一种高效二联检测兔瘟和兔瘟2型的引物以及试剂盒的制作方法

一种高效二联检测兔瘟和兔瘟2型的引物以及试剂盒
[0001]
技术领域
[0002]
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种高效二联检测兔瘟和兔瘟2型的引物以及试剂盒。


背景技术：

[0003]
兔病毒性出血症(rabbit hemorrhagic disease，rhd)，俗称兔瘟，是由兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus，rhdv)引起的兔的一种急性、高度致死性传染病。rhd以呼吸系统出血，实质器官淤血、肿大、出血和肝脏坏死为主要病变特征，主要危害2月龄以上的养殖和野生的多个穴兔品种，死亡率达80%-100%。2010年在法国出现了由rhdv新种即兔出血症病毒2型(rabbit hemorrhagic disease virus 2，rhdv2)引起的能感染致死30日龄以内的兔子和传统rhdv毒株灭活苗的免疫过的兔子的新型兔病毒性出血症(new rabbit hemorrhagic disease，nrhd)，也称为兔病毒性出血症2型(rabbit hemorrhagic disease type 2，rhd2)。目前的诊断方法是rt-pcr法。采用现有的pcr技术，由于其反应要在2个不同的温度区循环，对仪器要求高，成本也相对高昂，并且pcr技术仅仅1对扩增引物，易受干扰，特异性相对不足，且出结果时间较久，操作专业要求高，微量加量步骤多。而lamp技术共有4条不同的特异性引物，故而检测结果准确度更高，但是由于是恒温反应，缺少类似pcr的热启动酶，在设备升温阶段容易产生非特异性扩增从而影响检测结果。


技术实现要素：

[0004]
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的缺陷提供一种高效二联检测兔瘟和兔瘟2型的引物及试剂盒。
[0005]
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种高效二联检测兔瘟和兔瘟2型的引物，具体为：rhdv-f3：ccggcacaaaccaaaayc；rhdv-b3：gtgcgcctgacracagac；rhdv-fip：atgtgacggcaytggcgttt-ccggactgtttgtgatggc；rhdv-bip：ttgtractacacccggcactcc-gcgaacatgatgggtgtgtt；rhdv2-f3：gcttccggcttcatggaac；rhdv2-b3：gaaaagccattggttgtgcc；rhdv2-fip：tcratgagggtggctgaagcc-ttggcttgagtgttgatgga；rhdv2-bip：agavcttgttgacatccgccc-arttgtacacragcgtrct。
[0006]
本发明还提供一种高效二联检测兔瘟和兔瘟2型的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物以及反应液，所述反应液的组成为：20 mm tris-hcl
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0.2 μl40 mm kcl
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6.8 μl100 mm （nh4）2so4ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1.8 μl80 mm mgso4ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1.8 μl1% tween-20
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1.8 μl28 mm dntps
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0.9 μl8000u/mlbst酶
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1.8 μl10000u/ml invitrogen superscript iv反转录酶 0.1 μl10mm reverse transcriptase inhibitors
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0.1 μl1 mm sybrgreen荧光染料
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0.9 μl4.0
×
10-6 mol/l 金纳米颗粒
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1.8 μl所述兔瘟引物的浓度和体积为：90 μm的rhdv-f3引物0.5 μl、90 μm的rhdv-b3引物0.5 μl、180 μm的rhdv-fip引物2 μl、180 μm的rhdv-bip引物2 μl。所述兔瘟2型引物的浓度和体积为：90 μm的rhdv2-f3引物0.5 μl、90 μm的rhdv2-b3引物0.5 μl、180 μm的rhdv2-fip引物2 μl、180 μm的rhdv2-bip引物2 μl。其中，该试剂盒选用8样本芯片，即1个加样孔对应4个检测孔，第1检测孔位包埋扩增rhdv序列的引物和第2检测孔包埋扩增rhdv2序列的引物，第3检测孔是空白，第4检测孔包埋内参引物和内参质粒，如图1，冻干。
[0007]
所述兔瘟病毒的核酸序列为ef558582，兔瘟2型病毒的核酸序列为mh341513。
[0008]
与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明以改良后的lamp技术为基因扩增反应原理，在反应体系里加入金纳米颗粒，吸附ssdna和蛋白酶，抑制升温过程中的非特异性反应，达到热启动的目的，避免在升温过程中的非特异性反应；结合改良后的lamp技术与微流控芯片技术，既可以快速、准确的检测区分兔瘟与兔瘟2型，同时，反应试剂预埋于微流控芯片上，实现一样双指标检测，又使用户操作简便。
附图说明
[0009]
图1是8样本芯片测试孔位图；图2是rhdv和rhdv2引物敏感性扩增结果图，图中：a为rhdv敏感性扩增结果，b为rhdv敏感性扩增结果。
[0010]
图3是rhdv和rhdv2引物重复性扩增图，图中：a为rhdv重复性扩增结果，b为rhdv重复性扩增结果。
[0011]
图4是rhdv和rhdv2引物特异性扩增图。
具体实施方式
[0012]
下面用具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明不仅局限于以下具体实施例。
实施例
[0013]
先通过ncbi genbank寻找目标序列，并针对目标序列设计引物，并将其分别固定在微流控芯片相应位置后对微流控芯片进行封装，与从兔肉及其各种脏器、血液、排泄物、环境样本和细胞培养物中提取的核酸模板混合反应后，加入到封装好的微流控芯片中，之后放入到带有离心功能、恒温功能及实时荧光检测的微流控芯片检测仪中，上述仪器和芯片均为市售产品，宁波爱基因科技有限公司也有相应公开产品，利用离心力驱动样品进入微流控芯片反应孔，进行恒温扩增。若样本中含有目的片段而得到恒温扩增，扩增产物与荧光物质进行有效的结合，通过荧光检测仪实时捕获荧光信号，直观的反应扩增产物的产生，根据实时荧光信号的出现时间、强度和位置，判断样本中是否含有兔瘟和兔瘟2型病毒。
[0014]
具体的操作步骤如下：1、微流控芯片检测体系中18 μl反应液的组成如下：20 mm tris-hcl
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0.2 μl40 mm kcl
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6.8 μl100 mm （nh4）2so4ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1.8 μl80 mm mgso4ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1.8 μl1% tween-20
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1.8 μl28 mm dntps
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0.9 μl8000u/ml bst酶
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1.8 μl10000u/ml invitrogen superscript iv反转录酶
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0.1 μl10mm reverse transcriptase inhibitors
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0.1 μl1 mm sybrgreen荧光染料
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0.9 μl4.0
×
10-6 mol/l 金纳米颗粒
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1.8 μl所述兔瘟引物的浓度和体积为：90 μm的rhdv-f3引物0.5 μl、90 μm的rhdv-b3引物0.5 μl、180 μm的rhdv-fip引物2 μl、180 μm的rhdv-bip引物2 μl。所述兔瘟2型引物的浓度和体积为：90 μm的rhdv2-f3引物0.5 μl、90 μm的rhdv2-b3引物0.5 μl、180 μm的rhdv2-fip引物2 μl、180 μm的rhdv2-bip引物2 μl。其中，该试剂盒选用8样本芯片，即1个加样孔对应4个检测孔，第1检测孔位包埋扩增rhdv序列的引物和第2检测孔包埋扩增rhdv2序列的引物，第3检测孔是空白，第4检测孔包埋内参引物（如图1），冻干。
[0015]
所述兔瘟病毒的核酸序列为ef558582，兔瘟2型病毒的核酸序列为mh341513。
[0016]
并取16 μl的rhdv的核酸，该核酸序列为ef558582；取16 μl的rhdv2的核酸，该核酸序列为mh341513，两核酸充分混匀，然后将反应液18 μl与rhdv和rhdv2模板核酸32 μl混合，加入到芯片的加样孔，再将加样孔用封口膜封住，上机；温度设定为63.5℃，反应时间设定为30 min。
[0017]
2、微流控芯片上机扩增：由于本方法采用的是恒温扩增，不需要经过pcr扩增的变性、退火和延伸等变温过程，整个反应过程在恒温条件下完成，扩增程序：温度设定为63.5℃，反应时间设定为30 min。运行程序：低速离心转速为1600 r/min，低速离心时间为10 sec，高速离心转速为4600 r/min，高速离心时间为30 sec。
[0018]
3、微流控芯片结果判断：
3.1微流控芯片检测仪阈值线设置阈值线一般情况设置为800(可根据实际情况进行调整，设定原则以阈值线刚好超过非典型s型扩增曲线的最高点，且ct值显示为30)，仪器配套软件自动分析结果。
[0019]
3.2质量控制内参出现扩增曲线，且ct值<30时，实验结果有效。
[0020]
3.3结果判定3.3.1实验成立条件阳性对照：ct<30，阳性对照的反应孔（1、2）和内标反应孔（4）有明显的典型s型扩增曲线。
[0021]
阴性对照：ct<30，阴性对照的反应孔（1、2）均无扩增曲线，内标反应孔（4）有明显的典型s型扩增曲线。
[0022]
3.3.2判定标准阳性：反应时间30分钟内，项目检测孔位出现明显扩增曲线，且ct值<30，判定该孔对应的检测项目为阳性。阴性：反应时间30分钟内，项目检测孔位未出现明显扩增曲线，判定该孔对应的检测项目为阴性。
[0023]
在微流控芯片检测仪上进行微流控芯片的恒温扩增，仪器会进行实时荧光检测，根据荧光检测的有效扩增曲线进行判读，任意一检测孔中有标准的s型的扩增曲线，则该孔判断为阳性，即该样本中含有对应检测孔的病毒核酸；没有扩增曲线的检测孔判断为阴性，即该样本不含有对应检测孔的病毒核酸。
[0024]
4、敏感性及检测限的验证4.1 实验材料试剂：反应液；1
×
10
6 copies/
µ
l、1
×
10
5 copies/
µ
l、1
×
10
4 copies/
µ
l、1
×
10
3 copies/
µ
l、1
×
10
2 copies/
µ
l、1
×
10
1 copies/
µ
l、1
×
10
0 copies/
µ
l的带有rhdv和rhdv2基因片段的质粒；阴性对照；阳性对照。
[0025]
仪器：恒温扩增仪；掌上离心机；移液器。
[0026]
4.2 检测体系参照上述的检测体系进行实验操作，然后把上好样的芯片放进恒温扩增仪进行试验检测，扩增结果可如图2检测限的结果看，rhdv（a）和rhdv2（b）引物的最低检测限都是1
×
10
2 copies/
µ
l的质粒，此时的ct小于30 min，说明灵敏度很高。
[0027]
5、重复性的验证5.1 实验材料试剂：反应液；rhdv和rhdv2引物1
×
10
4 copies/
µ
l的质粒；阴性对照；阳性对照。
[0028]
仪器：恒温扩增仪；掌上离心机；移液器。
[0029]
5.2 检测体系参照上述检测体系进行实验操作，然后把芯片放进恒温扩增仪进行试验检测。
[0030]
5.3 扩增结果图3是rhdv和rhdv2重复性实验扩增结果图。下图是rhdv和rhdv2的ct值的变异系数（cv，%）。
[0031]
经计算，引物rhdv的ct值的变异系数（cv，%）为2.8%，重复性好，小于5%，符合要求；引物rhdv2的ct值的变异系数（cv，%）为1.2%，重复性好，小于5%，符合要求。
[0032]
6、特异性的验证6.1 实验材料试剂：试剂：反应液；兔瘟疫苗核酸；兔瘟2型样本核酸；阴性对照。
[0033]
仪器：恒温扩增仪；掌上离心机；移液器。
[0034]
6.2 检测体系参照上述1中的检测体系进行实验操作，然后把芯片放进恒温扩增仪进行试验检测。
[0035]
6.3 扩增结果rhdv和rhdv2特异性实验扩增结果可参考图4，从rhdv的扩增结果可知，除兔瘟疫苗核酸扩增结果为阳性，兔瘟2型样本核酸和阴性对照均无扩增曲线，说明rhdv引物只能特异性地扩增检测出兔瘟疫苗核酸，特异性好，一般不会与兔瘟2型病原菌产生交叉反应。从rhdv的扩增结果可知，除兔瘟2型样本核酸扩增结果为阳性，兔瘟疫苗核酸和阴性对照均无扩增曲线，说明rhdv2引物只能特异性地扩增检测出兔瘟2型样本核酸，特异性好，一般不会与兔瘟病原菌产生交叉反应。
[0036]
以上仅是本发明的特征实施范例，对本发明保护范围不构成任何限制。凡采用同等交换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。