一种促进耳蜗毛细胞再生的肽段Tr及其应用的制作方法

本发明属于生物学内耳研究领域，具体涉及一种促进耳蜗毛细胞再生的肽段tr及其应用。

背景技术：

听力损失是一种常见的感觉缺陷，影响了超过世界人口的6.8%。超过半数的感觉神经性耳聋是由于毛细胞和支持细胞发生基因突变造成的。而非遗传性感音神经性聋的主要诱因有噪音暴露，耳毒性药物暴露和老年性聋。感音神经性耳聋主要表现为耳蜗正常结构的损伤，尤以毛细胞的损伤为主。通常认为，毛细胞的损伤是不可逆的。

目前，对耳聋的治疗方法主要以器械辅助为主，人工耳蜗是当前恢复患者听觉功能的主要技术工具。对于严重的snhl患者，人工耳蜗可以通过不同频率的电刺激，模拟毛细胞产生的信号，传递给残余的螺旋神经元(sgns)。目前临床上对于遗传性耳聋的治疗除了佩戴助听器和人工耳蜗植入尚无其他有效手段。人工耳蜗产生的信号与正常耳蜗毛细胞产生的信号有很大的不同，需要长期的康复治疗才能最大限度地从植入物中获益。并且，多达50%的人工耳蜗植入者在人工耳蜗植入后会出现渐进性听力损失(即毛细胞功能丧失)。这可能发生在植入后不久，作为外科创伤的结果。此外，许多病人不愿意接受植入物，因为人工耳蜗植入将信号接收器装置永久地留在头部表面。因此，听觉功能恢复的生物治疗方法需求很大。我们希望从内耳中直接恢复毛细胞的数量和功能达到恢复听觉的效果。

以干细胞为核心的再生医学为我们提供了一个充满希望的解决方案。研究发现，内耳中lgr5阳性支持细胞是内耳干细胞，调控内耳干细胞中的一些信号通路，如wnt、aoth1等后能够提高其再生毛细胞的能力。现有技术虽然可以使部分支持细胞再生为毛细胞，但效果并不理想，主要表现在再生毛细胞的稳定性和功能性与正常毛细胞相比有一定的差异。参与毛细胞再生的分子机制也不是很清楚，我们无法从基因水平精确干预产生功能性新生毛细胞。内耳毛细胞的再生过程极其复杂，可能是多基因多信号通路相互作用的结果，未知性强，探究深度较高，需要较长的时间去探究这一复杂过程。

技术实现要素：

针对哺乳动物听觉系统中毛细胞再生的问题，本发明提供了一种促进耳蜗毛细胞再生的肽段tr及其应用，该项应用从根本上解决听觉系统的基础问题，使得听力受损的动物达到恢复听力的效果，从而代替人工耳蜗实现真正意义上听觉功能的恢复。

一种肽段tr，所述肽段tr具有促进耳蜗毛细胞再生的活性，且所述肽段tr的氨基酸序列如seqidno：1所示。

seqidno：1：

psqrqwvssatsandsfeirpsskpdmetipigdlqaralanlrvnsrnsfvlipkrkapgnyplagrqfeepkgevgwasqsqglgsqlvstvdgapaleksplaaemqwavrkgacprpaisdtdkcvrwqrpaspppflpataeaepaeglgvpglakngqepvrpglpvtfidevdseeeaf

一组分离的核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1所述的肽段tr，核酸序列如seqidno：2所示。

seqidno：2：

ccaggcttcccacccgctgtgccgcccgctgcgggcatccgcgctgccgaggtagtagtgtacgaggcgccacagcccggccgtgtcagccgcctgctggaaaagttcgactcgcctgctgcgccctgccgccgcgggagcccagagcgcttccgccctgcgctcccgcagcttcccgtggcgtctgcatctgctgccacgcgcactcctaccaatcggtcgttggctcctgcctcaccggtgcgcctcagccagcccgcaccccctatttcgcctgtccccgttgcccagcgcgcgggtcagcgctctgcctgttgcgagcccgcgcaccccgacggcactgccggccccggggcccggcgcagcgactttttacagaagaccggcagcaactctttcactgttcacccccggggcctgccccgcagtgcggtcaatcgctcgctttctaatggacccatgactcaggaatcccctaccggccctgccaatgggttgtcaggctctccgcctgtaccgggaaagtggaagccaaaggtggagtcaaaggaaccctctctccacccgcccccaagccctgggactccaagtgccacttcagttgggccccctgccttcccagcgcccagcccagccagtgccactccc

一种重组质粒，所述重组质粒整合编码上述肽段tr的核苷酸序列。

一种重组载体，转化上述重组质粒，所述重组质粒整合编码上述肽段tr的核苷酸序列。

上述肽段tr在制备治疗感音神经性聋的相关产品上的应用。

作为改进的是，所述产品为药品。

有益效果：

与现有技术相比，本发明一种促进耳蜗毛细胞再生的肽段tr及其应用，具有如下优势：

本发明通过复制肽段tr，并构建anc80l65-tr病毒，将anc80l65-tr病毒注射进入p2幼鼠的内耳一个月后，小鼠的内毛细胞附近出现了新生毛细胞，且sem数据表明，这些新生的毛细胞表现出一定的内毛细胞的形态特征。新生毛细胞表面有成束的静纤毛，部分细胞表面的静纤毛呈现阶梯状排列，肽段tr具有促进毛细胞再生的功能。这一发现为感音神经性聋找到新的治疗方向，为替代人工耳蜗实现真正意义上听觉功能的恢复，因此，具有巨大的临床应用价值。

另外，源于非致病的野生型aav的重组腺相关病毒载体具有低致病性，安全性高，免疫原性弱，物理性质稳定，并且在宿主内能稳定表达等优点，在基因治疗研发中有很大的应用前景。

附图说明

图1为tr肽段促进内耳干细胞向毛细胞转分化的示意图；

图2为anc80-tr-ha感染耳蜗组织后的ha和phalloidin免疫荧光染色结果示意图；

图3为anc80-tr-ha感染耳蜗组织后的扫描电镜示意图及其对照。

具体实施方式

材料与来源：

幼鼠：南京大学模式动物研究所；aav载体：南京金斯瑞公司合成构建；驴血清：上海翊圣生物科技有限公司；

各个抗体与染色时的稀释比：

一抗：myosin7a(myo7a,#25-6790proteusbiosciences,1:1000)，ha(ha,#11867423001,roche,1:200)；

二抗：二抗标记物anti-rat的携带不alexa555荧光分子的二抗，来源于thermofisher公司；

肌动蛋白染色试剂：携带alexa488的肌动蛋白染料phalloidin；

细胞培养试剂：dmem(hyclone公司)，胎牛血清(lensa公司)，双抗(thermofisher公司)；

细胞与组织培养耗材：包括各类培养皿、离心管、移液管，一次性滤器等常用耗材，购于corning公司。

实施例1构造包含肽段的aav包装质粒paav-cag-tr-egfp-wpre-sv40

aav的包装需要三个质粒：含有目的基因的基因组质粒、rep-cap质粒和helper质

粒。因此需要首先将tr肽段克隆进目的基因质粒中。

步骤1，首先通过聚合酶链式反应（pcr）扩增tr序列对应的cdna序列。模板来自小鼠耳蜗cdna，

引物设计如下：

上游引物如seqidno：3所示：

5’---ttggcaaagaattggatcgaattcgccaccatgccaggcttcccacccgctgt---3’；

下游引物如seqidno：4所示：

5’---aggaacatcgtatgggtaggatccgggagtggcactggctgggct---3’；

其中，加粗字体为酶切位点，画直线序列为载体的同源臂，虚线序列为真正与cdna模板结合的trpcr引物序列；设计tr序列两端带有与线性载体质粒相同的酶切位点。

pcr反应使用vazyme公司的phanta®maxsuper-fidelitydnapolymerase试剂盒（#p505），包含除引物和模板外的所有所需试剂。pcr体系和程序按照试剂盒说明书进行使用；整个pcr反应体系设置为30μl；引物由南京金斯瑞公司(www.genscript.com.cn)合成。

步骤2，使用限制性内切酶（thermofisher公司）将载体质粒线性化，线性化质粒的两端携带ecor1和bamh1酶切位点。

步骤3，将pcr产物和线性质粒进行琼脂糖凝胶电泳，并进行割胶回收，dna回收使用胶回收试剂盒(axygen:ap-gx-250g)，回收后的片段经过nanodrop2000检测浓度。

步骤4，将回收的pcr产物和线性质粒载体进行重组连接(novoprotein:nr001a)，得到环状的质粒dna。连接体系如下：重组连接buffer2μl，线性骨架载体30ng，tr肽段的dna片段20ng，重组连接酶0.5μl，ddh2o补齐到10μl，50℃反应20分钟。

步骤5，重组产物进行转化

转化步骤如下：取100μl感受stbl3感受态细胞(transgen:cd201)在冰上解冻；10μl的步骤4连接产物与感受态细胞轻轻混合，冰上放置30分钟；42℃热激60秒；冰上放置2分钟，加入900μl复苏无抗lb培养基(mdbio:l001-1kg)，摇床45分钟；离心（4000g，2min）后弃去900ul上清，利用剩余上清重悬菌体后涂氨苄平板(50μg/ml)，放入37℃培养箱，培养14-16个小时。

步骤6，第二天挑选板子上的单克隆菌落，在4ml氨苄抗性的lb培养基中扩大培养并按照试剂盒说明书进行质粒小量抽提(axygene:apmn-p-250g)。获得质粒经过浓度检测，取10μl送测序，阳性质粒为paav-cag-tr-egfp-wpre-sv40，然后保存在-20℃中备用。

实施例2在hek293细胞中进行anc80l65-tr病毒的包装

步骤1，hek293t细胞传代

10cm培养皿(90%-100%confluency)在晚上传代至15cm培养皿中,24h后进行25kdpei（1mg/ml，polyscience，#23996）转染。培养基成分为dmemhighglucose（biologicalindustries，#01-052-1acs）+10%fbs（biologicalindustries，#04-007-1a）+1%p/s（penicillin-streptomycin,thermofisher,#15140122）

步骤2，pei转染

pei或质粒dna分别与dme混合后（vortex，3000rpm，5s），室温放置5min，然后将pei悬空逐滴加入dna中，轻柔混匀，室温放置20-25min；

步骤3，将pei/dna复合物逐滴加入15cm培养皿中，避免培液剧烈晃动；

步骤4，12-16h后吸去培液，然后使用预热pbs洗涤一遍，更换预热1%fbs的培养基继续培养72-96h，最后收集上清和细胞。

实施例3使用梯度碘克沙醇超速离心方法纯化anc80l65-tr-egfp

步骤1，裂解细胞，释放aav

收集上清和细胞后，利用循环冷热交替方法裂解细胞，将细胞交替放置于干冰预冷的乙醇和37℃水浴三次，然后进行4℃离心，1167g，15min；

步骤2，去除基因组和质粒dna

将上清转移至50ml离心管，加入dnase和rnase至终浓度分别为10u/ml和10mg/ml，37℃孵育30min；

步骤3，在4℃，13490rpm的速度下离心20min；

步骤4，过滤

使用无菌50ml注射器和0.22um滤膜过滤上一步离心所得的上清液；

步骤5，准备梯度碘克醇

15%（v/v）碘克沙醇8ml，25%（v/v）碘克沙醇5.5ml，40%（v/v）碘克沙醇5ml和60%（v/v）碘克沙醇4.5ml；本步中，碘克沙醇对眼睛、皮肤和呼吸道有刺激，需要做好个人防护并在通风橱中进行；

步骤6，将步骤4获得的上清小心滴在15%碘克沙醇表面；

步骤7，超速离心

使用固定角度钛转子，以301580g的速度在12℃下离心1h40min，离心加速和减速过程使用最大加、减速度；

步骤8，aav获得

40%和60%碘克沙醇界面之间即为纯化的aav病毒，小心地使用不锈钢钝针插入吸取；

步骤9，aav滴度测定

使用qpcr法测定aav的滴度，含量以gc/ml表示，gc为gonomicparticleconcentration，验证提纯病毒滴度在10e+12gc/ml以上即可。qpcr的引物设计在wpre元件中。

引物序列为：

上游引物如seqidno：5所示：5’-gtcaggcaacgtggcgtggtgtg-3’;

下游引物如seqidno：6所示：5’-ggcgatgagttccgccgtggc-3’。

实施例4通过圆窗注射的方法，将anc80l65-tr注射进入幼鼠（p2-p3）蜗管中

新生小鼠采用低温诱导麻醉的方法进行麻醉。p2（出生后2天）小鼠置于冰浴中2-3min，取出在冰垫上进行后续手术过程。手术仅在每只小鼠的左耳进行，右耳为阴性对照。手术时，在左耳耳后切口暴露圆窗。手术时注意避免损伤面神经。然后，使用微量进样系统（nanoliter2000，wpi）将anc80l65-tr通过毛细玻璃电极（直径10mm）从圆窗注射进入耳蜗中。幼鼠耳蜗可容纳2μl的anc80l65-tr病毒溶液，注射病毒体积为1-2μl。手术后粘合伤口并涂抹止痛药和消炎药剂，放置在37℃热板上使乳鼠苏醒。

实施例5观察感染后的小鼠毛细胞的变化

在小鼠p30时，对感染了anc80l65-tr病毒的耳蜗进行免疫荧光成像和sem成像，观察耳蜗听觉毛细胞的再生情况。

利用耳蜗圆窗注射技术，将携带tr基因的1.5μlanc80l65-tr病毒(病毒滴度为4e+12gc/ml)注射入蜗管骨阶的外淋巴液中，具体方法参照上述步骤四。所用的小鼠为出生2天后的c57bl/6品系乳鼠。注射22天后，将已感染病毒的耳蜗剥离出来进行免疫染色鉴定。耳蜗样品在4％（v/v）pfa中进行固定处理,然后使用含有10％（v/v）的驴血清和0.5％（v/v）tritonx-100的1xpbs中，室温下孵育2小时后,加入ha的抗体以及相应的二级抗体。在进行二级抗体染色的同时，加入标记肌动蛋白的染料phalloidin-488来代表毛细胞表面的静现毛结构。耳蜗染色样品采用抗荧光淬火剂作为介质封片,随后采用共聚焦进行观察。

结果如图2所示,左图表示的是ha的免疫染色，代表了tr肽段的信号。右图表示的是肌动蛋白丝的免疫染色。白色虚线上边的细胞表示正常的原位内毛细胞（innerhaircells,ihcs），白色虚线下边的细胞代表的是异位再生的毛细胞(newhaircells,newhcs),标尺代表的实际距离为5μm。

同时，将利用同样方法注射1.5μlanc80l65-tr病毒(病毒滴度为4e+12gc/ml)，28天后，感染病毒的耳蜗剥离出来进行扫描电镜实验鉴定。耳蜗样品在2.5％（v/v）新鲜戊二醛中进行固定处理,然后使用1％（v/v）的锇酸溶液对样品进行后固定，以保留完全的样品表面面貌。然后经过梯度乙醇进行脱水处理。梯度乙醇的使用体积浓度依次分别为30%、50%、70%、80%、90%、100%、100%、100%，每次处理放置在4℃条件下反应10min后进行下一个乙醇浓度。梯度乙醇处理后进行临界点干燥1小时10分钟，并向样品表面喷镀金属pt，厚度约为10nm。最后将样品黏附在导电铜胶上在10kv电压条件下进行环境扫描电镜成像。

结果如图3所示，扫描电镜成像清晰反映耳蜗表面的形态和静现毛形态。本次实验共设置三组，空白对照组（ctrl）,tc肽段注射组（tc肽段与tr肽段来自同一个基因的不同位置序列）和tr肽段注射组。白色虚线上边的细胞表示正常的原位内毛细胞，白色虚线下边的细胞代表的是异位再生的毛细胞。↑代表再生的异位毛细胞，★指向的异位再生毛细胞表面拥有高低排列的静纤毛结构。结果表明tr肽段能够明显促进内毛细胞附近的内耳干细胞再生新的毛细胞，且新出生的毛细胞拥有静纤毛结构。标尺代表的实际距离为5μm。

tc肽段的dna序列如seqidno：7所示：

agtcagcgccagtgggtctcctctgccaccagcgccaatgattcctttgaaataaggccatcctccaagccagacatggaaactatcccaatcggggaccttcaggccagggccctggccaacctccgagtgaactcccgcaactccttcgtgttgatccccaagcgcaaagcccctgggaactatcctttggcggggaggcaatttgaggagccaaagggggaggtgggctgggcctctcagagccaggggctcggatcccagctggtgtctacagtggatggtgcacctgccctagagaagagtcccttggctgctgagatgcagtgggcagttaggaagggggcctgccccaggccagcaatttctgacacagacaagtgtgttaggtggcagagaccagcctcgccacctccatttctaccagccacagctgaagctgagccggctgaaggcttgggggttcctggcttggccaagaatggccaggagcctgtgaggccaggacttccagtcaccttcattgatgaagtagactcagaggaggaggcc

氨基酸序列如seqidno：8所示：

sqrqwvssatsandsfeirpsskpdmetipigdlqaralanlrvnsrnsfvlipkrkapgnyplagrqfeepkgevgwasqsqglgsqlvstvdgapaleksplaaemqwavrkgacprpaisdtdkcvrwqrpaspppflpataeaepaeglgvpglakngqepvrpglpvtfidevdseeea

上述实验表明，外源tr肽段能够显著促进内耳干细胞向毛细胞的分化，分化形成的新生毛细胞具有高低排列的静纤毛样结构。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110>东南大学

<120>一种促进耳蜗毛细胞再生的肽段tr及其应用

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>186

<212>prt

<213>氨基酸(aminoacid)

<400>1

proserglnargglntrpvalserseralathrseralaasnaspser

151015

phegluileargproserserlysproaspmetgluthrileproile

202530

glyaspleuglnalaargalaleualaasnleuargvalasnserarg

354045

asnserphevalleuileprolysarglysalaproglyasntyrpro

505560

leualaglyargglnpheglugluprolysglygluvalglytrpala

65707580

serglnserglnglyleuglyserglnleuvalserthrvalaspgly

859095

alaproalaleuglulysserproleualaalaglumetglntrpala

100105110

valarglysglyalacysproargproalaileseraspthrasplys

115120125

cysvalargtrpglnargproalaserpropropropheleuproala

130135140

thralaglualagluproalagluglyleuglyvalproglyleuala

145150155160

lysasnglyglngluprovalargproglyleuprovalthrpheile

165170175

aspgluvalaspserglugluglualaphe

180185

<210>3

<211>648

<212>dna

<213>基因(gene)

<400>3

ccaggcttcccacccgctgtgccgcccgctgcgggcatccgcgctgccgaggtagtagtg60

tacgaggcgccacagcccggccgtgtcagccgcctgctggaaaagttcgactcgcctgct120

gcgccctgccgccgcgggagcccagagcgcttccgccctgcgctcccgcagcttcccgtg180

gcgtctgcatctgctgccacgcgcactcctaccaatcggtcgttggctcctgcctcaccg240

gtgcgcctcagccagcccgcaccccctatttcgcctgtccccgttgcccagcgcgcgggt300

cagcgctctgcctgttgcgagcccgcgcaccccgacggcactgccggccccggggcccgg360

cgcagcgactttttacagaagaccggcagcaactctttcactgttcacccccggggcctg420

ccccgcagtgcggtcaatcgctcgctttctaatggacccatgactcaggaatcccctacc480

ggccctgccaatgggttgtcaggctctccgcctgtaccgggaaagtggaagccaaaggtg540

gagtcaaaggaaccctctctccacccgcccccaagccctgggactccaagtgccacttca600

gttgggccccctgccttcccagcgcccagcccagccagtgccactccc648

<210>3

<211>53

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ttggcaaagaattggatcgaattcgccaccatgccaggcttcccacccgctgt53

<210>4

<211>45

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

aggaacatcgtatgggtaggatccgggagtggcactggctgggct45

<210>5

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

gtcaggcaacgtggcgtggtgtg23

<210>6

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

ggcgatgagttccgccgtggc21

<210>7

<211>552

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

agtcagcgccagtgggtctcctctgccaccagcgccaatgattcctttgaaataaggcca60

tcctccaagccagacatggaaactatcccaatcggggaccttcaggccagggccctggcc120

aacctccgagtgaactcccgcaactccttcgtgttgatccccaagcgcaaagcccctggg180

aactatcctttggcggggaggcaatttgaggagccaaagggggaggtgggctgggcctct240

cagagccaggggctcggatcccagctggtgtctacagtggatggtgcacctgccctagag300

aagagtcccttggctgctgagatgcagtgggcagttaggaagggggcctgccccaggcca360

gcaatttctgacacagacaagtgtgttaggtggcagagaccagcctcgccacctccattt420

ctaccagccacagctgaagctgagccggctgaaggcttgggggttcctggcttggccaag480

aatggccaggagcctgtgaggccaggacttccagtcaccttcattgatgaagtagactca540

gaggaggaggcc552

<210>8

<211>184

<212>prt

<213>氨基酸(aminoacid)

<400>8

serglnargglntrpvalserseralathrseralaasnaspserphe

151015

gluileargproserserlysproaspmetgluthrileproilegly

202530

aspleuglnalaargalaleualaasnleuargvalasnserargasn

354045

serphevalleuileprolysarglysalaproglyasntyrproleu

505560

alaglyargglnpheglugluprolysglygluvalglytrpalaser

65707580

glnserglnglyleuglyserglnleuvalserthrvalaspglyala

859095

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100105110

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115120125

valargtrpglnargproalaserpropropropheleuproalathr

130135140

alaglualagluproalagluglyleuglyvalproglyleualalys

145150155160

asnglyglngluprovalargproglyleuprovalthrpheileasp

165170175

gluvalaspsergluglugluala

180