一种用于鉴定草鱼出血热病毒的引物及探针以及检测方法与流程

本发明涉及病毒检测领域，具体涉及一种用于鉴定草鱼出血热病毒的引物及探针以及检测方法。

背景技术：

草鱼出血热病毒属于呼肠弧病毒科，感染病鱼的各个器官组织呈现不同程度的充血式出血。目前这类病毒最有效可靠的检测方法是荧光pcr，文献没有查阅到该病毒相关的检测研究，市面上草鱼出血热病毒供应商有上海康朗生物科技有限公司、上海烜雅生物科技有限公司等。本发明旨在研发一种快速灵敏检测草鱼出血热病毒的方法，帮助水产养殖早期发现病毒，及时处理减少损失。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提出一种能有效评估草鱼出血热病毒的检测方法，从草鱼出血热病毒基因序列中找到一段特征序列，针对该序列设计一组灵敏结合目的片段扩增的上下游引物，探针上标记了高荧光强度的fam发光基团，提高检测灵敏度。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种用于鉴定草鱼出血热病毒的引物，其特征在于，包括有：

上游引物：5′-cttccgctattccgtctc-3′

下游引物：5′-ctccatcatcgtgctgtt-3′

进一步改进在于：所述引物对应的特征序列如seqidno.1。

进一步改进在于：所述引物对应的seqidno.1特征序列的探针的核苷酸序列为：

5′-famctctttccccacgtccacttttccbhq1-3′

进一步改进在于：所述述探针带有标记物。

进一步改进在于：所述标记物为高荧光强度的fam发光基团。

一种用于鉴定草鱼出血热病毒的检测方法，其特征在于，包括以下检测方法：

步骤一：用移液枪取200μl待测样品，并加入到1.5ml离心管中；

步骤二：在离心管中加入500μl裂解液，震荡混匀，室温静置；

步骤三：将离心管中的溶液全部转移至吸附柱中并盖上管盖，然后摒弃废液，将吸附柱放回收集管中；

步骤四：打开吸附柱盖子，加入600μl洗涤液，并盖上管盖，保持12000转离心30s,然后摒弃废液，将吸附柱放回收集管；

步骤五：继续重复步骤4，打开吸附柱盖子，加入600μl洗涤液，并盖上管盖，保持12000转离心30s,然后摒弃废液，将吸附柱放回收集管；

步骤六：将吸附柱放回收集管中，并保持12000转离心2min，以去除残留液体；

步骤七：将吸附柱放入一个新的1.5ml离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl洗脱液，室温静置1min，并保持12000转离心30s，最后得到rna/dna核酸模板；

步骤八：取四个pcr管，依次分别加入5μl酶液、18μl反应液、2μl阴性参照/阳性参照/提取样本；

步骤九：加完样后振荡混匀，并在500g离心机中离心30s，并最后得出检测结果。

进一步改进在于，步骤二中，在离心管中加入500μl裂解液，震荡混匀后，用户根据条件选择室温静置5-10分钟或者在60℃热浴中静置5-10分钟。

进一步改进在于，在步骤三中，将离心管中的溶液全部转移至吸附柱中并盖上管盖，保持12000转离心30s；如果离心管中的溶液存在絮状或颗粒状沉淀则保持8000转离心2min，然后取上清液转移至吸附柱中，以防止堵塞滤膜。

进一步改进在于，在步骤七中，50μl洗脱液滴加在吸附柱的滤膜上。

与现有技术相比，本发明具有以下优点。

本发明从草鱼出血热病毒基因序列中找到一段特征序列，针对该序列设计一组灵敏结合目的片段扩增的上下游引物，探针上标记了高荧光强度的fam发光基团，提高检测灵敏度。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明pcr扩增结果表。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

实施例一

本发明实施方式公开了一种用于鉴定草鱼出血热病毒的引物，其特征在于，包括有：

上游引物：5′-cttccgctattccgtctc-3′

下游引物：5′-ctccatcatcgtgctgtt-3′

所述引物对应的特征序列如seqidno.1。

所述引物对应的seqidno.1特征序列的探针的核苷酸序列为：

5′-famctctttccccacgtccacttttccbhq1-3′

所述述探针带有标记物。

所述标记物为高荧光强度的fam发光基团。

实施例二

如图1所示，一种用于鉴定草鱼出血热病毒的检测方法，其特征在于，包括以下检测方法：

步骤一：用移液枪取200μl待测样品，并加入到1.5ml离心管中；

步骤二：在离心管中加入500μl裂解液，震荡混匀，室温静置；

步骤三：将离心管中的溶液全部转移至吸附柱中并盖上管盖，然后摒弃废液，将吸附柱放回收集管中；

步骤四：打开吸附柱盖子，加入600μl洗涤液，并盖上管盖，保持12000转离心30s,然后摒弃废液，将吸附柱放回收集管；

步骤五：继续重复步骤4，打开吸附柱盖子，加入600μl洗涤液，并盖上管盖，保持12000转离心30s,然后摒弃废液，将吸附柱放回收集管；

步骤六：将吸附柱放回收集管中，并保持12000转离心2min，以去除残留液体；

步骤七：将吸附柱放入一个新的1.5ml离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl洗脱液，室温静置1min，并保持12000转离心30s，最后得到rna/dna核酸模板；

步骤八：取四个pcr管，依次分别加入5μl酶液、18μl反应液、2μl阴性参照/阳性参照/提取样本；

步骤九：加完样后振荡混匀，并在500g离心机中离心30s，并最后得出检测结果。

在步骤二中，在离心管中加入500μl裂解液，震荡混匀后，用户根据条件选择室温静置5-10分钟或者在60℃热浴中静置5-10分钟。

在步骤三中，将离心管中的溶液全部转移至吸附柱中并盖上管盖，保持12000转离心30s；如果离心管中的溶液存在絮状或颗粒状沉淀则保持8000转离心2min，然后取上清液转移至吸附柱中，以防止堵塞滤膜。

在步骤七中，50μl洗脱液滴加在吸附柱的滤膜上。

pcr扩增程序如下表所示：

实施例三

一种检测草鱼出血热病毒用的试剂盒，包含有反应液、酶液阳性样本和阴性样本，所述反应液为含有探针引物，所述酶液由50％甘油配制，所述阳性样本中含质粒，所述阴性样本主要成分是水。

其中探针引物和质粒信息如下：

每一个检测样本的加样量如下表所示：

反应程序：95℃3min→35循环(95℃10s→55℃10s→63℃10s)

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。