μl/孔，2～8℃作用30分钟。弃丙酮，用pb缓冲液(0.01mol/l，ph值7.4)洗3次，250μl/孔，3分钟/次。弃pb缓冲液(0.01mol/l，ph值7.4)，晾干，即为ifa抗原板，-20℃保存备用。将ifa抗原板用用pb缓冲液(0.01mol/l，ph值7.4)洗涤1次后，将待检样品分别加至各孔中，100μl/孔，同时设置阳性对照，37℃孵育1小时。用pb缓冲液(0.01mol/l，ph值7.4)洗涤3次，3分钟/次。每孔加入1∶400稀释的fitc标记兔抗鼠抗体，100μl/孔，37℃作用40分钟。弃孔中液体，用pb缓冲液(0.01mol/l，ph值7.4)洗涤3次后每孔加入50μl pb缓冲液(0.01mol/l，ph值7.4)，于倒置荧光显微镜下进行观察。结果判定：正常对照细胞孔无特异性荧光、阳性对照孔中细胞出现黄绿色荧光时试验成立，样品孔对应的稀释倍数若观察到黄绿色荧光判为阳性，否则为阴性，则该稀释倍数的倒数为ifa效价。结果(见表2)：杂交瘤细胞g的hi、ifa效价均较低，舍弃；杂交瘤细胞a、b、c、d、e、f的hi、ifa效价相对较高，均经细胞复苏后注射小鼠体内制备腹水。
[0075]
表2 7株单克隆抗体细胞上清及腹水纯化测定结果汇总
[0076][0077]
用protein g亲和层析法纯化单克隆抗体5株单克隆抗体的腹水，用sds-page凝胶电泳进行鉴定，结果：单克隆抗体a产量较低，舍弃；单克隆抗体b、c、d、e、f结果较为理想，用于后续评价。
[0078]
2.2试纸条用单克隆抗体配对试验研究
[0079]
用实施里1中的fpv2#(10
5.5
tcid
50
/ml)病毒液及其稀释液、pcr检测为阳性的10份猫源粪便样品及阴性的10份猫源粪便样品、pbs缓冲液，按实施例2制备试纸条，对单克隆抗体配对试验进行研究，结果(见表3)：仅单克隆抗体d作为金标抗体、c作为固定抗体配对制备的试纸条检测灵敏度最高，检测临床样品、pbs缓冲液结果最为准确，且单克隆抗体c、d的
腹水产量及纯化后的评价结果显示蛋白含量、纯度、hi效价、ifa效价均较理想，后续试验以此单克隆抗体配对制备试纸条进行检测。
[0080]
表3 抗体配对检测结果汇总
[0081][0082][0083]
将单克隆抗体c、d分别命名为单克隆抗体3c3、4a1。
[0084]
2.3单克隆抗体3c3、4a1其他特性的鉴定
[0085]
亚型：用单克隆抗体亚型试剂盒对抗体的亚型进行鉴定。结果：单克隆抗体3c3、4a1的重链亚型分别为igg2b、igg2a，轻链亚型均为kappa。
[0086]
特异性：将fpv、猫杯状病毒fcv、猫疱疹病毒fhv以及培养的用f81细胞分别制备ifa抗原板进行ifa检测，用于测定单克隆抗体的特异性。结果显示：单克隆抗体3c3、4a1仅与fpv反应为阳性，与猫源其它常见病毒反应均为阴性，表明：单克隆抗体3c3、4a1均为猫泛白细胞减少症病毒的特异性单克隆抗体。
[0087]
2.4单克隆抗体识别蛋白的研究
[0088]
用dna试剂盒提取实施例1制备的fpv核酸，作为模板，根据ncbi公布的vp1、vp2蛋白基因序列设计引物，分别用pcr扩增fpv的vp1蛋白、vp2蛋白的基因序列，通过杆状病毒表达系统分别表达，将表达后的质粒转染至细胞培养，培养后80％冷丙酮固定，作为ifa抗原板，将单克隆抗体作为一抗进行间接免疫荧光ifa检测。结果：单克隆抗体3c3、4a1均只与vp2蛋白构建的质粒呈阳性反应。表明：单克隆抗体3c3、4a1均识别猫泛白细胞减少症病毒的vp2蛋白。
[0089]
2.5单克隆抗体3c3、4a1可变区序列的测定
[0090]
根据鼠源单克隆抗体的序列特征，设计重链可变区引物序列：
[0091]
p1：actagtcgacatgaagwtgtggbtraa
[0092]
p2：ccagggrccarkggataracngrtgg
[0093]
设计轻链可变区引物序列：
[0094]
p3：actagtcgacatggagwcagacacactsct
[0095]
p4：cccaagcttggatggtgggaagatcca
[0096]
收集2株单克隆抗体3c3、4a1的细胞上清，提取rna后反转录作为模板，用上述引物对其可变区序列进行扩增，将扩增产物送至苏州金维智生物科技有限公司进行测序。结果，单克隆抗体3c3的重链可变区、轻链可变区蛋白序列分别如seq id no.1、seq id no.2所示，单克隆抗体4a1的重链可变区、轻链可变区蛋白序列分别如seq id no.3、seq id no.4所示。
[0097]
实施例3试纸条的制备及应用
[0098]
3.1试纸条的制备及检测
[0099]
将0.01％氯金酸溶液加热煮沸后再加入1％柠檬酸三钠溶液，制备成胶体金，冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积，即得胶体金溶液。
[0100]
用0.1mol/l k2co3调节胶体金溶液的ph至8.0，匀速搅拌后将单克隆抗体4a1溶液(工作浓度为4～64μg/ml)加于胶体金溶液中进行标记，搅拌后逐滴加入适量的10％bsa，匀速搅拌30分钟。于2～8℃静置2小时后，4℃2000转/分钟离心30分钟，沉淀用1/10体积的含1％bsa的pbs缓冲液溶解即为金标单克隆抗体4a1，用喷涂或浸泡使金标单克隆抗体4a1包被做成金标垫2；将单克隆抗体3c3(包被浓度为0.5～2.5mg/ml)和羊抗鼠二抗(包被浓度为1～3mg/ml)喷涂在硝酸纤维素膜上分别作为检测线6和质控线7。将样品垫1、金标垫2、硝酸纤维素膜3和吸水垫4粘贴于底板5上，即为猫泛白细胞减少症病毒胶体金检测试纸条。样品处理管内含样品处理液。
[0101]
检测时，将待检样品置于样品处理管中，使样品尽可能溶解在溶液中，将含有待检样品的样品处理管盖子头部折断，滴加2～4滴混匀后的样品至试纸条加样孔中心；10分钟后在检测试纸条的检测区观察记录结果，并依据判定标准进行判定。结果判定标准：质控线显色即试验成立，则检测线显色即为阳性、不显色即为阴性；质控线未显色即试验不成立，无论检测线是否显色均判定为无效结果，需重测。
[0102]
3.2试纸条中单克隆抗体工作浓度的优化
[0103]
分别按表5中的固定抗体3c3、金标抗体4a1的浓度制备试纸条，并对fpv不同毒株(其中抗原用毒株fpv philips-roxane株来源于atcc)的病毒液及其稀释液、样品处理液、pcr检测20份临床阳性样品进行检测。选择试纸条检测灵敏度高、与pcr符合率高且检测样品处理液背景清晰的搭配模式，作为胶体金试纸条制备的优选固定抗体浓度、优选金标抗体标记浓度。结果(见表4)：固定抗体浓度为0.5～2.5mg/ml、金标抗体标记浓度4～64μg/ml时均可制备试纸条用于检测，但当固定抗体浓度为0.8～2.5mg/ml、金标抗体标记浓度为8～50μg/ml时制备的试纸条检测效果为较优(灵敏度为10
3.5
～10
4.5
tcid
50
/ml)；当固定抗体浓度为0.8～1.5mg/ml、金标抗体标记浓度为12～50μg/ml时制备的试纸条检测效果为更优(灵敏度为10
3.5
～10
4.0
tcid
50
/ml)；当固定抗体浓度为1.0mg/ml、金标抗体标记浓度为18μg/ml时，或当固定抗体浓度为1.5mg/ml、金标抗体标记浓度为12μg/ml时制备的试纸条检测效果为最优(灵敏度为10
3.5
～10
4.0
tcid
50
/ml)。
[0104]
表4 试剂条1中单克隆抗体工作浓度
[0105][0106]
3.3样品处理液的选择
[0107]
配制以下样品处理液(见表5)，取样进行性状检验、无菌检验(按现行中国兽药典附录进行)及保存期研究，结果见表6。
[0108]
表5 样品处理液所含组分汇总及检验结果
[0109][0110]
将金标单克隆抗体4a1按12μg/ml标记、固定单克隆抗体3c3按1.0mg/ml包被，羊抗鼠二抗浓度为1.0mg/ml时制备试纸条，用不同样品处理液处理将fpv病毒液稀释后进行检测，处理20份临床样品(10份猫泛白细胞减少症阳性样品、10份猫泛白细胞减少症阴性样品)后进行检测，结果(见表6)显示：样品处理液为c7时制备的试剂盒，检测fpv病毒液灵敏度较高(10
3.5
tcid
50
/ml～10
4.0
tcid
50
/ml)，检测临床样品与pcr检测结果一致性较高。其他样品处理液制备的试剂盒检测灵敏度较低，且检测临床样品出现严重的假阳性、假阴性现象。
[0111]
表6 不同样品处理液制备试剂盒后的检测结果
[0112][0113]
经多次调试发现pluronic f-68在样品处理液中起到关键作用，为评价样品处理液中pluronic f-68的含量，在c7中其他成分保持不变的情况下将pluronic f-68的含量调整为0.05％、0.2％、0.4％、0.8％、1.0％、1.5％w/v以制备试剂盒并进行检测，结果，当样品处理液中所含pluronic f-68为0.05％时制备的试剂盒检测pdcov的灵敏度下降，当样品处理液中所含pluronic f-68为1.5％时制备的试剂盒检测临床样品阳性为阴性、阴性为阳性，存在严重的假阳性假阴性现象；当样品处理液中所含pluronic f-68为0.1％、0.4％、0.8％、1.0％时制备的试剂盒检测灵敏度较高，与c7相当，检测临床样品结果均正确，故而将样品处理液中pluronic f-68含量设定为0.2％～1.0％w/v。
[0114]
另从成本角度考虑用试纸条1i、样品处理液c7组装的试剂盒用于后续评价。
[0115]
3.4胶体金检测试纸条的应用
[0116]
3.4.1试纸条特性研究
[0117]
(1)敏感性
[0118]
按照实施例2.2.1中所述的检测方法，用试纸条检测fpv(10
5.5
tcid
50
/ml)病毒液及其稀释液、pcr检测为阳性的20份临床样品、pcr检测为阴性的20份临床样品，对试纸条进行检测。用韩国安捷的猫瘟病毒胶体金检测试纸条(简称安捷fpv试纸条)进行检测，结果(见表4)：试纸条检测fpv的灵敏度为10
3.5
～10
4.0
tcid
50
/ml，检测临床样品阳性符合率为95％(19/20)、阴性符合率为100％(20/20)，总符合率为98％，比市售的临床常用安捷fpv试纸条检测相应病毒液的灵敏度高约6倍，检测临床样品的符合率远高于市售产品的(阳性符合率为75％(15/20)、阴性符合率为100％(20/20)、总符合率为88％)。
[0119]
(2)特异性
[0120]
将fpv、猫杯状病毒fcv、猫疱疹病毒fhv以及样品处理液分别用试纸条进行检测。结果：试纸条仅能检测fpv，检测猫源其它常见病毒均为阴性；表明：试纸条特异性良好。
[0121]
(3)重复性
[0122]
将不同批的试纸条以及同一批的多个试纸条分别检测fpv病毒液的灵敏度，结果：灵敏度一致，且检测同一样品的显色程度一致。检测fcv、fhv及样品处理液的结果均为阴性。表明：试纸条的重复性良好。
[0123]
(4)保存期
[0124]
将2～30℃保存6、9、12、24、27个月的试纸条对fpv病毒液进行灵敏度检测，并检测fcv、fhv。结果：试纸条保存期间检测fpv病毒液的灵敏度一致，均未下降；试纸条检测fcv、fhv均为阴性。表明试纸条可保存27个月。
[0125]
3.4.2临床应用
[0126]
将全国各地fpv pcr方法检测的临床猫源临床样品120份(包括68份阳性、52份阴
性)，用试纸条分别进行检测，用商品化安捷fpv试纸条按其说明书进行检测，结果见表7，分析：安捷fpv试纸条检测粪便、肛拭子的准确度较高(与其说明书吻合)，检测其它靶标的准确度较低；而本发明制备的试纸条不仅可检测多个靶标而且检测的准确度均较高，与pcr方法相比阳性符合率达87％、总符合率达93％，远高于安捷fpv试纸条的。
[0127]
表7 临床检测结果比较
[0128][0129]
综上所述，本发明的试纸条不仅能高灵敏度地检测fpv，还可检测猫源的多个靶标，而且符合率较高、准确度较高，弥补了现有商品化产品的缺陷。总之，本发明试纸条具有快速、简便、准确的优势，便于非诊断目的的猫泛白细胞减少症病毒检测中的临床应用，特别是流行病学调查、健康体检及排查等研究。
[0130]
实施例4基因工程抗体的制备及应用
[0131]
扩增2株单克隆抗体的重链可变区(vh)基因和轻链可变区(vl)基因，移入连接肽后，连接至原核表达载体pet-32a(+)，分别构建重组质粒，转化bl21感受态细胞进行表达，获得融合蛋白。按上述方法分别用单克隆抗体3c3、4a1的可变区序列制备相对应的单链抗体1和单链抗体2，用单克隆抗体3c3重链可变区和单克隆抗体4a1的轻链可变区制备单链抗体3，用单克隆抗体4a1的重链可变区和单克隆抗体3c3的轻链可变区制备单链抗体4。按照实施例2对单链抗体1～4分别进行hi效价、ifa效价检测，结果：单链抗体1～4对fpv的hi效价≥1∶2560、ifa效价≥1∶3200，表明单链抗体1～4与fpv均具有良好的反应特性。
[0132]
以上结果显示seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3和seq id no.4可用于猫泛白细胞减少症病毒基因工程抗体的制备。
[0133]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。